ATP敏感性鉀通道的開放通過抑制TLR4/NF-κB通路對抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷和炎癥*

梁偉杰， 陳美姬， 何潔儀， 黃惠敏， 余盛龍， 陳 君， 陳景福， 宋明才， 廖新學(xué)

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東廣州511400;中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)3兒科，4心血管內(nèi)科CCU，廣東廣州510700;5中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州510080)

ATP敏感性鉀通道的開放通過抑制TLR4/NF-κB通路對抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷和炎癥*

梁偉杰1，2， 陳美姬3， 何潔儀1，2， 黃惠敏1，2， 余盛龍1，2， 陳 君1，2， 陳景福4， 宋明才1，2， 廖新學(xué)5△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東廣州511400;中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)3兒科，4心血管內(nèi)科CCU，廣東廣州510700;5中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州510080)

目的:探討開放ATP敏感性鉀通道(KATP通道)能否抑制Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路對抗高糖(HG)引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷和炎癥。方法:應(yīng)用Western blot測定TLR4和NF-κB p65的蛋白水平;應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平;采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)測定心肌細(xì)胞存活率;羅丹明123染色熒光顯微鏡照相法測定線粒體膜電位(MMP);雙氯熒光素染色熒光顯微鏡照相法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平;Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相法檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果:H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)HG(35 mmol/L葡萄糖)處理24 h，胞內(nèi)TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白水平明顯增加，100 μmol/L KATP通道開放劑二氮嗪(DZ)預(yù)處理30 min可抑制HG對TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平的上調(diào)作用;此外，30 μmol/L TAK-242(TLR4抑制劑)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也可減輕HG對p-NF-κB p65的上調(diào)作用。另一方面，100 μmol/L DZ預(yù)處理有明確的心肌保護(hù)作用，可抑制HG引起的細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞存活率升高，并減少IL-1β和TNF-α分泌水平、MMP丟失、ROS生成及凋亡細(xì)胞數(shù)量;而30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L PDTC(NF-κB抑制劑)共處理心肌細(xì)胞24 h也可發(fā)揮和DZ相類似的作用，能抑制HG引起的上述損傷和炎癥反應(yīng)。結(jié)論:開放KATP通道可通過抑制TLR4/NF-κB通路對抗HG引起的H9c2肌細(xì)胞損傷和炎癥。

ATP敏感性鉀通道;Toll樣受體4;核因子-κB;高糖;心肌細(xì)胞;損傷;炎癥

眾所周知，高血糖是糖尿病的一個重要指征，其所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在糖尿病相關(guān)并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、冠心病和糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)等的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［1-3］。在 DCM的炎癥反應(yīng)過程中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)起關(guān)鍵性的調(diào)控作用［4］。TLR4是第1個被發(fā)現(xiàn)的TLRs，在心肌細(xì)胞中有大量的表達(dá)［5］。TLR4與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可協(xié)同激活控制各種基因表達(dá)的核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)，調(diào)節(jié)其下游的炎癥因子如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，從而引起炎癥的發(fā)生［5］。有研究報道，高血糖可促進(jìn)TLR4的大量表達(dá)并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥發(fā)生［6］，但抑制TLR4/NF-κB通路的活性能否拮抗高血糖引起的心肌細(xì)胞炎癥和損傷作用，該研究小組并沒有作進(jìn)一步的探討。因此，進(jìn)一步明確這個問題具有重要的意義。

ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channels，KATP通道)于1983年被Noma［7］在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是一種受細(xì)胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控的內(nèi)向整流鉀通道。研究表明，開放KATP通道對心肌有保護(hù)作用［8-9］。最近，我們實驗證實，開放KATP通道可對抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷［10］。有研究指出，激活KATP通道可通過抑制TLR4的活動減輕炎癥反應(yīng)從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞［11］。但是，激活KATP通道能否通過抑制TLR4及其下游的NF-κB通路，從而保護(hù)心肌細(xì)胞對抗高糖引起的損傷和炎癥，目前尚未見報道。

為此，本研究在高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞建立的DCM細(xì)胞模型［12］中探討TLR4/NF-κB通路在高糖引起心肌細(xì)胞損傷和炎癥中的作用，觀察開放KATP通道能否抑制TLR4/NF-κB信號通路對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥。

材料和方法

1 材料

NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)、Hoechst 33258和雙氯熒光素(2'，7'-dichlorfluorescein diacetate，DCFH-DA)由 Sigma-Aldrich供應(yīng);KATP通道開放劑二氮嗪(diazoxide，DZ)購自Cayman;細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自Dojindo;抗TLR4抗體購自Abcam;抗p-NF-κB p65和抗NF-κB p65抗體購于Cell Signaling;TAK-242(TLR4抑制劑)購自InvivoGen;特級胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco;DMEM培養(yǎng)基(其葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)由HyClone供應(yīng);IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。H9c2心肌細(xì)胞來源于胚胎期大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，由中山大學(xué)實驗動物中心細(xì)胞庫供應(yīng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞置于含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃的條件下傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約80%的融合狀態(tài)可用于實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為8組:正常對照(control) 組:單純采用DMEM培養(yǎng)基作用心肌細(xì)胞24 h;高糖(high glucose，HG)損傷組:用含有高濃度葡萄糖(35 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)基作用心肌細(xì)胞24 h;DZ+ HG組:100 μmol/L DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，PBS液洗2次后，用含高濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基作用24 h;TAK-242+HG組:30 μmol/L TAK-242和含高濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24h;PDTC+HG組:100 μmol/L PDTC和含高濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24 h;DZ組:100 μmol/L DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，PBS液洗2次后，用 DMEM培養(yǎng)基作用 24 h;TAK-242組:30 μmol/L TAK-242與DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24 h;PDTC組:100 μmol/L PDTC與DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24 h。

2.3 Western blot檢測TLR4和NF-κB p65的蛋白水平 在60 mm培養(yǎng)皿中種植H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞生長至大約80%的融合度時，根據(jù)分組給予相應(yīng)處理后，加入細(xì)胞裂解液，4℃搖床上處理30 min，12 000 r/min高速離心10 min，以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白質(zhì)含量。等量的蛋白經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入I抗，即兔抗鼠TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65或β-actin(濃度均為1∶1 000)，4℃作用過夜后加入濃度為1∶2 500的II抗稀釋液，室溫下孵育1.5 h。用增強化學(xué)發(fā)光法使PVDF膜顯色，暗室中將顯色條帶曝光到醫(yī)用X線片上，凝膠成像掃描系統(tǒng)分析結(jié)果。實驗重復(fù)5次。

2.4 雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的水平 于96孔板中種植H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到大約80%時，按照分組給予不同的處理后，收集培養(yǎng)基作待測標(biāo)本。ELISA操作流程根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，在終止顯色反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度(A)值。取5孔A值的平均數(shù)，根據(jù)以下公式計算IL-1β和TNF-α的誘導(dǎo)釋放率(%):處理組A/對照組A×100%。實驗重復(fù)5次。

2.5 CCK-8法測定心肌細(xì)胞存活率 于96孔板中種植H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時，按照設(shè)定的分組分別處理后，于每孔中加入DMEM 90 μL和CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2.5 h，酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的A值。細(xì)胞存活率按照以下公式計算:細(xì)胞存活率(%)=處理組A/對照組A ×100%。實驗重復(fù)5次。

（2）在攪拌站控制室內(nèi)，應(yīng)逐一打印記錄瀝青和各種礦物用料的用量和兩者的拌合溫度，并定期檢查核驗攪拌站的計量和溫度測量；不能使用無材料用量和溫度自動記錄裝置的拌和機。

2.6 Rh123染色熒光顯微鏡照相法檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP) 用24孔板培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%左右時，按照分組給予相應(yīng)的處理后，加入稀釋的Rh 123緩沖液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育45 min，熒光顯微鏡下隨機照片記錄5個高倍鏡視野，應(yīng)用圖像分析軟件(ImageJ 1.47i)計算出綠色熒光強度的平均值，即平均熒光強度(mean fluorescent intensity，MFI)，再對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)5次。

2.7 DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法測定胞內(nèi)ROS水平 用24孔板培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時，按照分組給予相應(yīng)處理后，加入DCFH-DA染液(濃度為10 μmol/L)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，熒光顯微鏡下隨機照片記錄5個高倍鏡視野，應(yīng)用ImageJ 1.47i軟件計算出綠色熒光的MFI，再對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)5次。

2.8 Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相法測定凋亡細(xì)胞數(shù)量 用24孔板培養(yǎng)H9c2肌細(xì)胞，待細(xì)胞生長至約80%的融合度時，按照分組給予相應(yīng)處理后，4%的多聚甲醛作用10 min，加入 Hoechst 33258染料緩沖液(濃度為5 mg/L)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，熒光顯微鏡下可觀察到:正常心肌細(xì)胞呈彌散均勻的低密度熒光，凋亡細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞核呈致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光，隨機照片記錄5個高倍鏡視野，應(yīng)用ImageJ 1.47i軟件計算出藍(lán)色熒光的MFI，再對各組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計。實驗重復(fù)5次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理和分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，單因素方差分析(one-way ANOVA)用于多個樣本均數(shù)間的比較，SNK-q檢驗用于多個樣本均數(shù)間的兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié)果

1 DZ抑制HG對心肌細(xì)胞TLR4和磷酸化NF-κB p65蛋白水平的上調(diào)作用

圖1顯示，HG處理H9c2心肌細(xì)胞24 h，可引起TLR4和p-NF-κB p65的蛋白水平明顯上升，與HG損傷組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。應(yīng)用100 μmol/L KATP通道開放劑DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，可明顯降低TLR4和p-NF-κB p65的蛋白水平，與HG組分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。DZ本身對心肌細(xì)胞的TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平無明顯影響。

2 TAK-242減輕HG對磷酸化NF-κB p65蛋白水平的上調(diào)作用

Figure 1.Diazoxide(DZ，a KATPchannel opener)attenuated the high glucose(35 mmol/L glucose，HG)-induced upregulation of TLR4 and p-NF-κB p65 in the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖1 DZ(KATP通道開放劑)抑制HG對心肌細(xì)胞TLR4和磷酸化NF-κB p65蛋白水平的上調(diào)作用

Figure 2.TAK-242(an inhibitor of TLR4)attenuated the HG-induced up-regulation of p-NF-κB p65 protein level in the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖2 TAK-242(TLR4抑制劑)減弱HG對磷酸化NF-κB p65蛋白水平的上調(diào)作用

3 DZ、TAK-242和PDTC抑制HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子分泌

如圖3所示，HG處理心肌細(xì)胞24 h可誘導(dǎo)出明顯的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為IL-1β和TNF-α的分泌水平明顯增高，與control組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。應(yīng)用100 μmol/L DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min可使IL-1β和TNF-α的分泌水平明顯降低，與HG組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。

與DZ抑制炎癥因子分泌的作用相類似，30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L PDTC(NF-κB抑制劑)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能拮抗HG對炎癥因子分泌的促進(jìn)作用，使IL-1β和TNF-α的分泌水平降低，與HG組分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。100 μmol/L DZ、30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L PDTC本身不影響細(xì)胞炎癥因子的基礎(chǔ)分泌水平。

Figure 3.DZ(a KATPchannel opener)，TAK-242(an inhibitor of TLR4)and PDTC(an inhibitor of NF-κB)attenuated the HG-induced secretion of inflammatory cytokines in the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖3 DZ(KATP通道開放劑)、TAK-242(TLR4抑制劑)和PDTC(NF-κB抑制劑)抑制HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子

4 DZ、TAK-242和PDTC抑制HG引起的心肌細(xì)胞毒性

圖4顯示，HG作用心肌細(xì)胞24 h可使細(xì)胞存活率降低至(39.7±2.60)%，提示HG可產(chǎn)生明顯的心肌細(xì)胞毒性。應(yīng)用100 μmol/L DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞能明顯地抑制HG引起的心肌細(xì)胞毒性，升高細(xì)胞存活率，與HG組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。100 μmol/L DZ本身對心肌細(xì)胞存活率無顯著影響。

與DZ的作用相類似，30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L PDTC和HG共處理心肌細(xì)胞24 h均能明顯地抑制HG引起的心肌細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率升高，與HG組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。TAK-242或PDTC本身對心肌細(xì)胞的存活率無明顯的影響。

5 DZ、TAK-242和PDTC抑制HG引起的心肌細(xì)胞MMP丟失

圖5所示，HG可使心肌細(xì)胞內(nèi)Rh123的MFI從(30.5±1.27)%降低至(9.6±0.90)%(P＜0.01)。采用100 μmol/L DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min可明顯減少MMP的丟失，使MFI升高至(20.9±1.00)%，與HG組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。100 μmol/L DZ本身不影響心肌細(xì)胞MMP水平。

Figure 4.DZ(a KATPchannel opener)，TAK-242(an inhibitor of TLR4)and PDTC(an inhibitor of NF-κB)inhibited the HG-induced cytotoxicity in the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖4 DZ(KATP通道開放劑)、TAK-242(TLR4抑制劑)和PDTC(NF-κB抑制劑)減輕HG引起的心肌細(xì)胞毒性

Figure 5.DZ(a KATPchannel opener)，TAK-242(an inhibitor of TLR4)and PDTC(an inhibitor of NF-κB)inhibited the HG-induced loss of mitochondrial membrane potential(MMP)in the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖5 DZ(KATP通道開放劑)、TAK-242(TLR4抑制劑)和PDTC(NF-κB抑制劑)抑制高糖引起的心肌細(xì)胞MMP丟失

與DZ的線粒體保護(hù)作用相類似，應(yīng)用30 μmol/ L TAK-242或100 μmol/L PDTC和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能對抗HG引起的心肌細(xì)胞MMP丟失作用，使MFI分別增加至(21.2±0.87)%(HG+ TAK-242組)和(21.7±1.10)%(HG+PDTC組)。分別單獨應(yīng)用30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L PDTC處理心肌細(xì)胞24 h對細(xì)胞的MMP無明顯影響，見圖5。

6 DZ、TAK-242和PDTC抑制HG引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

采用HG作用心肌細(xì)胞24 h可使細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA的MFI明顯增強，與control組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。應(yīng)用100 μmol/L DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min可減少細(xì)胞內(nèi)ROS的堆積，MFI從(30.9±1.02)%(HG組)降低至(17.8± 0.60)%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。單獨應(yīng)用100 μmol/L DZ預(yù)處理心肌細(xì)胞對ROS生成無明顯影響。

與DZ的抗氧化作用相類似，應(yīng)用30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L PDTC和HG共處理心肌細(xì)胞24 h，均能抑制HG引起的細(xì)胞內(nèi)ROS堆積，使MFI分別升高至(17.3±0.76)%(HG+TAK-242 組)和(17.8±1.07)%(HG+PDTC組)。分別單獨應(yīng)用30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L PDTC處理心肌細(xì)胞24 h對ROS的生成無明顯的影響，見圖6。

Figure 6.DZ(a KATPchannel opener)，TAK-242(an inhibitor of TLR4)and PDTC(an inhibitor of NF-κB)attenuated the HG-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species(ROS)in H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖6 DZ(KATP通道開放劑)、TAK-242(TLR4抑制劑)和PDTC(NF-κB抑制劑)減輕HG引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

7 DZ、TAK-242和PDTC抑制HG引起的致心肌細(xì)胞凋亡作用

HG狀態(tài)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，經(jīng)Hoechst 33258核染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到呈現(xiàn)典型凋亡特征的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與control組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。然而，100 μmol/L DZ預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞30 min能顯著地減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，與HG組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。DZ本身對心肌細(xì)胞凋亡無明顯的影響。

與DZ的抗凋亡作用相似，30 μmol/L TAK-242 或100 μmol/L PDTC和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能明顯減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，與HG處理組分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。TAK-242或PDTC本身對細(xì)胞凋亡無明顯影響，見圖7。

Figure 7.DZ(a KATPchannel opener)，TAK-242(an inhibitor of TLR4)and PDTC(an inhibitor of NF-κB)reduced the HG-induced apoptosis of the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖7 DZ(KATP通道開放劑)、TAK-242(TLR4抑制劑)和PDTC(NF-κB抑制劑)抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

討論

本研究在應(yīng)用HG損傷H9c2肌細(xì)胞建立的DCM細(xì)胞模型中再次證實，HG可引起心肌細(xì)胞的多種損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低(細(xì)胞毒性作用)，MMP丟失(線粒體損傷)、ROS生成(氧化應(yīng)激)、凋亡細(xì)胞數(shù)量(致凋亡作用)和炎癥因子(IL-1β和TNF-α)分泌增多，這與我們之前的報道［10，12-14］相一致。此外，與近年的報道相近似［5-6，13-14］，本實驗還觀察到HG可明顯增加心肌細(xì)胞TLR4和p-NF-κB p65的蛋白水平，應(yīng)用TLR4的抑制劑可減弱HG對p-NF-κB p65的上調(diào)作用，提示:TLR4位于NF-κB通路的上游，HG可激活TLR4/NF-κB信號通路。TLR4 是TLRs家族中的重要成員，可激活NF-κB通路、調(diào)控炎癥因子(如IL-1、IL-6、IL-1β和TNF-α等)的分泌［5］，參與多器官臟器的炎癥損傷。在本研究中我們分別觀察了TLR4的抑制劑TAK-242和NF-κB通路的抑制劑PDTC對HG引起心肌細(xì)胞損傷和炎癥的影響。結(jié)果表明，TAK-242和PDTC均能顯著減輕HG對心肌細(xì)胞的多種損傷及炎癥反應(yīng)，使細(xì)胞存活率升高，MMP丟失、ROS生成、凋亡細(xì)胞數(shù)量和炎癥因子(IL-1β和TNF-α)分泌減少。以上結(jié)果清晰地提示TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)HG引起的心肌細(xì)胞損傷及炎癥。這從細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)一步深化了de Laat等［6］的研究結(jié)果(僅觀察HG可上調(diào)心肌TLR4表達(dá)水平，沒有進(jìn)一步用拮抗劑探討TLR4/NF-κB通路在HG誘導(dǎo)的心肌損傷和炎癥中的作用)，為深入闡明炎癥通路在高糖引起心肌損傷中的作用機制提供了新穎的實驗依據(jù)。

重要的是，我們還探討了KATP通道與TLR4/NF-κB信號通路的關(guān)系。研究表明:KATP通道大量存在于心血管組織中，發(fā)揮重要的生理和病理生理作用［15］。心肌細(xì)胞KATP通道能夠偶聯(lián)細(xì)胞能量代謝和興奮性，在應(yīng)對各種病理生理應(yīng)激時，KATP通道的開放能縮短動作電位，降低心肌細(xì)胞能量消耗，增加應(yīng)激的耐受性，從而保護(hù)心肌。最近我們證實，開放KATP通道可對抗高血糖引起的 H9c2心肌細(xì)胞損傷［10］，但其心肌保護(hù)機制尚未完全明確。Zhao等［11］研究證實，激活KATP通道可通過抑制TLR4的活動減輕神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng);Kawamura等［16］指出，開放KATP通道可抑制冠狀動脈旁路搭橋手術(shù)患者NF-κB通路的激活。由此可見，KATP通道與TLR4 和NF-κB通路的關(guān)系非常密切。但開放KATP通道能否通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路從而保護(hù)心肌細(xì)胞對抗高糖引起的損傷和炎癥，目前尚未見報道。為此，我們首先觀察了KATP通道開放劑DZ對HG促進(jìn)TLR4和NF-κB p65表達(dá)的影響。結(jié)果顯示DZ能明顯抑制HG對TLR4和p-NF-κB p65的上調(diào)作用。此外，應(yīng)用DZ預(yù)處理及分別應(yīng)用TLR4和NF-κB的抑制劑共處理心肌細(xì)胞均能產(chǎn)生類似的心肌保護(hù)效應(yīng)，減輕HG誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激、線粒體損傷及致細(xì)胞凋亡作用。這些結(jié)果有力地證明，開放KATP通道可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路對抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥，這可能是KATP通道心肌保護(hù)的重要機制之一。

綜上所述，本研究證實，TLR4/NF-κB通路介導(dǎo)HG引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥;開放KATP通道可通過抑制TLR4/NF-κB通路對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥。

［1］ Fang Q，Wang J，Wang L，et al.Attenuation of inflammatory response by a novel chalcone protects kidney and heart from hyperglycemia-induced injuries in type 1 diabetic mice［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2015，288(2): 179-191.

［2］ Rajesh M，Bátkai S，Kechrid M，et al.Cannabinoid 1 receptor promotes cardiac dysfunction，oxidative stress，inflammation，and fibrosis in diabetic cardiomyopathy［J］.Diabetes，2012，61(3):716-727.

［3］ Pan Y，Wang Y，Zhao Y，et al.Inhibition of JNK phosphorylation by a novel curcumin analog prevents high glucose-induced inflammation and apoptosis in cardiomyocytes and the development of diabetic cardiomyopathy［J］.Diabetes，2014，63(10):3497-3511.

［4］ Fuentes-Antrás J，Ioan AM，Tuón J，et al.Activation of Toll-like receptors and inflammasome complexes in the diabetic cardiomyopathy-associated inflammation［J］.Int J Endocrinol，2014，2014:847827.

［5］ Dasu MR，Devaraj S，Park S，et al.Increased Toll-like receptor(TLR)activation and TLR ligands in recently diagnosed type 2 diabetic subjects［J］.Diabetes Care，2010，33(4):861-868.

［6］ de Laat MA，Gruntmeir KJ，Pollitt CC，et al.Hyperinsulinemia down-regulates TLR4 expression in the mammalian heart［J］.Front Endocrinol(Lausanne)，2014，5:120.

［7］ Noma A.ATP-regulated K+channels in cardiac muscle ［J］.Nature，1983，305(5930):147-148.

［8］ Eisen A，F(xiàn)isman EZ，Rubenfire M，et al.Ischemic preconditioning:nearly two decades of research.A comprehensive review［J］.Atherosclerosis，2004，172(2):201-210.

［9］ Sierra A，Zhu Z，Sapay N，et al.Regulation of cardiac ATP-sensitive potassium channel surface expression by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II［J］.J Biol Chem，2013，288(3):1568-1581.

［10］梁偉杰，陳景福，張穩(wěn)柱，等.ATP敏感性鉀通道在硫化氫抑制高糖引起的心肌細(xì)胞損傷中的作用［J］.中國病理生理雜志，2015，31(5):785-790.

［11］Zhao AP，Dong YF，Liu W，et al.Nicorandil inhibits inflammasome activation and Toll-like receptor-4 signal transduction to protect against oxygen-glucose deprivationinduced inflammation in BV-2 cells［J］.CNS Neurosci Ther，2014，20(2):147-153.

［12］Xu W，Wu W，Chen J，et al.Exogenous hydrogen sulfide protects H9c2 cardiac cells against high glucose-induced injury by inhibiting the activities of the p38 MAPK and ERK1/2 pathways［J］.Int J Mol Med，2013，32(4): 917-925.

［13］梁偉杰，陳景福，宋明才，等.血管緊張素-(1-7)/Mas受體軸通過調(diào)控NF-κB通路保護(hù)心肌細(xì)胞對抗高糖誘導(dǎo)的損傷［J］.中國病理生理雜志，2015，31(2):267-273.

［14］ Xu W，Chen J，Lin J，et al.Exogenous H2S protects H9c2 cardiac cells against high glucose-induced injury and inflammation by inhibiting the activation of the NF-κB and IL-1β pathways［J］.Int J Mol Med，2015，35(1):177-186.

［15］Tinker A，Aziz Q，Thomas A.The role of ATP-sensitive potassium channels in cellular function and protection in the cardiovascular system［J］.Br J Pharmacol，2014，171 (1):12-23.

［16］Kawamura T，Kadosaki M，Nara N，et al.Nicorandil attenuates NF-κB activation，adhesion molecule expression，and cytokine production in patients with coronary artery bypass surgery［J］.Shock，2005，24(2):103-108.

(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Opening of ATP-sensitive K+channels protects H9c2 cardiac cells against high glucose-induced injury and inflammation by inhibiting TLR4/NF-κB pathway

LIANG Wei-jie1，2，CHEN Mei-ji3，HE Jie-yi1，2，HUANG Hui-min1，2，YU Sheng-long1，2，CHEN Jun1，2，CHEN Jing-fu4，SONG Ming-cai1，2，LIAO Xin-xue5

(1Department of Cardiology，Central Hospital of Panyu District，2Cardiovascular Institute of Panyu District，Guangzhou 511400，China;3Department of Pediatrics，4Cardiac Care Unit，Department of Cardiology，Huangpu Division of The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510700，China;5Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn)

AIM:To investigate whether the opening of ATP-sensitive K+(KATP)channels protects H9c2 cardiac cells against high glucose(HG)-induced injury and inflammation by inhibiting the Toll-like receptor 4(TLR4)/nuclear factor-κB(NF-κB)pathway.METHODS:The protein levels of TLR4 and NF-κB p65 were determined by Western blot.The levels of interleukin-1β(IL-1β)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)were detected by ELISA.The cell viability was measured by CCK-8 assay.Mitochondrial membrane potential(MMP)was examined by rhodamine 123(Rh 123) staining followed by photofluorography.The intracellular levels of reactive oxygen species(ROS)were detected by 2'，7'-dichlorfluorescein-diacetate(DCFH-DA)staining followed by photofluorography.The number of apoptotic cells was observed by Hoechst 33258 nuclear staining followed by photofluorography.RESULTS:After the H9c2 cardiac cells were treated with HG(35 mmol/L glucose)for 24 h，the protein levels of TLR4 and phosphorylated NF-κB p65(p-NF-κB p65)were significantly increased.Pretreatment of the cells with 100 μmol/L diazoxide(DZ，a KATPchannel opener)for 30 min before exposure to HG considerably blocked the up-regulation of the TLR4 and p-NF-κB protein levels induced by HG.Moreover，co-treatment of the cells with 30 μmol/L TAK-242(an inhibitor of TLR4)obviously inhibited the HG-induced up-regulation of the p-NF-κB p65 protein level.On the other hand，pretreatment of the cells with 100 μmol/L DZ had a clear myocardial protection effect，which attenuated the HG-induced cytotoxicity，inflammatory response，mitochondrial damage，oxidative stress and apoptosis，evidenced by an increase in the cell viability，and decreases in the levels of IL-1β and TNF-α，MMP loss，ROS generation and the number of apoptotic cells.Similarly，co-treatment of H9c2 cardiac cells with 30 μmol/L TAK-242 or 100 μmol/L PDTC(an inhibitor of NF-κB)and HG for 24 h also obviously reduced the above injuries and inflammation induced by HG.CONCLUSION:The opening of KATPchannels protects H9c2 cardiac cells against HG-induced injury and inflammation by inhibiting the TLR4/NF-κB pathway.

ATP-sensitive K+channels;Toll-like receptor 4;Nuclear factor-κB;High glucose;Cardiomyocytes;Injury;Inflammation

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.001

1000-4718(2016)07-1153-08

2016-02-02

2016-03-21

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81270296);番禺區(qū)科技計劃項目(No.2015-Z03-57);番禺區(qū)中心醫(yī)院青年基金資助項目(No.2014-Q-01)

△Tel:020-87332628;E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn