SAHA對發(fā)育期大鼠驚厥后海馬TLR4/MYD88信號通路及神經(jīng)元凋亡的影響

胡擎鵬， 黃湘壹

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院1兒科，2功能檢查科，湖南衡陽421001)

SAHA對發(fā)育期大鼠驚厥后海馬TLR4/MYD88信號通路及神經(jīng)元凋亡的影響

胡擎鵬1， 黃湘壹2△

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院1兒科，2功能檢查科，湖南衡陽421001)

目的:探討組蛋白去乙?；敢种苿┓⒅Z他(即辛二酰苯胺異羥肟酸，SAHA)在驚厥性腦損傷發(fā)病中的作用及機(jī)制。方法:32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為control組、戊四唑(pentylenetetrazole，PTZ)組、PTZ+10 mg/kg SAHA組及PTZ+50 mg/kg SAHA組，通過腹腔注射PTZ制作發(fā)育期大鼠驚厥模型，SAHA于PTZ誘導(dǎo)驚厥前2 h腹腔注射給藥。本實驗中PTZ造模成功率約85%，注射后約30 min到1 h后出現(xiàn)驚厥發(fā)作，評估驚厥發(fā)作的等級。驚厥后24 h處死大鼠，RT-qPCR及Western blot檢測海馬組織TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá);HE染色觀察腦組織病理變化;TUNEL染色檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。結(jié)果:(1)PTZ組均達(dá)到Ⅳ～V級驚厥發(fā)作，而SAHA預(yù)處理能減輕驚厥發(fā)作的等級;(2)PTZ組大鼠海馬組織中TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)均較對照組顯著增高(P＜0.05)，而SAHA預(yù)處理能抑制mRNA和相應(yīng)蛋白表達(dá)水平的增高;(3)HE染色可見PTZ組明顯的細(xì)胞水腫及神經(jīng)元凋亡，伴有較多的炎癥細(xì)胞浸潤，而SAHA預(yù)處理能減輕細(xì)胞水腫及神經(jīng)元凋亡，同時減少炎癥細(xì)胞浸潤;(4)大鼠海馬組織中的神經(jīng)元凋亡數(shù)PTZ組較對照組顯著增加(P＜0.05)，而SAHA預(yù)處理能抑制海馬神經(jīng)元的凋亡;(5)相對于10 mg/kg SAHA治療組，50 mg/kg SAHA治療作用更明顯(P＜0.05)。結(jié)論:組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA能抑制驚厥后TLR4/MYD88炎癥信號通路和海馬神經(jīng)元的凋亡，從而減少炎癥反應(yīng)及驚厥性腦損傷。

組蛋白去乙?；敢种苿?伏立諾他;驚厥;海馬

驚厥是嬰幼兒時期常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，能導(dǎo)致發(fā)育期不同程度腦損傷，其在兒童時期的發(fā)生率較一般人群高5～10倍，尤以1歲以內(nèi)小兒的驚厥發(fā)病率最高，發(fā)生率約占全體兒童的4%～6%，其中20%表現(xiàn)為反復(fù)驚厥發(fā)作或驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion，SC)。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是TLRs家族中的一員，在腦組織中主要表達(dá)于海馬的小膠質(zhì)細(xì)胞，其激活信號傳導(dǎo)有2個通路，髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MYD88)依賴性信號通路和非MYD88依賴性信號通路［1］。研究報道TLR4/MYD88與炎癥、缺血缺氧、創(chuàng)傷和興奮性中毒等引起的腦損傷有密切關(guān)系［2］，但在驚厥模型中TLR4/MYD88信號通路的作用國內(nèi)外還很少報道。伏立諾他(vorinostat;即辛二酰苯胺異羥肟酸，suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)為當(dāng)下研究得最多、最深入的一類異羥肟酸組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)［3］，在Kyoko Takahashi等［4］報道的腸內(nèi)皮細(xì)胞及LPS誘導(dǎo)的炎癥動物模型中，HDACi可以通過調(diào)控染色質(zhì)組蛋白乙酰化水平，減少TLR4及NF-κB p65基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制TLR4/MYD88信號通路，減少炎癥因子的生成，SAHA在驚厥性腦損傷病理過程中是否存在同樣的作用有待進(jìn)一步研究。本實驗組在前期的研究中，通過發(fā)育期大鼠驚厥模型的建立，觀察了驚厥后大鼠海馬區(qū)甘氨酸受體α1、α2亞單位和caspase-1、IL-18的表達(dá)變化，本實驗旨在通過類似模型，進(jìn)一步觀察驚厥后大鼠海馬組織TLR4、MYD88、NF-κB p65和IL-1β的mRNA及其相應(yīng)蛋白的表達(dá)變化及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的變化，探討SAHA在抑制大鼠發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料和方法

1 實驗動物及分組

20 日齡健康雄性SD大鼠32只(南華大學(xué)實驗動物中心提供)，所有動物隨機(jī)分為control組、PTZ組、PTZ+SAHA低劑量(10 mg/kg)組和PTZ+SAHA高劑量(50 mg/kg)組，每組8只。

2 主要儀器與試劑

PTZ和 SAHA(Sigma);TLR4、MYD88、NF-κB p65和IL-1β抗體(Abcam);ECL化學(xué)發(fā)光劑(Santa Cruz);cDNA逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR試劑盒(Promega); Trizol試劑(Gibco-BRL);TUNEL凋亡試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。實時定量PCR儀(Roche)

3 主要方法

3.1 大鼠驚厥模型的建立 通過腹腔注射PTZ(80 mg/kg)復(fù)制大鼠驚厥動物模型［5］，驚厥發(fā)作級別參考Racine分級標(biāo)準(zhǔn)［6］;對照組僅注射生理鹽水。低劑量(10 mg/kg)和高低劑量(50 mg/kg)SAHA于PTZ注射前2 h腹腔給藥。驚厥后24 h處死大鼠，留取海馬組織標(biāo)本，部分用4%多聚甲醛固定，做病理切片及TUNEL免疫組化染色，其余部分迅速保存于－80℃，用于Western blot及RT-qPCR檢測。

3.2 HE染色 將組織切片在60℃恒溫箱中烘烤30 min，然后置于松節(jié)油中浸泡30 min脫蠟，置于不同濃度梯度乙醇(從高到低)中脫去松節(jié)油，用蒸餾水洗5 min除去乙醇并水化。蘇木精染色切片15 min，細(xì)胞核被染成紫蘭色，自來水沖洗2 min。將組織切片置于0.5%鹽酸乙醇中30 s分化，自來水沖洗20 min。伊紅染液染色30 s，細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色，自來水沖洗30 s去浮色。切片經(jīng)濃度梯度乙醇脫水(從低到高)，二甲苯浸泡透明，隨后用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色下腦組織病理變化。

3.3 TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡 海馬組織經(jīng)4% 多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片(厚度約3 μm)、脫蠟水化。標(biāo)本片加0.01 mol/L TBS洗2 min 3次，按每張切片取TdT和DIG-dUTP各1 μL，加入18 μL標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液20 μL，然后置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)2 h。用0.01 mol/L TBS清洗后加封閉液50 μL，室溫30 min，后加入生物素化抗地高辛抗體，置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30 min。加入1∶100稀釋的SABC，37℃反應(yīng)30 min，隨后DAB顯色及蘇木素復(fù)染。光鏡下對每張切片隨機(jī)選取面積相同的5個高倍視野(×400)，肉眼計數(shù)每個高倍視野TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)，然后取平均值。結(jié)果判定:細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

3.4 Western blot檢測TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β的蛋白表達(dá)量 ?。?0℃保存的海馬組織，勻漿后加適量RIPA裂解液及PMSF蛋白酶抑制劑，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。每個標(biāo)本取30 μg蛋白樣本經(jīng)10%SDSPAGE凝膠電泳，此后在低溫下將目的蛋白用電濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(PVDF膜在使用前用無水甲醇浸泡5 min)，5% 脫脂牛奶在37℃下封閉1 h，然后分別加TLR4(1∶1 000)、MYD88(1∶2 000)、NF-κB P65(1∶2 000)及IL-1β(1∶500)抗體，4℃孵育過夜。PBST清洗3次后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔II抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h，再次用PBST清洗3次后加入化學(xué)發(fā)光底物ECL顯色1 min，用Image QuantTMLAS 4000成像系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

3.5 RT-qPCR方法檢測TLR4、MYD88、NF-κB P65 和IL-1β的mRNA表達(dá)量 采用TRIzol試劑盒進(jìn)行海馬組織總RNA提取，用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈，用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒在實時定量PCR儀上進(jìn)行DNA擴(kuò)增，步驟均按說明說進(jìn)行。RT-qPCR引物見表1，RT-qPCR循環(huán)擴(kuò)增條件如下:95℃ 45 s，55～58℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán);循環(huán)結(jié)束后4℃冷卻。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較使用Bonferroni檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 驚厥發(fā)作等級計數(shù)及分級評分

本實驗予PTZ 80 mg/kg復(fù)制驚厥模型及予不同劑量SAHA干預(yù)治療，觀察不同組驚厥發(fā)作級別。驚厥等級評分SAHA高、低劑量干預(yù)組顯著低于PTZ 組(P＜0.05)，且PTZ+SAHA高劑量(50 mg/kg)組顯著低于PTZ+SAHA低劑量(10 mg/kg)組(P＜0.05)，見表2。

表2 大鼠驚厥發(fā)作等級計數(shù)及評分Table 2.The rats in different seizure stages were counted and mean seizure score was analyzed

2 HE染色觀察腦組織病理學(xué)改變

發(fā)育期大鼠驚厥后24 h，HE染色后光鏡下觀察腦組織病理學(xué)改變;正常對照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核大而圓，染色均勻，呈淡藍(lán)色，細(xì)胞壁完整，未見神經(jīng)元變性，水腫及壞死;PTZ組出現(xiàn)神經(jīng)元體積增大，細(xì)胞水腫明顯，核溶解、碎裂，核固縮深染，細(xì)胞形態(tài)不完整，可見大量神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞碎片，伴有較多的炎癥細(xì)胞浸潤;PTZ+10 mg/kg SAHA組仍可見較多的神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞碎片，但細(xì)胞水腫較前有所減輕;PTZ+50 mg/kg SAHA組與PTZ組比較細(xì)胞水腫明顯減輕，細(xì)胞體積及形態(tài)大部分正常，僅有少許的神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞碎片，同時炎癥細(xì)胞浸潤較前減少，見圖1。

3 SAHA抑制PTZ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡

Figure 1.The pathological changes of the brain tissues in hippocampal CA1 region after seizure observed with HE staining(×400).圖1 HE染色觀察腦組織病理學(xué)改變

TUNEL染色測定發(fā)育期大鼠驚厥后24 h海馬組織神經(jīng)元凋亡的數(shù)量見圖2，TUNEL染色陽性可見細(xì)胞核中有棕黃色或棕色著染，并伴有核膜裂解，染色質(zhì)濃縮和邊緣化等現(xiàn)象;正常細(xì)胞核染色呈藍(lán)色。PTZ組在海馬CA1區(qū)有大量的TUNEL染色陽性細(xì)胞，與對照組相比神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著增加(P＜0.05);SAHA高劑量或低劑量均能顯著抑制PTZ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的凋亡(P＜0.05)，其中以高劑量組的抑制更明顯(P＜0.05)。

Figure 2.Seizure-induced neuronal apoptosis in hippocampal CA1 region detected by TUNEL staining(×400).Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs PTZ group;#P＜0.05 vs PTZ+10 mg/ kg SAHA group.圖2 TUNEL染色檢測大鼠海馬CA1區(qū)凋亡的神經(jīng)元數(shù)目

4 SAHA減少TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β的mRNA水平

RT-qPCR結(jié)果顯示PTZ組TLR4、MYD88、NF-κB和IL-1β mRNA水平較對照組顯著增高(P＜0.05)，低劑量SAHA預(yù)處理對TLR4及P65的mRNA有顯著的抑制作用(P＜0.05)，其余組抑制作用不明顯;予50 mg/kg SAHA干預(yù)治療可以顯著抑制PTZ誘導(dǎo)的信號通路各組的mRNA水平(P＜0.05);其中TLR4、MYD88和IL-1β的表達(dá)量在50 mg/kg SAHA治療組顯著低于10 mg/kg SAHA治療組(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of SAHA on the mRNA expression of TLR4，MYD88，NF-κB P65 and IL-1β in rat hippocampal region.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs PTZ group;#P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs PTZ+50 mg/kg SAHA group.圖3 SAHA對大鼠海馬區(qū)TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

5 SAHA減少TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β的蛋白水平

Western blot結(jié)果顯示，PTZ組 TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β蛋白水平較對照組顯著增高(P＜0.05)，予 10 mg/kg SAHA干預(yù)治療除了對TLR4蛋白增高有顯著的抑制作用(P＜0.05)，其余組抑制作用不明顯;予50 mg/kg SAHA干預(yù)治療可以顯著抑制PTZ誘導(dǎo)的信號通路各組蛋白水平增高(P＜0.05);其中TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β蛋白表達(dá)量在50 mg/kg SAHA治療組均顯著低于10 mg/kg SAHA治療組(P＜0.05)，見圖4。

討論

國內(nèi)已建立新生鼠吸入三氟乙醚致驚厥模型，對驚厥后膠質(zhì)細(xì)胞的變化、炎癥因子和凋亡蛋白的表達(dá)、突觸可塑性的改變進(jìn)行過研究，證實了這些病理變化對發(fā)育中腦功能以及驚厥的作用機(jī)制具有重要價值。為進(jìn)一步探討驚厥的發(fā)病機(jī)制和尋求驚厥性腦損傷的治療途徑，我們選擇了神經(jīng)元的凋亡和 TLR4/MYD88信號通路作為研究對象。PTZ誘導(dǎo)的驚厥與大量谷氨酸的釋放有關(guān)，且這個模型造成的驚厥活動和腦損傷類似于人類顳葉癲癇模型［7］，與臨床研究更為接近，PTZ制作的發(fā)育鼠及成年鼠的驚厥模型在國內(nèi)外都已經(jīng)被反復(fù)證實可靠、重復(fù)性好。國內(nèi)外關(guān)于發(fā)育期驚厥發(fā)作的動物模型少有報道，既往僅有三氟乙醚吸入［8］、七氟乙醚吸入［9］、Jensen等制作的梯度缺氧［10］及PTZ藥物注射的動物模型，但前三者為氣體藥物，難以掌控動物的驚厥程度，且操作較復(fù)雜，故在本實驗中我們選擇了相對更為簡便、可行的PTZ模型。

Figure 4.The effects of SAHA on the protein expression of TLR4，MYD88，NF-κB P65 and IL-1β in rat hippocampal region.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs PTZ group;#P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs PTZ+50 mg/kg SAHA group.圖4 SAHA對大鼠海馬區(qū)TLR4、MYD88、NF-κB P65和IL-1β蛋白表達(dá)的影響

在驚厥性腦損傷發(fā)生過程中，神經(jīng)元壞死和細(xì)胞凋亡是腦損傷的基本形式。神經(jīng)元凋亡可能與海馬CA1區(qū)存在大量的谷氨酸受體［11］、鈣超載、氧自由基、炎性反應(yīng)等多種因素有關(guān)。在本實驗中，HE染色可見PTZ誘導(dǎo)的驚厥導(dǎo)致了大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元體積增大，細(xì)胞水腫明顯，可見大量神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞碎片，伴有較多的炎癥細(xì)胞浸潤;TUNEL染色檢測到PTZ組神經(jīng)元的凋亡較對照組顯著增多，提示驚厥后神經(jīng)元損傷具有典型凋亡特征，因而進(jìn)一步證實了神經(jīng)元的凋亡參與了驚厥性腦損傷的病理過程，這與既往的研究報道一致［12］。

TLR4是Toll樣受體家族中的一員，在腦組織中主要表達(dá)于海馬的小膠質(zhì)細(xì)胞，可參與炎癥介質(zhì)的釋放和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。MYD88是TLR4重要的銜接蛋白，可以導(dǎo)致下游因子NF-κB P65的活化和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡酶caspase-3的激活而最終導(dǎo)致腦損傷的形成［13］。NF-κB是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的核蛋白，是TLR4介導(dǎo)的MYD88依賴性信號通路的一種關(guān)鍵成分，當(dāng)細(xì)胞受到外界因素，如感染、炎癥等刺激后，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于特異性DNA位點，通過誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄從而增加IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的分泌［14］。白細(xì)胞介素IL-1β是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并可作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子。IL-1β在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)各種途徑誘發(fā)的驚厥模型大鼠腦組織IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)增加，且均與驚厥性腦損傷的發(fā)生有關(guān)［15］。在本實驗中RT-qPCR和Western blot測定了驚厥后TLR4、MYD88、NF-κB p65及IL-1β mRNA和蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)驚厥后PTZ組各指標(biāo)的含量較對照組顯著增加，證實了TLR4/MYD88信號通路參與了驚厥性腦損傷的病理過程。

SAHA是一類異羥肟酸HDACi，可提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙酰化，從而調(diào)控基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化［16］。目前關(guān)于HDACi在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究主要集中在缺血性腦卒中、多發(fā)性硬化、亨廷頓氏舞蹈癥等［17］，很少有關(guān)于HDACi在驚厥方面的報道。在本研究中，PTZ誘導(dǎo)的驚厥導(dǎo)致了TLR4/MYD88信號通路mRNA和蛋白顯著增加及神經(jīng)元的凋亡，而SAHA預(yù)處理對TLR4/MYD88信號通路及神經(jīng)元的凋亡有抑制作用，表明SAHA可以通過抑制炎癥介質(zhì)和神經(jīng)元的凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用。SAHA抑制TLR4/MYD88信號通路，保護(hù)腦損傷可能的機(jī)制如下:(1)SAHA通過抑制組蛋白去乙?；?，降低TLR4/MYD88信號通路基因的表達(dá)，進(jìn)而減少下游因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的合成［18］;(2) SAHA誘導(dǎo)高乙?；磻?yīng)，通過增加抗炎癥因子IL-4、IL-10和TGF-β的表達(dá)，從而起到腦損傷的保護(hù)作用;(3)在單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中，SAHA使熱休克蛋白90乙?；?，造成其與IL-1受體相關(guān)激酶1 (IL-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)失聯(lián)，使IRAK1降解，從而間接抑制 TLR4/MYD88信號通路［19］。也有報道指出，SAHA可以促進(jìn)炎癥介質(zhì)如IL-1β、IL-6的生成，這可能是與激活了NF-κB依賴性信號通路有關(guān)［20］，在Stammler等［21］研究中發(fā)現(xiàn)，在人類和小鼠樹突狀細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞中，HDAC1如SAHA能促進(jìn)炎癥因子IL-1β的成熟與分泌，這種促進(jìn)作用完全不依賴于傳統(tǒng)的炎癥通路的激活，而主要是通過caspase-8依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制從而促進(jìn)IL-1β等炎癥介質(zhì)的合成。在本實驗中，SAHA能抑制TLR4/MYD88信號通路及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，這與既往的大多數(shù)研究保持一致。同時從實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，SAHA在劑量為50 mg/kg比10 mg/kg對神經(jīng)元的凋亡和TLR4/MYD88炎癥信號通路的抑制作用更明顯，說明SAHA對損傷腦組織的保護(hù)作用與劑量有關(guān)。

［1］ Larochelle A，Bellavance MA，Rivest S.Role of adaptor protein MyD88 in TLR-mediated preconditioning and neuroprotection after acute excitotoxicity［J］.Brain Behav Immun，2015，46:221-231.

［2］ Ferreira MJ，Lima C，Lopes-Ferreira M.Anti-inflammatory effect of Natterins，the major toxins from the Thalassophryne nattereri fish venom is dependent on TLR4/ MyD88/PI3K signaling pathway［J］.Toxicon，2014，87: 54-67.

［3］ Duncan HF，Smith AJ，F(xiàn)leming GJ，et al.Transcriptional profiling of suberoylanilide hydroxamic acid(SAHA)regulated genes in mineralizing dental pulp cells at early and late time points［J］.Genom Data，2015，5:391-393.

［4］ Takahashi K，Sugi Y，Hosono A，et al.Epigenetic regulation of TLR4 gene expression in intestinal epithelial cells for the maintenance of intestinal homeostasis［J］.J Immunol，2009，183(10):6522-6529.

［5］ Ozsoy S，Aydin D，Ekici F.Effects of modafinil on pentylenetetrazol-induced convulsive epilepsy［J］.Bratisl Lek Listy，2015，116(3):162-166.

［6］ Groot LJ，Gosens N，Vles JS，et al.Inter-and intraobserver agreement of seizure behavior scoring in the amygdala kindled rat［J］.Epilepsy Behav，2015，42:10-13.

［7］ Choopankareh S，Vafaee F，Shafei MN，et al.Effects of melatonin and theanine administration on pentylenetetrazole-induced seizures and brain tissue oxidative damage in ovariectomized rats［J］.Turk J Med Sci，2015，45 (4):842-849.

［8］ Garau C，Miralles A，García-Sevilla JA.Chronic treatment with selective I2-imidazoline receptor ligands decreases the content of pro-apoptotic markers in rat brain［J］.J Psychopharmacol，2013，27(2):123-134.

［9］ Wang XS，Chen YY，Shang XF，et al.Idazoxan attenuates spinal cordinjury by enhanced astrocytic activation and reduced microglial activationin rat experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Brain Res，2009，1253: 198-209.

［10］Li F，Zhang ZX，Liu YF，et al.2-BFI ameliorates EAE-induced mouse spinal cord damage:effective therapeutic time window and possible mechanisms［J］.Brain Res，2012，1483:13-19.

［11］Goudarzi E，Elahdadi Salmani M，Lashkarbolouki T，et al.Hippocampal orexin receptors inactivation reduces PTZ induced seizures of male rats［J］.Pharmacol Biochem Behav，2015，130:77-83.

［12］Saha L，Chakrabarti A，Kumari S，et al.Antiapoptotic and neuroprotective role of Curcumin in Pentylenetetrazole (PTZ)induced kindling model in rat［J］.Indian J Exp Biol，54(2):133-141.

［13］Wang X，Stridh L，Li W，et al.Lipopolysaccharide sensitizes neonatal hypoxic-ischemic brain injury in a MyD88-dependent manner［J］.J Immunol，2009，183(11): 7471-7477.

［14］Ding Y，Yang H，Xiang W，et al.CD200R1 agonist attenuates LPS-induced inflammatory response in human renal proximal tubular epithelial cells by regulating TLR4-MyD88-TAK1-mediated NF-κB and MAPK pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，460(2):287-294.

［15］Kaur H，Patro I，Tikoo K，et al.Curcumin attenuates inflammatory response and cognitive deficits in experimental model of chronic epilepsy［J］.Neurochem Int，2015，89: 40-50.

［16］Sewal AS，Patzke H，Perez EJ，et al.Experience modulates the effects of histone deacetylase inhibitors on gene and protein expression in the hippocampus:impaired plasticity in aging［J］.J Neurosci，2015，35(33):11729-11742.

［17］Faraco G，Pancani T，F(xiàn)ormentini L，et al.Pharmacological inhibition of histone deacetylases by suberoylanilide hydroxamic acid specifically alters gene expression and reduces ischemic injury in the mouse brain［J］.Mol Pharmacol，2006，70(6):1876-1884.

［18］Wang D，Zhao M，Chen G，et al.The histone deacetylase inhibitor vorinostat prevents TNFα-induced necroptosis by regulating multiple signaling pathways［J］.Apoptosis，2013，18(11):1348-1362.

［19］Chong W，Li Y，Liu B，et al.Histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid attenuates Toll-like receptor 4 signaling in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages［J］.J Surg Res，2012，178(2):851-859.

［20］van den Bosch T，Boichenko A，Leus NG，et al.The histone acetyltransferase p300 inhibitor C646 reduces pro-inflammatory gene expression and inhibits histone deacetylases［J］.Biochem Pharmacol，2016，102:130-140.

［21］Stammler D，Eigenbrod T，Menz S，et al.Inhibition of histone deacetylases permits lipopolysaccharide-mediated secretion of bioactive IL-1β via a caspase-1-independent mechanism［J］.J Immunol，2015，195(11):5421-5431.

(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effects of SAHA on hippocampal TLR4/MYD88 signaling and neuronal apoptosis after seizure in developing rats

HU Qing-peng1，HUANG Xiang-yi2

(1Department of Pediatrics，2Department of Function Examination，The Second Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001，China.E-mail:yanguowuhen0011@sina.com)

AIM:To investigate the effect of vorinostat(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)，a histone deacetylase inhibitor，on seizure-induced brain damage in developing rats and its mechanism.METHODS:Male Sprague-Dawley rats(n=32)were randomly divided into control group，pentylenetetrazole(PTZ)group，PTZ+10 mg/kg SAHA group and PTZ+50 mg/kg SAHA group.Intraperitoneal injection of PTZ was used to induce rat seizure.SAHA was injected intraperitoneally 2 h before PTZ injection.The rats in different seizure stages were counted and mean seizure score was analyzed at 30～60 min after PTZ injection.Hippocampal tissues were sampled at 24 h after seizures.The expression of TLR4，MYD88，NF-κB P65 and IL-1β at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot，respectively.The pathological changes of the brain tissues were observed by HE staining.The apoptotic neurons were observed by TUNEL staining.RESULTS:The mRNA and protein levels of TLR4，MYD88，NF-κB P65 and IL-1β，the apoptosis of neurons，the inflammation reaction and mean seizure score significantly increased after PTZ treatment(P＜0.05)，and these effects were attenuated by treatment with SAHA.Compared with PTZ+10 mg/kg SAHA group，PTZ+50 mg/kg SAHA group showed more significant protective effect against seizure-induced brain damage.CONCLUSION:Histone deacetylase inhibitor SAHA suppresses seizure-induced TLR4/MYD88 signaling and reduces apoptosis of neurons，suggesting a protective effect against brain damage associated with seizure in developing rats.

Histone deacetylase inhibitor;Vorinostat;Seizure;Hippocampus

R741.02;R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2016.07.009

1000-4718(2016)07-1208-06

2016-01-11

2016-04-18

△Tel:15886473686;E-mail:yanguowuhen0011@sina.com