IL-22對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的作用*

劉 夢(mèng)， 劉 巖， 楊夢(mèng)如， 莫碧瑤， 潘云峰

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東廣州510630)

IL-22對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的作用*

劉 夢(mèng)， 劉 巖， 楊夢(mèng)如， 莫碧瑤， 潘云峰△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東廣州510630)

目的:探究白細(xì)胞介素(IL)-22對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLSs)功能的影響及機(jī)制。方法:組織塊法培養(yǎng)RA-FLSs。將不同濃度(0、1、10、100 μg/L)的重組人源性IL-22(rhIL-22)與RA-FLSs共培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的改變;利用10 μg/L的rhIL-22作用于RA-FLSs 24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變。rhIL-22和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)特異性抑制劑STA-21以不同濃度作用RA-FLSs 24 h，Western blot法檢測(cè)Bcl-2和p-STAT3蛋白水平的變化。結(jié)果:不同濃度的rhIL-22作用于RA-FLSs 24 h、48 h、72 h后，RA-FLSs細(xì)胞活力明顯增高，均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。rhIL-22刺激RA-FLSs后，S期和G2/M期細(xì)胞明顯增多，G0/G1期細(xì)胞減少。Western blot法檢測(cè)結(jié)果提示rhIL-22可上調(diào)RA-FLSs中Bcl-2、p-STAT3的蛋白水平，而STA-21單用或聯(lián)用rhIL-22均可抑制RA-FLSs中Bcl-2及p-STAT3的表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論:IL-22在RA-FLSs細(xì)胞活力和周期調(diào)節(jié)中起重要作用，且STAT3在IL-22促RA-FLSs細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，提示IL-22可能對(duì)RA-FLSs凋亡有一定的影響。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;成纖維樣滑膜細(xì)胞;白細(xì)胞介素-22;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子3;Bcl-2

白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-22是IL-10細(xì)胞因子超家族成員，與異二聚體受體結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子1/3/5(signal transducers and activators of transcription 1/3/5，STAT1/3/5)、細(xì)胞核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositide 3-kinase-Akt-mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)等信號(hào)通路，誘導(dǎo)多種基因尤其是STAT3下游的基因表達(dá)［1］。由于STAT3與腫瘤密切相關(guān)［2］，因此IL-22/IL-22R1在腫瘤領(lǐng)域受到了極大的關(guān)注。研究表明IL-22在多種癌細(xì)胞中［3-6］通過(guò)激活STAT3上調(diào)其下游抗凋亡基因(bcl-2、bcl-xL)的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，IL-22/STAT3被看作一個(gè)有效的作用靶點(diǎn)。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見(jiàn)的肌肉骨骼系統(tǒng)的炎癥性疾病，在我國(guó)的發(fā)生率約為1%，病因未明。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblastslike synoviocytes，F(xiàn)LSs)在RA疾病起始和進(jìn)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可分泌各種炎癥因子，同時(shí)也是許多炎癥因子的靶細(xì)胞，其細(xì)胞特性發(fā)生了根本性改變，稱(chēng)為“持續(xù)活化的細(xì)胞”［7］。本課題組前期研究證實(shí) Wnt/β-catenin通路、NF-κB通路、PI3K/Akt/ mTOR通路均與RA-FLSs的生物活性相關(guān)(如細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等)［8-10］，且有研究表明IL-22可激活RA-FLSs內(nèi)多條信號(hào)通路，如JAK/STAT3、MAPK、PI3K/Akt/mTOR［11-13］等。結(jié)合IL-22在癌細(xì)胞中的作用及RA-FLSs“類(lèi)腫瘤樣細(xì)胞”特性，本實(shí)驗(yàn)旨在探討IL-22對(duì)RA-FLSs細(xì)胞活性、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 標(biāo)本采集

滑膜組織來(lái)自2015年1月～2015年9月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)鏡下滑膜清理術(shù)的患者。其中，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎7例(女性6 名)，年齡32～81歲，平均年齡(52.0±7.2)歲。所有RA患者的診斷均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除感染、腫瘤及其它類(lèi)型的結(jié)締組織病等相關(guān)疾病。

2 主要儀器和試劑

酶標(biāo)儀(Thermo);流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(TANON 5200);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、高糖DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基(Gibco);抗CD55-FITC抗體、mouse IgG1-FITC抗體(BD);rhIL-22(R＆D);CCK-8試劑盒(Dojindo); STA-21(Santa Cruz);兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人p-STAT3抗體、兔抗人STAT3抗體、兔抗人β-actin抗體(Cell Signaling Technology);HRP標(biāo)記羊抗兔II抗(北京博奧森);細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒和加強(qiáng)型ECL檢測(cè)試劑盒(南京凱基)。

3 方法

3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 組織塊法培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)消化傳代后獲得較純的成纖維樣滑膜細(xì)胞，使用生長(zhǎng)狀態(tài)較好的第3～5代細(xì)胞。光學(xué)相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD55+細(xì)胞率。

3.2 CCK-8法檢測(cè)rhIL-22作用于RA-FLSs后細(xì)胞活力的變化 將RA-FLSs以2.5×107/L的密度接種于96孔板，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)分5組:空白組，即不含細(xì)胞培養(yǎng)液組;對(duì)照組，即正常培養(yǎng)的RAFLSs;1、10、100 μg/L rhIL-22組，分別用1、10、100 μg/L rhIL-22處理RA-FLSs;實(shí)驗(yàn)各組設(shè)均4個(gè)復(fù)孔。作用24 h、48 h、72 h后(注:rhIL-22體外有效時(shí)間為48 h，故48 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液)，每孔加入CCK-8液10 μL，37℃避光繼續(xù)孵育3 h，在分光光度計(jì)450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度(A)值。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rhIL-22作用于RA-FLSs后細(xì)胞周期的變化 RA-FLSs以每孔1×106密度接種于6孔板，每孔2 mL，貼壁后同步化培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分2 組:空白對(duì)照組和10 μg/L rhIL-22處理組。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷 PBS洗滌1次后小心吸棄殘余液體，沿管壁緩慢加入預(yù)冷70%乙醇1 mL重懸細(xì)胞，4℃固定過(guò)夜。取出固定的樣品，PBS洗滌1次后，加入100 μL RNase A重懸細(xì)胞，37℃放置30 min。加入400 μL PI溶液4℃染色30 min。移至流式管中，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果使用Modifit分析軟件分析，分析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期的百分率。細(xì)胞增殖活性用增殖指數(shù)(proliferation index，PI)描述，PI值越高，細(xì)胞增殖越明顯。PI=(G2/M+S)期細(xì)胞數(shù)/(G2/M+S+G0)期細(xì)胞數(shù)×100%。

3.4 Western blot檢測(cè) rhIL-22和 STA-21作用于RA-FLS后Bcl-2和p-STAT3蛋白水平的變化 RAFLSs以每孔1×106種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%后，分別加入不同濃度或不同種類(lèi)的藥物刺激24 h，其中rhIL-22濃度分別為0、1、10、100 μg/L，STA-21濃度分別為0、25、50 μmol/L。用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，用Western blot法檢測(cè) Bcl-2/p-STAT3/STAT3的蛋白水平，即取20μg總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉后加入I抗(β-actin 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、STAT3 1∶2 000、p-STAT3 1∶2 000)，4℃搖床孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記II抗(1∶1 000～1∶10 000)孵育1 h，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光攝片，Image J軟件分析各樣本灰度的積分光密度值(integrated option density，IA)，以計(jì)算各組間 Bcl-2和 p-STAT3的蛋白水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較使用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的比較使用單因素方差分析，兩兩之間比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 RA-FLSs的培養(yǎng)及鑒定

用組織塊法養(yǎng)細(xì)胞，原代培養(yǎng)第2～3天即可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周邊游出，酶消化法進(jìn)行傳代，長(zhǎng)至第3代后以長(zhǎng)梭形的成纖維樣滑膜細(xì)胞為主，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代細(xì)胞表面 CD55+細(xì)胞表達(dá)率約96.8%，提示大多數(shù)細(xì)胞均為成纖維樣滑膜細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Identification of primarily cultured RA-FLSs.A:RA-FLSs under light microscope(×10);B:CD55 expression of passage 3 RA-FLSs detected by flow cytometry.圖1 原代培養(yǎng)RA-FLSs的鑒定

2 CCK-8法檢測(cè)rhIL-22對(duì)RA-FLSs活力的影響

方差分析結(jié)果提示，空白組RA-FLSs細(xì)胞活力隨時(shí)間而增加;與對(duì)照組比，rhIL-22可增強(qiáng)RA-FLSs的細(xì)胞活力，且rhIL-22對(duì)RA-FLSs的活力影響呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)表1。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rhIL-22對(duì)RA-FLSs細(xì)胞周期的影響

10 μg/L rhIL-22與RA-FLSs共培養(yǎng)24 h后，與空白對(duì)照組相比，RA-FLSs細(xì)胞S期和G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加，G0/G1期減少(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

表1 rhIL-22作用于RA-FLSs后細(xì)胞活力的變化Table 1.The viability of RA-FLSs after co-cultured with rhIL-22(A value.Mean±SD.n=3)

Figure 2.The cell cycle distribution of RA-FLSs after stimulated with rhIL-22.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rhIL-22作用于RA-FLSs后，RA-FLSs的細(xì)胞周期分布

4 rhIL-22和STA-21作用于RA-FLSs時(shí)Bcl-2和p-STAT3蛋白水平的變化

4.1 rhIL-22加藥處理 1 μg/L rhIL-22組與對(duì)照組間Bcl-2表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，10、100 μg/L rhIL-22組Bcl-2表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，且rhIL-22增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)隨濃度而增加;1 μg/L rhIL-22組與對(duì)照組p-STAT3的表達(dá)，無(wú)顯著性差異;10 μg/L rhIL-22組、100 μg/L rhIL-22組p-STAT3的表達(dá)較對(duì)照高(P＜0.01)，10 μg/L rhIL-22組與100 μg/L rhIL-22組間相互比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effects of rhIL-22 at different concentrations on the protein levels of Bcl-2 and p-STAT3 in the RA-FLSs.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group.圖3 不同濃度rhIL-22作用于RA-FLSs對(duì)Bcl-2和p-STAT3蛋白水平的影響

4.2 不同濃度STA-21處理結(jié)果 STA-21 25 μmol/ L組Bcl-2表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，STA-21 50 μmol/L可顯著降低 Bcl-2的表達(dá)(P＜ 0.01);STA-21 25 μmol/L組與STA-21 50 μmol/L組p-STAT3水平均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effects of STA-21 at different concentrations on the protein levels of Bcl-2 and p-STAT3 in the RA-FLSs.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group.圖4 不同濃度STA-21作用于RA-FLSs對(duì)Bcl-2和p-STAT3蛋白水平的影響

4.3 rhIL-22與STA-21共處理結(jié)果 10 μg/L rhIL-22可顯著升高Bcl-2及p-STAT3的表達(dá)，而加入50 μmol/L STA-21后，Bcl-2及 p-STAT3均顯著降低(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.In the presence or absence of STA-21，the effects of rhIL-22 on the protein levels of Bcl-2 and p-STAT3 in the RA-FLSs.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs rhIL-22圖5 在含或不含STA-21的情況下，rhIL-22作用于RA-FLS對(duì)Bcl-2和p-STAT3蛋白水平的影響

討論

2005 年Ikeuchi等［14］首次探討IL-22在RA中的作用，之后關(guān)于IL-22與RA的研究逐漸增多。因IL-22在多種細(xì)胞(包括RA-FLSs)［14-15］中的研究濃度梯度均為0、1、10、100 μg/L，本研究設(shè)置同樣濃度梯度的IL-22作用于RA-FLSs，CCK-8結(jié)果提示rhIL-22可增強(qiáng)RA-FLSs細(xì)胞活力，且呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。根據(jù)rhIL-22對(duì)RA-FLSs細(xì)胞活力的影響，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)所采用的最終藥物作用濃度為10 μg/L。細(xì)胞周期分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rhIL-22作用于RA-FLSs后，S期和G2/M期的細(xì)胞比例增加，G0/G1期減少，提示rhIL-22可促進(jìn)RA-FLSs細(xì)胞增殖。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL-22可呈濃度依賴(lài)性上調(diào)RA-FLSs中的Bcl-2和p-STAT3蛋白水平，說(shuō)明IL-22可激活RA-FLSs中的STAT3，且可能對(duì)RAFLSs細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。STAT3是EGFI、JAK、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通路的匯集點(diǎn)，STAT3激活后誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)的關(guān)鍵基因異常高表達(dá)，通過(guò)各種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞凋亡［2］。Krause等［16］使用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)技術(shù)使 STAT3發(fā)生顯性失活性突變(STAT3-YF)，抑制內(nèi)源性STAT3激活及其下游基因的表達(dá)，結(jié)果顯示STAT3-YF轉(zhuǎn)染的RA滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)受限，凋亡率增加，提示STAT3對(duì)RA-FLSs的存活及生長(zhǎng)非常重要。鑒于STAT3在腫瘤細(xì)胞、RA-FLS中的重要作用及與IL-22功能的密切相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討IL-22是否通過(guò)激活STAT3促進(jìn)RAFLSs細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)。

STA-21是STAT3特異性抑制劑［17］，Park等［18］研究證實(shí)STA-21能改善類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型的臨床癥狀，上調(diào)Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能，抑制Th17細(xì)胞和破骨細(xì)胞形成，推測(cè)STA-21可作為治療RA的靶點(diǎn)。根據(jù)STA-21在多種細(xì)胞中的研究［15，17-18］，本實(shí)驗(yàn)采用25 μmol/L和50 μmol/L兩種濃度研究其對(duì)RA-FLS中Bcl-2和p-STAT3的影響，結(jié)果提示STA-21均可濃度依賴(lài)性地降低兩者的蛋白水平，說(shuō)明STA-21可抑制STAT3活化，且可能對(duì)RA-FLSs細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。因50 μmol/L STA-21對(duì)RA-FLSs的抑制作用更明顯，為探究STA-21能否阻斷IL-22 對(duì)RA-FLS的作用，本實(shí)驗(yàn)選用50 μmol/L STA-21作為最終的藥物作用濃度。

將含或不含STA-21的IL-22作用于RA-FLSs，結(jié)果顯示加入STA-21后，IL-22促Bcl-2及p-STAT3蛋白表達(dá)水平的能力明顯下降，而STA-21是STAT3特異性抑制劑，說(shuō)明IL-22是通過(guò)激活RA-FLSs中STAT3從而促進(jìn)其下游抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)的。

目前臨床上所應(yīng)用的生物制劑如TNF-α抑制劑，可顯著改善RA患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及疾病活動(dòng)度［19］。但是，生物制劑可誘導(dǎo)機(jī)會(huì)性感染及激活潛在感染［20］，TNF-α抑制劑還可增加侵襲性黑色素瘤的風(fēng)險(xiǎn)［21］。因此，深入探索不同細(xì)胞因子［10，22］和microRNAs［23］在RA病理進(jìn)程中的作用尤為重要。結(jié)合IL-22、STAT3及STA-21的分子特性，我們推測(cè)，IL-22/STAT3和STA-21都有可能成為治療RA的靶點(diǎn)。

［1］ Sabat R，Ouyang W，Wolk K.Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system［J］.Nat Rev Drug Discov，2014，13(1):21-38.

［2］ Yu H，Pardoll D，Jove R.STATs in cancer inflammation and immunity:a leading role for STAT3［J］.Nat Rev Cancer，2009，9(11):798-809.

［3］ Xu X，Tang Y，Guo S，et al.Increased intratumoral interleukin 22 levels and frequencies of interleukin 22-producing CD4+T cells correlate with pancreatic cancer progression［J］.Pancreas，2014，43(3):470-477.

［4］ Yu LZ，Wang HY，Yang SP，et al.Expression of interleukin-22/STAT3 signaling pathway in ulcerative colitis and related carcinogenesis［J］.World J Gastroenterol，2013，19(17):2638-2649.

［5］ Jiang R，Tan Z，Deng L，et al.Interleukin-22 promotes human hepatocellular carcinoma by activation of STAT3 ［J］.Hepatology，2011，54(3):900-909.

［6］ Zhang W，Chen Y，Wei H，et al.Antiapoptotic activity of autocrine interleukin-22 and therapeutic effects of interleukin-22-small interfering RNA on human lung cancer xenografts［J］.Clin Cancer Res，2008，14(20):6432-6439.

［7］ Niedermeier M，Pap T，Korb A.Therapeutic opportunities in fibroblasts in inflammatory arthritis［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol，2010，24(4):527-540.

［8］ 郭興華，潘云峰，宋澤蓉，等.Fractalkine對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞中NF-κB活化及內(nèi)源性fractalkine mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(10):1967-1971.

［9］ Xiao CY，Pan YF，Guo XH，et al.Expression of betacatenin in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes ［J］.Scand J Rheumatol，2011，40(1):26-33.

［10］郭 欣，胡愛(ài)玲，方霖楷，等.RICTOR對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞活力的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29(3):526-530.

［11］Carrion M，Juarranz Y，Martinez C，et al.IL-22/IL-22R1 axis and S100A8/A9 alarmins in human osteoarthritic and rheumatoid arthritis synovial fibroblasts［J］.Rheumatology (Oxford)，2013，52(12):2177-2186.

［12］Kim KW，Kim HR，Park JY，et al.Interleukin-22 promotes osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis through induction of RANKL in human synovial fibroblasts［J］.Arthritis Rheum，2012，64(4):1015-1023.

［13］Mitra A，Raychaudhuri SK，Raychaudhuri SP.IL-22 induced cell proliferation is regulated by PI3K/Akt/mTOR signaling cascade［J］.Cytokine，2012，60(1):38-42.

［14］Ikeuchi H，Kuroiwa T，Hiramatsu N，et al.Expression of interleukin-22 in rheumatoid arthritis:potential role as a proinflammatory cytokine［J］.Arthritis Rheum，2005，52 (4):1037-1046.

［15］Lee SY，Kwok SK，Son HJ，et al.IL-17-mediated Bcl-2 expression regulates survival of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis through STAT3 activation［J］.Arthritis Res Ther，2013，15(1):R31.

［16］Krause A，Scaletta N，Ji JD，et al.Rheumatoid arthritis synoviocyte survival is dependent on Stat3［J］.J Immunol，2002，169(11):6610-6616.

［17］Song H，Wang R，Wang S，et al.A low-molecular-weight compound discovered through virtual database screening inhibits Stat3 function in breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(13):4700-4705.

［18］Park JS，Kwok SK，Lim MA，et al.STA-21，a promising STAT-3 inhibitor that reciprocally regulates Th17 and Treg cells，inhibits osteoclastogenesis in mice and humans and alleviates autoimmune inflammation in an experimental model of rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheumatol，2014，66(4):918-929.

［19］Bao J，Yue T，Li T，et al.Good response to infliximab in rheumatoid arthritis following failure of interleukin-1 receptor antagonist［J］.Int J Rheum Dis，2016，19(4): 370-376.

［20］Curtis JR，Xie F，Chen L，et al.The comparative risk of serious infections among rheumatoid arthritis patients starting or switching biological agents［J］.Ann Rheum Dis，2011，70(8):1401-1406.

［21］Raaschou P，Simard JF，Holmqvist M，et al.Rheumatoid arthritis，anti-tumour necrosis factor therapy，and risk of malignant melanoma:nationwide population based prospective cohort study from Sweden［J］.BMJ，2013，346: f1939.

［22］儲(chǔ)永良，黃清春，黃閏月，等.血栓素A2受體通過(guò)介導(dǎo)環(huán)氧酶2的合成增強(qiáng)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的增殖作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(6):1110-1113，1118.

［23］史棟梁，史桂榮.MicroRNA-16對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細(xì)胞增殖、侵襲及細(xì)胞因子分泌的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(10):1868-1872.

(責(zé)任編輯:盧 萍，余小慧)

Effects of IL-22 on rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes

LIU Meng，LIU Yan，YANG Meng-ru，MO Bi-yao，PAN Yun-feng

(Department of Rheumatology，The Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China.E-mail: panyunfeng@medmail.com.cn)

AIM:To determine the effects and mechanisms of interleukin-22(IL-22)on the fibroblast-like synoviocytes(FLSs)from rheumatoid arthritis(RA)patients.METHODS:RA-FLSs were cultured by tissue culture method.RA-FLSs were incubated with different concentrations of IL-22(0，1，10，100 μg/L)for 24 h，48 h and 72 h.The cell viability was examined by CCK-8 assay.IL-22 at concentration of 10 μg/L was used to stimulate RA-FLSs for 24 h，and the change of cell cycle distribution was identified by flow cytometry.The effects of IL-22 at concentrations of 0，1，10，100 μg/L and/or STA-21(a STAT3 inhibitor at concentrations of 0，25，50 μmol/L)on the protein levels of Bcl-2 and p-STAT3 in the RA-FLSs were determined by Western blot.RESULTS:Compared with control group，stimulation of rhIL-22 at different concentrations for 24 h，48 h and 72 h，the cells viabilityof RA-FLSs were obviously increased(P＜0.05).After co-cultured with 10 μg/L rhIL-22 for 24 h，the percentages of RA-FLSs were obviously increased in the G2/M+S phase and decreased in the G0/G1phase.At the same time，rhIL-22 increased，but STA-21 decreased the protein levels of Bcl-2 but p-STAT3 in the RA-FLSs obviously(P＜0.05).Treatment with STAT3 inhibitor STA-21 reversed the effect of IL-22-induced Bcl-2 upregulation in the RA-FLSs(P＜0.01).CONCLUSION:STAT3 is critical in the process of IL-22-induced Bcl-2 upregulation in RA-FLSs，indicating that IL-22 may play a role in the apoptosis of RA-FLSs.

Rheumatoid arthritis;Fibroblast-like synoviocytes;Interleukin-22;STAT3;Bcl-2

R593;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.019

1000-4718(2016)07-1273-06

2015-11-16

2016-04-26

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014A030313080)

△Tel:020-85252194;E-mail:panyunfeng@medmail.com.cn