抑制SHARPIN激活Rip1促進(jìn)LNCaP-AI細(xì)胞壞死性凋亡*

王淦平， 黃 海， 陳賢舉， 賴義明， 林春浩， 曾樂(lè)祥， 曹 億，張一鳴， 余永晟， 郭正輝△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1泌尿外科，2小兒外科，3急診外科，廣東廣州510120;4南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510282;5中山大學(xué)附屬博濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州511300)

抑制SHARPIN激活Rip1促進(jìn)LNCaP-AI細(xì)胞壞死性凋亡*

王淦平1， 黃 海1， 陳賢舉1， 賴義明1， 林春浩1， 曾樂(lè)祥2， 曹 億3，張一鳴4， 余永晟5， 郭正輝1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1泌尿外科，2小兒外科，3急診外科，廣東廣州510120;4南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510282;5中山大學(xué)附屬博濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州511300)

目的:探討SHARPIN對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞LNCaP-AI壞死性凋亡關(guān)鍵因子Rip1的調(diào)控作用，以及對(duì)細(xì)胞壞死性凋亡的影響。方法:將LNCaP-AI細(xì)胞分為T(mén)NF-α+Z-VAD(caspase抑制劑)處理組與TNF-α+Z-VAD+Nec-1(Rip1抑制劑)處理組，應(yīng)用MTS檢測(cè)各組細(xì)胞的活力，研究壞死性凋亡機(jī)制在誘導(dǎo)LNCaP-AI細(xì)胞死亡中的作用。將LNCaP-AI細(xì)胞分為陰性對(duì)照組和SHARPIN干擾(si-SHARPIN)組，RT-qPCR驗(yàn)證抑制效率，通過(guò)免疫熒光等技術(shù)進(jìn)一步探討SHARPIN調(diào)控壞死性凋亡的具體分子機(jī)制。結(jié)果:與對(duì)照組相比，TNF-α+ Z-VAD處理組的LNCaP-AI細(xì)胞活力下降28%(P＜0.05)，而TNF-α+Z-VAD+Nec-1處理組的細(xì)胞在Rip1被抑制后，細(xì)胞活力無(wú)明顯改變。在LNCaP-AI細(xì)胞中，通過(guò)siRNA抑制SHARPIN表達(dá)后，Rip1表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)，LNCaP-AI細(xì)胞壞死性凋亡比例升高。結(jié)論:LNCaP-AI細(xì)胞可通過(guò)壞死性凋亡機(jī)制誘導(dǎo)死亡，下調(diào)SHARPIN可能通過(guò)激活Rip1增強(qiáng)LNCaP-AI細(xì)胞壞死性凋亡。

去勢(shì)抵抗性前列腺癌;LNCaP-AI細(xì)胞;Rip1;SHARPIN;壞死性凋亡

早期前列腺癌可手術(shù)根治，晚期前列腺癌首選內(nèi)分泌治療，但一段時(shí)間后會(huì)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)，對(duì)去勢(shì)治療耐受，CRPC治療現(xiàn)已成為是前列腺癌治療中棘手的問(wèn)題。CRPC細(xì)胞的抗凋亡特性大大增加了前列腺癌的治療難度。CRPC發(fā)生的機(jī)制尚未完全明確，目前研究證實(shí)雄激素受體(androgen receptor，AR)過(guò)度表達(dá)以及AR基因突變導(dǎo)致對(duì)雄激素的敏感性增加是產(chǎn)生CRPC的重要機(jī)制［1］。

SHARPIN是Shank蛋白家族中的錨定蛋白重復(fù)序列發(fā)生交聯(lián)的一種新型蛋白，參與蛋白泛素化修飾。SHARPIN在多種器官中表達(dá)，近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)SHARPIN的異常高表達(dá)與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。我們前期研究也證明SHARPIN是影響前列腺癌增殖的一個(gè)重要蛋白分子，參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能及其相關(guān)的分子信號(hào)通路［4］。受體交聯(lián)蛋白1(receptor-interacting protein 1，Rip1)是死亡區(qū)域受體家族蛋白成員，與細(xì)胞的存亡密切相關(guān)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Rip1參與調(diào)控細(xì)胞的壞死性凋亡，而且壞死性凋亡對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡有重要意義。Rip1在前列腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況尚不清楚，對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控作用仍然未知。本文研究SHARPIN和Rip1在誘導(dǎo)凋亡抵抗的CRPC細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡過(guò)程中的作用，初步探討SHARPIN和Rip1在CRPC細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其分子調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞與主要試劑

LNCaP細(xì)胞系購(gòu)于 ATCC細(xì)胞庫(kù)。去酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和無(wú)血清Opti-MEM購(gòu)于 Gibco;碳吸附去雄胎牛血清(charcoalstripped fetal bovine serum，csFBS)和普通胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于Biological Industries;人重組TNF-α購(gòu)于PeproTech;Z-VAD(caspase抑制劑)和壞死性凋亡的抑制劑 necrostatin-1(Nec-1)購(gòu)于Selleckchem;凋亡試劑購(gòu)于eBioscience;SHARPIN兔單克隆抗體和Rip1兔單克隆抗體購(gòu)于CST;AR兔多克隆抗體和Rip3小鼠單克隆抗體購(gòu)于Abcam;GAPDH內(nèi)參照抗體購(gòu)于康為世紀(jì);熒光Ⅱ抗購(gòu)于Life Technologies;DAPI購(gòu)于 Sigma;MTS試劑購(gòu)于 Promega;細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMRNAiMAX購(gòu)于 Invitrogen;RT-qPCR試劑盒購(gòu)于 TaKaRa;si-SHARPIN序列由上海吉瑪合成，序列為5’-CUGCUUUCCUCUACUUGCUdTdT-3’;引物由上海捷瑞生物合成，序列詳見(jiàn)方法2.5。其余試劑購(gòu)于碧云天生物公司、永津生物公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LNCaP-AI細(xì)胞通過(guò)LNCaP細(xì)胞在去勢(shì)小鼠體內(nèi)原位成瘤誘導(dǎo)而成，具體方法詳見(jiàn)引文［5］。LNCaP細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI-1640中培養(yǎng)，LNCaP-AI細(xì)胞在含有10%csFBS的去酚紅RPMI-1640中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h更換培養(yǎng)基，48 h～72 h進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

2.2 MTS方法檢測(cè)細(xì)胞活力 將LNCaP或者LNCaP-AI細(xì)胞接種于96孔板中，每孔大約1 500個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，各孔分別加入20 μL MTS試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，用490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(A)值。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算時(shí)取平均值。

2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞接種于6孔板，每孔大約1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞總蛋白并定量，從樣品中取20 μg蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉置于室溫封閉1 h，孵育SHARPIN (1∶1 000)、AR(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體于4℃過(guò)夜。次日TBST洗膜后，將膜置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)中，室溫孵育1 h，然后用ECL發(fā)光液顯影。

2.4 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將LNCaP-AI細(xì)胞接種于6孔板，每孔計(jì)數(shù)細(xì)胞大約為1×105個(gè)，待細(xì)胞鋪滿6孔板80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體 LipofectamineTMRNAiMAX按10 mL/L濃度、siRNA或negative control序列按100 pmol/L濃度混于無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，然后再將兩者混合，室溫靜置20 min。棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，再將混合液加至6孔板，補(bǔ)足Opti-MEM培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，并于6 h后更換正常含血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h后收集細(xì)胞總蛋白。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA的表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收集總RNA，RT-qPCR擴(kuò)增并相對(duì)定量SHARPIN和GAPDH的表達(dá)。SHARPIN的上游引物為5’-CCTTGCCTCTTACGGGGTTC-3’，下游引物為5’-TCCAAGTTCCCCGTCCATCT-3’;GAPDH的上游引物為5’-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’，下游引物為5’-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3’。SHARPIN擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為350 bp，GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為464 bp。PCR反應(yīng)條件為:98℃ 20 s，55℃ 30 s，72 ℃30 s，共32個(gè)循環(huán)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞壞死性凋亡比例 收集轉(zhuǎn)染48 h后的LNCaP-AI細(xì)胞，計(jì)數(shù)大約1×106個(gè)，用PBS洗滌2次后1 000 r/min離心5 min，然后將上清棄去，收集細(xì)胞，并加入500 μL binding buffer重懸細(xì)胞，往重懸液中加入10 μL PI后充分混合均勻，置于室溫避光反應(yīng)15 min。隨后加入5 μL Annexin VFITC充分混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)算壞死凋亡比例。

2.7 免疫熒光觀察蛋白表達(dá)水平 LNCaP-AI細(xì)胞接種于24孔板，轉(zhuǎn)染48 h后去除培養(yǎng)基，PBS洗滌3 次;加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，棄上清，用PBST洗滌細(xì)胞;加入0.5%的Triton破膜處理15 min后，用PBST漂洗5 min 2次;加入封閉液，室溫孵育30 min;棄去封閉液，加入Rip1和Rip3混合抗體稀釋液(1∶100)置于4℃過(guò)夜;次日取出后先室溫靜置20 min，然后用PBST漂洗5 min 4次;(以下步驟避光)加入熒光 II抗混合液(1∶100)室溫孵育1 h，PBST漂洗5 min 4次;DAPI(1∶1 000)染色3 min，PBS洗滌細(xì)胞后置于熒光顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，兩組間數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni法分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 細(xì)胞模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

LNCaP-AI細(xì)胞由LNCaP細(xì)胞經(jīng)過(guò)雄激素剝奪誘導(dǎo)培養(yǎng)而成，MTS法檢測(cè)LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞分別在含普通血清的培養(yǎng)基及含去雄激素血清的培養(yǎng)基中的細(xì)胞活力，LNCaP細(xì)胞在含去雄激素血清的培養(yǎng)基中的細(xì)胞活力較在含普通血清的培養(yǎng)基中明顯下降(P＜0.05)，而LNCaP-AI細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中的細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Western blot法對(duì)比檢測(cè) LNCaP和 LNCaP-AI細(xì)胞中SHARPIN和AR蛋白的表達(dá)水平，LNCaP-AI細(xì)胞中SHARPIN和AR蛋白的表達(dá)都顯著高于LNCaP細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Identifiation of LNCaP-AI cells.A:the viability of LNCaP and LNCaP-AI cells in FBS or csFBS medium detected by MTS assay;B:the expression levels of SHARPIN and AR in these 2 cell lines determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs FBS;#P＜0.05 vs LNCaP.圖1 LNCaP-AI細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果

2 LNCaP-AI細(xì)胞經(jīng)TNF-α和Z-VAD處理后，發(fā)生壞死性凋亡

各組細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，檢測(cè)細(xì)胞活力，與blank control組相比，TNF-α+Z-VAD處理組的細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.05);而TNF-α+Z-VAD+Nec-1處理組細(xì)胞的活力明顯高于TNF-α+Z-VAD處理組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

3 抑制SHARPIN表達(dá)后，LNCaP-AI細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡比例升高

轉(zhuǎn)染si-SHARPIN序列于LNCaP-AI細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR檢測(cè)SHARPIN的抑制效率大約為81%。經(jīng)藥物處理24 h后，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡的比例，TNF-α+Z-VAD +si-SHARPIN處理組的細(xì)胞與TNF-α+si-SHARPIN處理組相比，壞死性凋亡比例顯著升高(P＜0.05)，TNF-α+Z-VAD+si-SHARPIN處理組加入壞死性凋亡抑制劑Nec-1后，細(xì)胞壞死性凋亡比例降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.MTS assay was used to detect the viability of LNCaPAI cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs TNF-α group;#P＜0.05 vs TNF-α+Z-VAD group.圖2 TNF-α和Z-VAD刺激LNCaP-AI細(xì)胞后可以激活壞死性凋亡

Figure 3.Effect of si-SHARPIN on necroptosis of LNCaP-AI cells.A:RT-qPCR was applied to detect the suppression efficiency of si-SHARPIN;B:the proportion of necroptosis of LNCaP-AI cells with or without knockdown of SHARPIN was analyzed by flow cytometry;C:bar chart of the results in B.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control RNA group;△P＜0.05 vs TNF-α+ si-SHARPIN group;#P＜0.05 vs TNF-α+si-SHARPIN+Z-VAD group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-SHARPIN后，LNCaP-AI細(xì)胞壞死性凋亡的比例變化

4 抑制LNCaP-AI細(xì)胞中SHARPIN表達(dá)，同時(shí)用TNF-α和Z-VAD處理細(xì)胞，LNCaP-AI細(xì)胞的活力明顯下降

與negative control組相比，si-SHARPIN組的細(xì)胞活力下降29.1%(P＜0.05);si-SHARPIN組細(xì)胞中，TNF-α+Z-VAD處理后的細(xì)胞活力比TNF-α處理組下降(P＜0.05)，而加入TNF-α+Z-VAD+Nec-1處理后，細(xì)胞活力與TNF-α+Z-VAD處理組比明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

5 沉默SHARPIN表達(dá)，Rip1和Rip3表達(dá)增強(qiáng)

轉(zhuǎn)染 si-SHARPIN至 LNCaP-AI細(xì)胞，并設(shè)置blank control和negative control組，用DAPI(藍(lán)光)標(biāo)定細(xì)胞核，再分別用Rip1兔單克隆抗體和Rip3小鼠單克隆抗體孵育細(xì)胞，熒光II抗標(biāo)定Rip1(綠光)和Rip3(紅光)，發(fā)現(xiàn)抑制SHARPIN表達(dá)后，LNCaP-AI細(xì)胞內(nèi)的Rip1和Rip3蛋白表達(dá)水平上升，見(jiàn)圖5。

Figure 4.Detection of the viability by MTS assay after transfection of si-SHARPIN in the LNCaP-AI cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs negative control group;#P＜0.05 vs TNF-α+si-SHARPIN group;△P＜0.05 vs TNF-α+si-SHARPIN+Z-VAD group.圖4 沉默LNCaP-AI細(xì)胞中SHARPIN的表達(dá)后，MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力

Figure 5.The expression and location of Rip1 and Rip3 proteins in LNCaP-AI cells were observed by the method of immunofluorescence under fluorescence inversion microscope.圖5 下調(diào)LNCaP-AI細(xì)胞SHARPIN的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)并定位Rip1和Rip3

討論

早期前列腺癌可行根治性手術(shù)獲得較好的療效，但前列腺癌病情隱匿，很多病人確診時(shí)往往已是中晚期［6］。對(duì)于晚期前列腺癌，內(nèi)分泌治療為首選方案，在產(chǎn)生去勢(shì)抵抗前，大部分患者可取得較為滿意的療效，但經(jīng)過(guò)14～30個(gè)月的平均緩解期后，大多病人都會(huì)進(jìn)展為CRPC，此時(shí)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)雄激素非依賴，對(duì)內(nèi)分泌治療耐受，成為臨床上前列腺癌治療的難點(diǎn)。目前對(duì)于CRPC的治療主要有抗雄激素治療、免疫治療和分子靶向治療，但相關(guān)治療方案并不能徹底殺滅CRPC細(xì)胞，CRPC細(xì)胞不受控制地增殖或者轉(zhuǎn)移均極大影響患者的預(yù)后。

有研究指出在雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy，ADT)后，雄激素水平降低，在低雄激素環(huán)境中AR的蛋白表達(dá)量可增加25倍，而且具有自主調(diào)節(jié)性的核內(nèi)AR蛋白過(guò)分穩(wěn)定，可抑制CRPC細(xì)胞DNA的再聚集和細(xì)胞凋亡［7］;另外，CRPC細(xì)胞可通過(guò)高表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1抑制細(xì)胞凋亡，影響患者預(yù)后［8］，具有凋亡耐受特性的細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，因此，我們?cè)噲D尋找一種區(qū)別于凋亡的細(xì)胞死亡方式誘導(dǎo)CRPC細(xì)胞死亡，達(dá)到緩解患者病情的目的。

既往認(rèn)為凋亡是細(xì)胞唯一的程序性死亡，而細(xì)胞壞死則被認(rèn)為是非可控的被動(dòng)生物學(xué)行為，后來(lái)研究表明，細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡過(guò)程也是受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控的［9-10］。壞死性凋亡是一種有別于凋亡的細(xì)胞死亡方式，它往往不依賴凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子caspase，在凋亡受到抑制的情況下可介導(dǎo)細(xì)胞死亡;它具有壞死樣的細(xì)胞形態(tài)改變，往往出現(xiàn)細(xì)胞膜的完整性缺失，可以特異性地被小分子Nec-1所抑制［9-10］。壞死性凋亡與諸多生理病理現(xiàn)象相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)necroptosis與缺血性損傷、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、惡性腫瘤以及病毒感染等疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［9-11］。近期在肺癌治療的研究顯示，F(xiàn)TY720可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡達(dá)到治療肺癌的目的［12］。另外在ALL及卵巢癌治療中有研究顯示:通過(guò)藥物誘導(dǎo)凋亡抵抗的腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡，繼而有效殺滅腫瘤細(xì)胞［13-14］。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中，用Plk1小分子抑制劑BI2536阻斷 Plk1可以抑制LNCaP-AI細(xì)胞增殖，但在這過(guò)程中并未激活凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子caspase-3，進(jìn)一步通過(guò)共聚焦成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞啟動(dòng)了壞死性凋亡程序，表明LNCaP-AI細(xì)胞可以通過(guò)激活壞死性凋亡程序抑制其增殖［15］。

Rip1是啟動(dòng)壞死性凋亡的重要上游調(diào)控點(diǎn)，抑制Rip1活性后，可阻礙復(fù)合物Ⅱb形成從而抑制細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。N-末端激酶結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C-末端可與TRADD結(jié)合的死亡結(jié)構(gòu)域是Rip1結(jié)構(gòu)上的主要3個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中N-末端Ser/Thr激酶結(jié)構(gòu)域是壞死性凋亡所必須的［16］，而中間結(jié)構(gòu)域的Lys377位點(diǎn)是調(diào)控Rip1泛素化修飾水平的重要位點(diǎn)，當(dāng)Rip1被線性泛素鏈組裝復(fù)合體(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)等泛素化修飾后可激活 NF-κB通路，抑制壞死性凋亡的發(fā)生。SHARPIN作為L(zhǎng)UBAC成員之一，在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。有研究報(bào)道，在SHARPIN基因敲除小鼠中可觀察到小鼠內(nèi)臟器官出現(xiàn)壞死性凋亡，而將其與Rip1激酶區(qū)域敲除小鼠雜交后，可減輕壞死性凋亡的程度［17-18］，表明SHARPIN與Rip1之間可能存在相互調(diào)控的關(guān)系。相互作用蛋白同型相互作用結(jié)構(gòu)域(receptor-interacting protein homotypic interaction motif，RHIM)是Rip3與Rip1的結(jié)合部位，當(dāng)Rip3與RHIM結(jié)合后可以通過(guò)激活MLKL促進(jìn)壞死性凋亡程序介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。C末端為 Rip1與 caspase-8的結(jié)合部位［19］，通過(guò)與caspase 8結(jié)合及誘導(dǎo)下游分子作用從而介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Rip1的調(diào)控是細(xì)胞存亡的核心環(huán)節(jié)，由于CRPC細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白表達(dá)異常升高，所以由Rip1所誘導(dǎo)的壞死性凋亡機(jī)制對(duì)抑制甚至殺滅CRPC細(xì)胞有重要意義。因此，激活Rip1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)壞死性凋亡，為CRPC的靶向治療提供了新的思路。

我們的研究結(jié)果表明，在TNF-α誘導(dǎo)下，并用caspase抑制劑Z-VAD刺激LNCaP-AI細(xì)胞后細(xì)胞死亡增加，而進(jìn)一步加入壞死性凋亡抑制劑Nec-1，細(xì)胞死亡效應(yīng)減弱，提示壞死性凋亡參與誘導(dǎo)LNCaPAI細(xì)胞的死亡。另外，我們還發(fā)現(xiàn)激素依賴的LNCaP細(xì)胞被誘導(dǎo)成為L(zhǎng)NCaP-AI細(xì)胞后，腫瘤因子SHARPIN表達(dá)水平進(jìn)一步升高，沉默SHARPIN可以激活Rip1及其下游因子Rip3，從而使LNCaP-AI細(xì)胞的壞死性凋亡比例升高。綜上所述，壞死性凋亡的死亡機(jī)制為CRPC的基因靶向治療提供了依據(jù)，但目前壞死性凋亡的上、下游調(diào)控機(jī)制仍然未完全闡明，有待進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯:林白霜，羅 森)

Activation of Rip1 promotes necroptosis in LNCaP-AI cells via inhibiting SHARPIN

WANG Gan-ping1，HUANG Hai1，CHEN Xian-ju1，LAI Yi-ming1，LIN Chun-hao1，ZENG Le-xiang2，CAO Yi3，ZHANG Yi-ming4，YU Yong-sheng5，GUO Zheng-hui1

(1Department of Urology，2Department of Pediatric Surgery，3Department of Emergency Surgery，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;4Department of Urology，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510282，China;5Department of Urology，Boji Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University，Guangzhou 511300，China.E-mail:2352236171@qq.com)

AIM:To explore the role of SHARPIN in regulation of Rip1 in castration-resistant prostate cancer LNCaP-AI cells.METHODS:The LNCaP-AI cells were treated with TNF-α+Z-VAD(an inhibitor of pan-caspase)to activate necroptosis，which were compared to the cells treated with TNF-α+Z-VAD+Nec-1(an inhibitor of Rip1).A blank group and a TNF-α-treated group were set up as controls.The cell viability in each group was measured by MTS assay.In addition，SHARPIN was knocked down by siRNA，and the inhibitory efficiency was evaluated by RT-qPCR.The expression of Rip1 at mRNA and protein levels after knocking down SHARPIN was determined by RT-qPCR and Western blot to explore the underlying mechanism of regulatory network of necroptosis in prostate cancer.RESULTS:Compared with blank control group and TNF-α-treated group，the viability of LNCaP-AI cells treated with TNF-α+Z-VAD decreased by 28%(P＜0.05).After treated with TNF-α+Z-VAD+Nec-1，the LNCaP-AI cells showed no significant difference in the viability compared with blank control and TNF-α-treated groups.Taken together，necroptosis may be an important way of cell death in LNCaP-AI cells.Besides，the expression of Rip1 at protein level was up-regulated following the inhibition of SHARPIN using siRNA，indicating that down-regulation of SHARPIN enhanced necroptosis via activating Rip1 inLNCaP-AI cells.CONCLUSION:Necroptosis is an important way of cell death.Inhibition of oncogenic factor SHARPIN enhances necroptosis via activating Rip1 in LNCaP-AI cells.

Castration-resistant prostate cancer;LNCaP-AI cells;Rip1;SHARPIN;Necroptosis

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.010

1000-4718(2016)07-1214-07

2016-04-19

2016-06-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272807);廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2014A020212018);廣東省醫(yī)學(xué)研究資助項(xiàng)目(No.A2015113)

△Tel:020-34070960;E-mail:2352236171@qq.com