miR-193b在宮頸癌中的表達(dá)與功能及其對(duì)化療敏感性的影響*

杜文霞，姬 霞

(河南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州450002)

miR-193b在宮頸癌中的表達(dá)與功能及其對(duì)化療敏感性的影響*

杜文霞△，姬 霞

(河南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州450002)

目的:探討微小RNA-193b(miR-193b)在不同宮頸組織中的表達(dá)以及其對(duì)順鉑作用于宮頸癌細(xì)胞敏感性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。方法:實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)不同宮頸組織中miR-193b的表達(dá)水平。采用脂質(zhì)體將miR-193b-inhibitor轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，Transwell法、CCK-8法和免疫蛋白印跡法分別檢測(cè)細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性以及細(xì)胞中PTEN、Akt、p-Akt和P-糖蛋白(P-gp)的蛋白水平。結(jié)果:qPCR結(jié)果顯示miR-193b在正常宮頸組織及宮頸糜爛組織中呈低表達(dá)，在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)明顯上升;轉(zhuǎn)染miR-193b-inhibitor后，HeLa細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(P＜0.05)，順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞活力的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)(P＜0.05)，細(xì)胞中PTEN的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，Akt的蛋白表達(dá)無明顯變化，p-Akt和P-gp的蛋白水平明顯下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論:miR-193b在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，沉默miR-193b可增加HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，作用機(jī)制可能與PTEN-PI3K/Akt通路有關(guān)。

微小RNA-193b;宮頸癌;HeLa細(xì)胞;順鉑

宮頸癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率位于女性惡性腫瘤中第2位，85%以上的患者處于發(fā)展中國家［1］。中國每年宮頸癌的發(fā)病率占全球四分之一以上，一般為35歲以上婦女，但近年來有逐漸年輕化的趨勢(shì)［2］。目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)理是高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染，已有2種治療宮頸癌的預(yù)防性疫苗上市，主要針對(duì)HPV-16和18亞型，但由于疫苗價(jià)格昂貴，針對(duì)性強(qiáng)而無法推廣［3］。化療是晚期宮頸癌治療的主要手段之一，但治療中產(chǎn)生的耐藥性對(duì)臨床的治療效果有嚴(yán)重的阻礙。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼、具調(diào)控功能的小分子單鏈RNA，長度為21～22個(gè)堿基對(duì)，主要參與生長發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖與凋亡等許多生物學(xué)過程。近年研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著對(duì)miRNA與腫瘤的研究逐漸深入，已有報(bào)道指出miRNA可以影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［4］。miR-193b編碼基因位于人16pI3、12，是一種非編碼小分子 RNA。研究發(fā)現(xiàn)miR-193b通過抑制cyclin D1來抑制癌細(xì)胞增殖，且通過下調(diào)髄樣細(xì)胞白血病序列表達(dá)來調(diào)控黑色素瘤的發(fā)生［5］。

本研究通過檢測(cè)不同宮頸組織中miR-193b的表達(dá)，利用miR-193b-inhibitor轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，觀察細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化，初步探討其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 材料 HeLa細(xì)胞株購于上海細(xì)胞生物研究所;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基購于Gibco;LipofectamineTM2000、TRIzol和qPCR引物購于 Invitrogen;質(zhì)粒 pcDNA3.1-miR-193b-inhibitor和空載質(zhì)粒pcDNA3.1購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;順鉑(diamminedichloroplatinum，DDP)購于齊魯制藥有限公司;人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)、蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/ Akt)、p-Akt、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、β-actin抗體購于Santa Cruz;CCK-8溶液購于Dojindo;其它試劑均為分析純。

1.2 樣本收集 選取2010年1月～2014年12月河南省中醫(yī)院正常宮頸組織樣本30例，經(jīng)病理鑒定為宮頸糜爛組織樣本40例，宮頸上皮內(nèi)瘤變樣本38例，宮頸癌組織樣本54例，年齡為30～65歲。取得組織后立即置于－80℃液氮中冷凍保存。所有患者在收集樣本前未進(jìn)行任何放射治療，化學(xué)治療，且所有樣本獲取時(shí)經(jīng)過本院倫理委員會(huì)的同意。

2 方法

2.1 qPCR測(cè)定各宮頸組織中miR-193b的表達(dá)

取適量正常宮頸組織、宮頸糜爛組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織，按照TRIzol說明書裂解細(xì)胞，使用氯仿提取總RNA，用紫外分光光度法測(cè)定RNA樣品的A260nm值，并進(jìn)行定量。建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，miR-193b的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;內(nèi)參照U6上游引物為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，下游引物為 5’-ATTCGCACTGGATACGACCAGACTC-3’。擴(kuò)增條件為95℃5 min;94℃30 s、60℃30 s、72℃1 min，35個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)空白對(duì)照(control)組、脂質(zhì)體組(Lipo組)、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1組(pcDNA3.1組)和轉(zhuǎn)染 miR-193b-inhibitor質(zhì)粒組(miR-193b-inhibitor組)。取相應(yīng)組別處于穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后置于96孔板中，待細(xì)胞密度到達(dá)約為60%時(shí)，更換新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，將上述各組(空白對(duì)照組除外)分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，加入LipofectamineTM2000，按說明書操作，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.3 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5× 109/L，于Transwell小室的上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗2次，10%甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。

2.4 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性 將處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別加入DDP(0.01 μmol/L，0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L)，空白對(duì)照組不加入DDP，繼而培養(yǎng)24 h后，或加入DDP 5 μmol/L，分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h后，棄去上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量吸光度(A)值。

2.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 離心收集經(jīng)相應(yīng)處理的各組細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，每泳道加入50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉1 h，加入相應(yīng)I抗，4℃過夜，再加入相應(yīng)II抗，室溫1 h化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像并分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，方差齊性檢驗(yàn)后做方差分析，用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 qPCR檢測(cè)各宮頸組織中miR-193b的表達(dá)水平

采用qPCR測(cè)定正常宮頸組織、宮頸糜爛組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中miR-193b的表達(dá)水平。結(jié)果表明正常宮頸組織和宮頸糜爛組織中miR-193b的表達(dá)水平很低，二者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中miR-193b的表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織和宮頸糜爛組織，且二者的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，見圖1。

Figure 1.miR-193b expression in various cervical tissues.1: normal cervical tissues(n=30);2:cervical erosion tissues(n=40);3:cervical intraepithelial neoplasia tissues(n=38);4:cervical cancer tissues(n= 54).Mean±SD.*P＜0.05 vs normal cervical tissues.圖1 各宮頸組織中miR-193b的表達(dá)水平

2 miR-193b-inhibitor抑制HeLa細(xì)胞的遷移能力

Transwell法檢測(cè)下調(diào)miR-193b對(duì)HeLa細(xì)胞的遷移能力的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-193b-inhibitor后，細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于control組(P＜0.05)，pcDNA3.1組、Lipo組和control組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

3 miR-193b-inhibitor增強(qiáng)HeLa細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性

分別給予不同濃度(0.01～10 μmol/L)DDP培養(yǎng)24 h，細(xì)胞活力被顯著抑制，并隨DDP濃度增大而抑制作用增強(qiáng)，與0.01 μmol/L濃度組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05);另外，給予5 μmol/L DDP分別與細(xì)胞培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h后，細(xì)胞活力同樣被顯著抑制，并隨DDP培養(yǎng)時(shí)間增加而增強(qiáng)，與12 h組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染了miR-193b-inhibitor則可進(jìn)一步增強(qiáng)DDP對(duì)HeLa細(xì)胞活力的抑制作用，與相應(yīng)control組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。提示沉默miR-193b增強(qiáng)HeLa細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。見表1、2。

Figure 2.The effect of miR-193b-inhibitor on the migration of HeLa cells(×200).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 下調(diào)miR-193b對(duì)HeLa細(xì)胞遷移率的影響

表1 沉默miR-193b增強(qiáng)HeLa細(xì)胞對(duì)不同濃度DDP的敏感性Table 1.miR-193b-inhibitor augmented the sensitivity of HeLa cells to DDP at different concentrations(Mean±SD.n=3)

表2 沉默miR-193b DDP處理不同時(shí)間的HeLa細(xì)胞的敏感性的影響Table 2.Eeffect of miR-193b-inhibitor on the sensitivity of HeLa cells to DDP for different time(Mean±SD.n=3)

4 下調(diào)miR-193b對(duì)HeLa細(xì)胞中PTEN、Akt、p-Akt和P-gp蛋白水平的影響

轉(zhuǎn)染miR-193b-inhibitor后，進(jìn)一步通過Western blot檢測(cè)PTEN、Akt、p-Akt和P-gp的蛋白水平，結(jié)果顯示PTEN的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，Akt的蛋白水平?jīng)]有變化，p-Akt和P-gp的蛋白水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of miR-193b-inhibitor on the protein levels of PTEN，Akt，p-Akt and P-gp of HeLa cells.Mean ±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖3 沉默miR-193b對(duì)HeLa細(xì)胞PTEN、Akt、p-Akt和P-gp蛋白水平的影響

討論

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中，微小RNA的表達(dá)異常與癌變的進(jìn)展及細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。劉琳等［6］發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織和HeLa細(xì)胞中，miR-21呈高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖，miR-143和miR-373呈低表達(dá)，起抑癌基因的作用。劉穎等［7］研究發(fā)現(xiàn)miR-193b在子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。我們研究發(fā)現(xiàn)miR-193b在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，而在正常組織和宮頸糜爛組織中呈低表達(dá)，表明miR-193b在宮頸癌變中具有特異性。下調(diào) miR-193b后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力下降。體外研究發(fā)現(xiàn)HNscc的FaDu細(xì)胞系敲除miR-193b可以導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲能力降低，同樣體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中敲除miR-193b亦可抑制腫瘤細(xì)胞的形成［8］。本實(shí)驗(yàn)中Transwell染色法結(jié)果表明沉默miR-193b后，HeLa細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示miR-193b與宮頸癌細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。

順鉑是目前化療中最常用的藥物之一，化療藥物治療可為患者最大程度地保留卵巢和子宮陰道，但由于腫瘤細(xì)胞存在耐藥性，治療效果欠佳。我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-193b-inhibitor后可增強(qiáng)順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用。PTEN在多種腫瘤細(xì)胞中的常常呈異常表達(dá)狀態(tài)，PTEN蛋白是PI3K/Akt信號(hào)途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，使PI3K的3-磷酸化位點(diǎn)去磷酸化［9］。PI3K/Akt信號(hào)途徑在細(xì)胞的增殖、衰老、凋亡等生命活動(dòng)中起重要作用［10］。P-gp是由多藥耐藥基因編碼的跨膜蛋白，與腫瘤對(duì)化療的敏感性密切相關(guān)。已有研究證明在前列腺癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路途徑激活后，P-gp的蛋白表達(dá)增加［11］。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HeLa細(xì)胞中PTEN的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Akt的蛋白表達(dá)沒有變化，p-Akt和P-gp的蛋白水平明顯下調(diào)，提示PTEN激活后，使PI3K/Akt信號(hào)通路途徑的活性受到抑制，進(jìn)而抑制了p-Akt和P-gp的蛋白水平，提高了HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，余小慧)

Expression and significance of miR-193b in cervical cancer

DU Wen-xia，JI Xia

(Department of Obstetrics and Gynecology，Henan Province Hospital of TCM，Zhengzhou 450002，China.E-mail:hnduwenxia@163.com)

AIM:To investigate the expression of microRNA-193b(miR-193b)in the cervical tissues，and further to explore the effect of silencing miR-193b on diamminedichloroplatinum(DDP)-treated HeLa cell viability.METHODS:The expression levels of miR-193b in different cervical tissues were examined by qPCR.After transfection of miR-193b-inhibitor，the cell migration was determined by Transwell assay，the sensitivity of HeLa cells to DDP was measured by MTT assay，the protein levels of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten(PTEN)，protein kinase B (Akt)，p-Akt and p-glycoprotein(P-gp)were determined by Western blot.RESULTS:The mRNA level of miR-193b was significantly increased in the cervical cancer tissues compared with normal cervical tissues(P＜0.05).Knockdown of miR-193b obviously inhibited migration and enhanced sensitivity to DDP of HeLa cells(P＜0.05).Additionally，after transfection of miR-193b-inhibitor，the expression of PTEN was increased，whereas the protein levels of p-Akt and P-gp were decreased(P＜0.05).CONCLUSION:miR-193b is highly expressed in the cervical cancer tissues.Inhibition of miR-193b augments the sensitivity to DDP of HeLa cells，at least in part，through PTEN-PI3K/Akt signaling pathway.

MicroRNA-193b;Cervical cancer;HeLa cells;Diamminedichloroplatinum

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.014

1000-4718(2016)07-1241-05

2015-11-24

2016-03-01

河南省中醫(yī)藥管理局科研課題(No.2014ZY02013)

△Tel:0371-60908722;E-mail:hnduwenxia@163.com