硫化氫在ob/ob小鼠皮膚創(chuàng)面愈合中的作用與調(diào)控機(jī)制*

趙蕙琛， 柴家超， 鄭 杰， 王媛妹， 王園園， 郭秀芝， 管慶波， 劉元濤

(山東大學(xué)第二醫(yī)院1內(nèi)分泌科，4心內(nèi)科，5腎內(nèi)科，山東濟(jì)南250033;2青島市立醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東青島266071;山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院3兒外科，7內(nèi)分泌科，山東濟(jì)南250021;6泰安市中心醫(yī)院分院職二科，山東泰安271000)

硫化氫在ob/ob小鼠皮膚創(chuàng)面愈合中的作用與調(diào)控機(jī)制*

趙蕙琛1，2， 柴家超3， 鄭 杰4， 王媛妹1， 王園園5， 郭秀芝6， 管慶波7△， 劉元濤2△

(山東大學(xué)第二醫(yī)院1內(nèi)分泌科，4心內(nèi)科，5腎內(nèi)科，山東濟(jì)南250033;2青島市立醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東青島266071;山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院3兒外科，7內(nèi)分泌科，山東濟(jì)南250021;6泰安市中心醫(yī)院分院職二科，山東泰安271000)

目的:觀察硫化氫(H2S)對(duì)ob/ob小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響并探討其作用機(jī)制。方法:將ob/ob小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、胰島素組和NaHS(H2S供體)組，C57BL/6小鼠作為對(duì)照組，構(gòu)建小鼠背部皮膚創(chuàng)面模型。干預(yù)后檢測(cè)各組H2S釋放量;用Western blot檢測(cè)胱硫醚γ-裂解酶(CSE)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表達(dá)差異;用RT-qPCR檢測(cè)CSE的mRNA表達(dá)變化;使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量;使用ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6的水平;用Masson染色檢測(cè)膠原沉積情況。結(jié)果:ob/ob小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織中H2S釋放及CSE蛋白、mRNA的表達(dá)水平以及膠原沉積顯著低于C57BL/6小鼠(P＜0.05)。外源性H2S可加速ob/ob小鼠皮膚創(chuàng)面愈合(P＜0.05)，增加膠原沉積。ob/ob小鼠創(chuàng)面中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量，TNF-α、IL-6的水平及MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)，NaHS組顯著降低。結(jié)論:H2S可顯著改善糖尿病難愈性潰瘍的愈合，作用機(jī)制可能與其抗炎作用有關(guān)。

糖尿病;創(chuàng)面愈合;硫化氫;胱硫醚γ-裂解酶;抗炎作用

糖尿病足是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，常引起較高的致殘率和致死率［1］。近年來(lái)研究表明，糖尿病持續(xù)炎癥狀態(tài)是糖尿病難愈性潰瘍的重要機(jī)制。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者中，中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β等炎癥反應(yīng)因子持續(xù)升高［2］;大量的炎性因子可刺激創(chuàng)面多種細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，分解細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而影響成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞在創(chuàng)面的附著及肉芽組織形成，導(dǎo)致傷口愈合延遲。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化碳(carbon monoxide，CO)及一氧化氮(nitric oxide，NO)后發(fā)現(xiàn)的氣體信號(hào)分子。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，硫化氫是以L(fǎng)-半胱氨酸為底物，在吡哆醛磷酸鹽依賴(lài)性胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)及胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)催化下產(chǎn)生的［3］。CBS主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，而CSE主要分布于外周系統(tǒng)中，特別是血管系統(tǒng)中［4］。在很長(zhǎng)的時(shí)間里，硫化氫被認(rèn)為是一種有毒的氣體，最近研究發(fā)現(xiàn)硫化氫參與到很多生理病理過(guò)程中，尤其對(duì)炎癥反應(yīng)、基質(zhì)金屬蛋白酶等有重要的調(diào)節(jié)作用，最新研究發(fā)現(xiàn)硫化氫可以促進(jìn)糖尿病小鼠的傷口愈合，其機(jī)制可能與恢復(fù)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及激活血管緊張素-1有關(guān)［5］，但是H2S/CSE代謝通路與糖尿病難愈性潰瘍中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及MMPs之間有無(wú)內(nèi)在聯(lián)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本文擬觀察硫化氫在糖尿病傷口愈合的作用，從其對(duì)炎癥的調(diào)控方面探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

C57BL/6及 B6.VLepob/J(leptin-deficient，ob/ ob)小鼠購(gòu)于北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。兔抗CSE購(gòu)于Proteintech。NaHS、兔抗CD68、兔抗EPO和兔抗MMP-9購(gòu)于Abcam。兔抗GAPDH、鼠抗β-actin及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)于北京中杉金橋公司。ECL發(fā)光液、改良型BCA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。小鼠IL-6 ELISA試劑盒及小鼠TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)于聯(lián)科生物科技有限公司。

2 主要方法

2.1 創(chuàng)立糖尿病小鼠創(chuàng)面模型 尾靜脈檢測(cè)ob/ob小鼠的血糖水平，隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L確定為2型糖尿病模型。所有小鼠在乙醚麻醉狀態(tài)下，行背部皮膚全層皮膚切開(kāi)術(shù)，創(chuàng)立直徑9 mm的圓形傷口。將ob/ob小鼠隨機(jī)分為3組:生理鹽水組、胰島素(6 U·kg－1·d－1)組和NaHS(50 μmol·kg－1· d－1)組［5］;C57BL/6組注射生理鹽水作為對(duì)照組。創(chuàng)面創(chuàng)立的時(shí)間設(shè)為第0天，建立后2 h開(kāi)始腹腔注射藥物干預(yù)至創(chuàng)面完全愈合，每隔1 d給創(chuàng)面拍照，使用三腳架保證數(shù)碼相機(jī)距離創(chuàng)面的距離固定，Photoshop CS6軟件計(jì)算創(chuàng)面愈合速率，愈合速率為: 1－(第x天創(chuàng)面面積/第0天創(chuàng)面面積)。分別在創(chuàng)面創(chuàng)立后第3天、第6天或者第10天處死小鼠，第10天處死小鼠前尾靜脈測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。第3天和第6天處死小鼠后快速取創(chuàng)面及周?chē)? cm皮膚放入液氮儲(chǔ)存或者放入4%多聚甲醛中固定，待用。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)過(guò)山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)同意。

2.2 H2S濃度測(cè)定 藥物干預(yù)6 d后，取小鼠背部創(chuàng)面肉芽組織20 mg置于100 mmol/L冰凍磷酸鉀緩沖液中(pH 7.4)勻漿，4℃條件下離心 20 min (14 000 r/min)取上清并用BCA法測(cè)定蛋白濃度，冰上配制反應(yīng)液500 μL(430 μL的組織裂解液，20 μL 10 mmol/L的L-半胱氨酸，20 μL 2 mmol/L的5-磷酸吡多醛，30 μL PBS);將離心管封口，37℃水浴孵育30 min;依次加入250 μL 1%的醋酸鋅、250 μL 10%的三氯醋酸、133 μL 20 mmol/L對(duì)苯二胺鹽酸、133 μL 30 mmol/L三氯化鐵，避光20 min后取300 μL終反應(yīng)液，于670 nm測(cè)量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算H2S的含量，并使用蛋白濃度矯正結(jié)果［5］。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取20 mg肉芽組織于300 μL RIPA及3 μL PMSF中勻漿，冰上裂解1 h，4℃條件下離心30 min(14 000 r/min)，取上清并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，經(jīng)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%TBS封閉1 h，4℃條件下，I抗孵育過(guò)夜;TBST洗膜8 min 4次，1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 II抗室溫孵育1 h;充分洗膜后，ECL顯色;NIH ImageJ 1.42定量分析結(jié)果。

2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 依照已發(fā)表文章［6］的操作步驟提取肉芽組織RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒的說(shuō)明分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，18 s rRNA的上游引物為5’-CGCGGTTCTATTTTGTTGGT-3’，下游引物為5’-AGTCG-GCATCGTTTATGGTC-3’;CSE的上游引物為 5’-CCATCCACGTGGGACAAGAG-3’，下游引物為5’-GCGGCTGTATTCAAAACCCG-3’。

2.5 免疫組織化學(xué)染色法 創(chuàng)面組織固定后經(jīng)石蠟包埋，切成5 μm的切片。經(jīng)脫蠟及水化后，置于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗炎修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液室溫避光孵育25 min，3%BSA室溫封閉30 min，平放于濕盒內(nèi)4°C加I抗孵育過(guò)夜，洗滌后加HRP標(biāo)記的II抗室溫孵育50 min，洗滌后DAB顯色，Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，最后脫水封片，鏡下觀察。

2.6 Masson染色 經(jīng)脫蠟及水化后的肉芽組織切片經(jīng)Weigert氏鐵蘇木素染色5 min;流水沖洗后用1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘;流水沖洗返藍(lán);麗春紅染色5～10 min，超純水快速漂洗;磷鉬酸處理3～5 min;不用水洗，直接用苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min;1%冰醋酸處理1 min;最后封片鏡下觀察。細(xì)胞核呈藍(lán)黑色;膠原纖維呈藍(lán)色;纖維素以及肌纖維顯示紅色。

2.7 ELISA 取肉芽組織10 mg于PBS及PMSF (1∶100)中勻漿，4℃條件下離心20 min(12 000 r/ min)，取上清并用改良型BCA法測(cè)定蛋白濃度。取上清液后根據(jù)ELISA試劑盒的說(shuō)明分別測(cè)量TNF-α 和IL-6的含量，并使用蛋白濃度來(lái)矯正結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)分析，各組測(cè)定值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn);不同時(shí)間和處理4組間的比較使用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，各時(shí)點(diǎn)處的組間比較使用Bonferroni校正t檢驗(yàn);單純4組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，組間比較使用Bonferroni校正t檢驗(yàn);以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 在 ob/ob小鼠中，H2S釋放及 CSE的蛋白及mRNA的表達(dá)水平降低

為確定H2S/CSE代謝通路與糖尿病難愈性潰瘍發(fā)生機(jī)理的關(guān)系，我們首先比較了皮膚及肉芽組織中H2S的濃度在糖尿病小鼠及非糖尿病小鼠中的差異。如圖1所示，糖尿病小鼠的皮膚及肉芽組織中H2S的濃度均顯著下降(P＜0.05)，經(jīng)過(guò)6 d的NaHS治療，肉芽組織中H2S的濃度明顯升高(P＜0.01)。同樣的，CSE的蛋白及mRNA表達(dá)水平在糖尿病小鼠中顯著下降。創(chuàng)面創(chuàng)立后第10天檢測(cè)ob/ ob小鼠空腹血糖顯示，NaHS組的血糖水平與生理鹽水組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 1.The levels of H2S，CSE protein and CSE mRNA in wound granulation tissue were decreased in diabetic mice.A:the skin tissue H2S levels in C57BL/6 and ob/ob mice;B:granulation tissue H2S level at day 6 after wound establishment and NaHS treatment;C: the CSE protein expression in wound granulation tissue was decreased in ob/ob mice at different time points; D:the mRNA level of CSE in the wound granulation tissue was decreased in ob/ob mice;E:the fasting blood glucose changes.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ob/ob group.圖1 ob/ob小鼠皮膚及肉芽組織中H2S濃度及CSE的蛋白及mRNA的表達(dá)水平降低

2 H2S可促進(jìn)ob/ob小鼠創(chuàng)面愈合

為了進(jìn)一步確定H2S/CSE代謝通路表達(dá)降低與糖尿病難愈性潰瘍是否有關(guān)，我們檢測(cè)了外源性H2S對(duì)傷口愈合的影響。結(jié)果顯示ob/ob小鼠的創(chuàng)面愈合速度明顯低于C57BL/6小鼠，經(jīng)過(guò)NaHS干預(yù)，與ob/ob小鼠加生理鹽水干預(yù)相比創(chuàng)面愈合速率明顯加快(P＜0.05或P＜0.01)，胰島素治療后愈合速率稍有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

Figure 2.NaHS(H2S donor)accelerated wound healing in the ob/ob mice.Mean±SEM.n=4.#P＜0.05 vs C57BL/6;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ob/ob.圖2 H2S促進(jìn)ob/ob小鼠皮膚創(chuàng)面愈合

3 H2S可抑制創(chuàng)面中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)

ob/ob小鼠創(chuàng)面中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯多于C57BL/6小鼠(P＜0.01)，經(jīng)過(guò)NaHS治療6 d后，ob/ob小鼠的中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P＜0.01)，經(jīng)胰島素治療后ob/ob小鼠炎癥細(xì)胞數(shù)量的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

Figure 3.H2S attenuated neutrophil and macrophage infiltration in the ob/ob mice.A:the images showed representative neutrophil (MPO+)and monocyte/macrophage(CD68+)infiltration that stained brown(×200);B:the quantitative analysis of neutrophil and monocyte/macrophage infiltration measured under microscope as the total number of infiltrating MPO+or CD68+cells per high power field(HPF，×400).Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs ob/ob group.圖3 H2S抑制ob/ob小鼠皮膚創(chuàng)面的中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)

4 H2S可降低促炎癥因子的產(chǎn)生

ob/ob小鼠肉芽組織中IL-6及TNF-α炎癥因子的水平明顯高于對(duì)照組小鼠(P＜0.05)，而經(jīng)過(guò)NaHS干預(yù)6 d后，ob/ob小鼠中的IL-6及TNF-α水平明顯降低(P＜0.05)，而經(jīng)過(guò)胰島素治療后，IL-6 及TNF-α水平的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4。

5 H2S可降低MMP-9的蛋白表達(dá)

ob/ob小鼠創(chuàng)面肉芽組織MMP-9的蛋白表達(dá)明顯高于C57BL/6小鼠(P＜0.05)，經(jīng)過(guò)NaHS治療3 d后，ob/ob小鼠MMP-9的蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

6 H2S可增加膠原蛋白的沉積

ob/ob小鼠創(chuàng)面的膠原沉積明顯多于野生型小鼠，經(jīng)過(guò)NaHS治療6 d后，ob/ob小鼠的創(chuàng)面膠原沉積顯著降低，經(jīng)胰島素治療后ob/ob小鼠創(chuàng)面膠原沉積無(wú)明顯增加，見(jiàn)圖5。

討論

Figure 4.The effects of H2S on IL-6(A)and TNF-α(B)secretion in ob/ob mice.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ob/ob group.圖4 H2S顯著降低TNF-α和IL-6水平

血管系統(tǒng)中內(nèi)源性H2S主要通過(guò)半胱氨酸由CSE催化作用產(chǎn)生［7］，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗凋亡、促進(jìn)血管生成和抗炎作用［8-9］。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠血漿中H2S濃度及CSE活性顯著降低［5］。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠皮膚及肉芽組織中H2S釋放量明顯低于對(duì)照組小鼠，這與其他學(xué)者研究結(jié)果是一致的［5，10］，CSE是分布于血管系統(tǒng)中催化產(chǎn)生H2S的酶，我們研究中證實(shí)糖尿病小鼠肉芽組織中CSE蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯低于野生型小鼠。此外，我們用以100 μmol/L的NaHS(可為H2S的供體)［5］經(jīng)過(guò)6 d干預(yù)，肉芽組織中的H2S釋放量明顯升高。為了明確H2S與糖尿病難愈性潰瘍的關(guān)系，我們進(jìn)一步觀察了H2S干預(yù)后糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的變化，結(jié)果顯示H2S治療顯著地促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合速率。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)給予外源性H2S對(duì)于胰島素敏感性無(wú)明顯改善作用［11］，可以促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，同時(shí)可以直接抑制高糖刺激下的胰島素分泌［12］。我們的實(shí)驗(yàn)顯示NaHS組的血糖水平與生理鹽水組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。同時(shí)為排除血糖水平對(duì)創(chuàng)面愈合速率的影響，我們?cè)O(shè)置了胰島素治療組，結(jié)果顯示胰島素治療組愈合速率與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，從而提示H2S/CSE代謝通路表達(dá)降低可能是造成糖尿病難愈性潰瘍的機(jī)制之一。

Figure 5.The effects of H2S on the protein expression of MMP-9 and collagen formation in the granulation tissues.A:the protein expression of MMP-9 in the wound granulation tissues was increased in ob/ob mice;B:the effect of H2S on the protein levels of MMP-9;C:representative photomicrographs of Masson trichrome staining(×40).Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs ob/ob.圖5 H2S顯著降低MMP-9蛋白表達(dá)的水平，增加創(chuàng)面的膠原沉積

為進(jìn)一步確定H2S促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制，我們觀察了H2S外源性供體(NaHS)干預(yù)后對(duì)創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子水平的影響。結(jié)果提示H2S抑制創(chuàng)面中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，并且降低TNF-α和IL-6的水平。眾所周知，糖尿病難愈性潰瘍的形成與創(chuàng)面慢性炎癥遷延有密切關(guān)系。正常情況下，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)是創(chuàng)面愈合的必要條件。組織損傷后，中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞向創(chuàng)傷部位遷移，通過(guò)去除壞死組織為傷口愈合提供床面，為下一步修復(fù)創(chuàng)造條件［13］，同時(shí)這些細(xì)胞還分泌各種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，吸引周?chē)衫w維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞向創(chuàng)面遷移，通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)及血管再生形成肉芽組織。正常情況下，創(chuàng)面急性炎癥反應(yīng)是自限性的，而糖尿病狀態(tài)下創(chuàng)面炎癥反應(yīng)失控，主要表現(xiàn)為修復(fù)期炎癥細(xì)胞的持續(xù)浸潤(rùn)以及TNF-α、IL-6等炎癥因子水平持續(xù)升高［14］。因此，硫化氫對(duì)促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制可能是通過(guò)其抗炎作用實(shí)現(xiàn)的，但詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

MMPs是由巨噬細(xì)胞分泌的蛋白酶超家族，可以降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分(extracellular matrix，ECM)。而ECM可以為創(chuàng)面愈合提供床面，幫助內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞遷移附著以及膠原沉積。Vacek等［15］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CSE和CBS、增加內(nèi)源性H2S可顯著性增加MMPs水平，同時(shí)降低特異性抑制因子金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs)的水平。H2S可以降低MMP-9的表達(dá)同時(shí)誘導(dǎo)MMP-2的表達(dá)，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠肉芽組織MMP-9的表達(dá)水平升高，膠原沉積減少，而MMP-9水平的升高是糖尿病難愈性潰瘍的機(jī)制之一，經(jīng)H2S治療后，可以降低ob/ob小鼠肉芽組織MMP-9的表達(dá)水平并且增加了創(chuàng)面的膠原沉積。所以，我們有理由相信H2S通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)來(lái)促進(jìn)傷口愈合。

總之，本研究結(jié)果提示H2S/CSE代謝通路表達(dá)降低可能是糖尿病難愈性潰瘍形成的重要機(jī)制之一。而外源性H2S可以促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能與抑制中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低炎癥因子及MMP-9的表達(dá)水平有關(guān)。本研究為糖尿病難愈性潰瘍的防治提供了新的思路，研究結(jié)果有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

［1］ Geach T.Closing the NET on impaired wound healing in diabetes mellitus［J］.Nat Rev Endocrinol，2015，11(8): 443.

［2］ Wong SL，Demers M，Martinod K，et al.Diabetes primes neutrophils to undergo NETosis，which impairs wound healing［J］.Nat Med，2015，21(7):815-819.

［3］ Tao BB，Cai WJ，Zhu YC.H2S is a promoter of angiogenesis:identification of H2S"receptors"and its molecular switches in vascular endothelial cells［J］.Handb Exp Pharmacol，2015，230:137-152.

［4］ Liu Y，Zhao HC，Qiang Y，et al.Effects of hydrogen sulfide on high glucose-induced glomerular podocyte injury in mice［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8(6):6814-6820.

［5］ Liu F，Chen DD，Sun X，et al.Hydrogen sulfide improves wound healing via restoration of endothelial progenitor cell functions and activation of angiopoietin-1 in type 2 diabetes［J］.Diabetes，2014，63(6):1763-1778.

［6］ Chen J，Ren J，Jing Q，et al.TSH/TSHR signaling suppresses fatty acid synthase(FASN)expression in adipocytes［J］.J Cell Physiol，2015，230(9):2233-2239.

［7］ 劉 曄，彭 力，盧圣霞，等.硫化氫對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(4):670-674.

［8］ Vacek TP，Rehman S，Neamtu D，et al.Matrix metalloproteinases in atherosclerosis:role of nitric oxide，hydrogen sulfide，homocysteine，and polymorphisms［J］.Vasc Health Risk Manag，2015，11(1):173-183.

［9］ Wallace JL，F(xiàn)erraz JG，Muscara MN.Hydrogen sulfide: an endogenous mediator of resolution of inflammation and injury［J］.Antioxid Redox Signal，2012，17(1):58-67.

［10］Wang G，Li W，Chen Q，et al.Hydrogen sulfide accelerates wound healing in diabetic rats［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8(5):5097-5104.

［11］于 婷.胰島素抵抗大鼠硫化氫/胱硫醚γ-裂解酶體系的實(shí)驗(yàn)觀察［D］.山東:山東大學(xué)，2007.

［12］陳玉涵，李榮娜，王紅霞.硫化氫對(duì)代謝綜合征小鼠血糖和血胰島素水平的調(diào)節(jié)［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(35):11-14.

［13］Bauer SM，Bauer RJ，Velazquez OC.Angiogenesis，vasculogenesis，and induction of healing in chronic wounds ［J］.Vasc Endovasc Surg，2005，39(4):293-306.

［14］Hanses F，Park S，Rich J，et al.Reduced neutrophil apoptosis in diabetic mice during staphylococcal infection leads to prolonged TNFα production and reduced neutrophil clearance［J］.PLoS One，2011，6(8):e23633.

［15］Vacek TP，Rehman S，Neamtu D，et al.Matrix metalloproteinases in atherosclerosis:role of nitric oxide，hydrogen sulfide，homocysteine，and polymorphisms［J］.Vasc Health Risk Manag，2015，11(1):173-183.

(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effects of hydrogen sulfide on impaired wound healing in ob/ob mice

ZHAO Hui-chen1，2，CHAI Jia-chao3，ZHENG Jie4，WANG Yuan-mei1，WANG Yuanyuan5，GUO Xiu-zhi6，GUAN Qing-bo7，LIU Yuan-tao2

(1Department of Endocrinology，4Department of Cardiology，5Department of Nephrology，The Second Hospital of Shandong University，Jinan 250033，China;2Department of Endocrinology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266071，China;3Department of Pediatric Orthopaedic，7Department of Endocrinology，Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China;6The Second Department of Occupational Medicine，Central Hospital Branch of Taian City，Taian 271000，China.E-mail:sduliuyuantao@163.com;guanqingbo@medmail.com.cn)

AIM:To investigate the role of hydrogen sulfide(H2S)on impaired wound healing in ob/ob mice and the underlying mechanism.METHODS:The ob/ob mice were randomly divided into 3 groups，including vehicle，insulin and NaHS for treatment.C57BL/6 mice were treated with vehicle as control.Full-thickness punch biopsy wounds were created on the mice.Firstly，H2S concentrations in the skins and granulation tissues were measured.The mRNA expression of cystathionine γ-lyase(CSE)was detected by RT-qPCR.The protein expression of CSE and MMP-9 were determined by Western blot.The neutrophil and monocyte/macrophage infiltration was analyzed by immunohistochemistry method.The levels of tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin(IL)-6 were measured by ELISA.Collagen formation was measured by Masson staining.RESULTS:The H2S levels in the skin and granulation were significantly decreased in ob/ob mice and increased in the NaHS-treated mice(P＜0.05).CSE expression at mRNA and protein levels was significantly decreased in ob/ob mice compared with the control mice(P＜0.05).The wound healing period was significantly shorter in NaHS group than that in vehicle-treated ob/ob mice group(P＜0.05)，in which the insulin group had no difference with vehicle ob/ob mice group.The neutrophil and monocyte/macrophage infiltration，and TNF-α and IL-6 levels were significantly increased in ob/ob groups，but were decreased in NaHS group(P＜0.01 or P＜0.05).Meanwhile，NaHS increased collagen formation in the granulation tissues of ob/ob mice.CONCLUSION:H2S/CSE down-regulation contributesto impaired wound healing in diabetes，which is alleviated by exogenous H2S possibly through anti-inflammation.

Diabetes;Wound healing;Hydrogen sulfide;Cystathionine γ-lyase;Anti-inflammation

R587.2;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.003

1000-4718(2016)07-1167-07

2016-02-24

2016-05-16

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2012HL50)

△劉元濤Tel:0532-88905638;E-mail:sduliuyuantao@163.com;管慶波Tel:0531-85186910;E-mail:guanqingbo@ medmail.com.cn