玉米秸稈中不同木質(zhì)素脫除方法對纖維素酶吸附及酶解效果的比較

田順風(fēng)，程力，顧正彪，洪雁，李兆豐，李才明

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；江南大學(xué)食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122）

?

玉米秸稈中不同木質(zhì)素脫除方法對纖維素酶吸附及酶解效果的比較

田順風(fēng)，程力，顧正彪，洪雁，李兆豐，李才明

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；江南大學(xué)食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122）

利用不同預(yù)處理方法獲得的玉米秸稈底物研究木質(zhì)素脫除對纖維素酶吸附量及酶解效率的影響。相比于其他處理方法，2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaOH處理的底物具有最高的木質(zhì)素脫除率（85%），最高的底物可及性［4.7 mg·（g葡聚糖）-1］及酶解效率（18.9%）。通過對不同處理獲得的底物進(jìn)行Langmuir吸附等溫曲線模擬，獲得了最大吸附量（Wmax）與吸附平衡常數(shù)（K），且木質(zhì)纖維素酶水解效率與纖維素酶吸附量具有很好的線性關(guān)系（R2＞0.8），表明脫除木質(zhì)素能很好地提高底物可及性與酶解效率。然而，提高NaOH濃度（3%，4%）進(jìn)一步脫除木質(zhì)素時(shí)，底物可及性與碳水化合物轉(zhuǎn)化為單糖的效率反而明顯下降。因此，適當(dāng)脫除木質(zhì)素而提高底物對纖維素酶的可及性將有助于獲得更有效的酶水解效果。

玉米秸稈；生物質(zhì)；生物能源；纖維素酶吸附；預(yù)處理；木質(zhì)素脫除；酶水解效率

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151570

引　言

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生生物能源［1］，主要由3種聚合物組成：纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。然而，木質(zhì)纖維素對酶和微生物的“生物頑抗性”是低成本生產(chǎn)可再生能源的主要瓶頸［2］。因此，大多數(shù)種類的木質(zhì)纖維素在降解之前要進(jìn)行預(yù)處理，以降低生物質(zhì)頑抗性，進(jìn)而通過酶水解獲得較高的還原糖得率［3］。

生物質(zhì)頑抗性可歸咎于多個(gè)因素［4-6］，例如木質(zhì)素和纖維素形成的復(fù)合物，纖維素的聚合度，纖維素的結(jié)晶度，木質(zhì)素含量，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及分布，半纖維含量和粒徑大小（比表面積）等。其中，木質(zhì)素相關(guān)因素，像木質(zhì)素含量，木質(zhì)素的分布及物理結(jié)構(gòu)，木質(zhì)素與碳水化合物之間的連接以及木質(zhì)素與酶之間的疏水作用等被認(rèn)為是最重要的影響因素［7-10］。一般認(rèn)為木質(zhì)素通過兩種可能的方式降低酶作用效率：纖維素酶非特異性結(jié)合木質(zhì)素；木質(zhì)素作為物理屏障阻礙酶對纖維素的可及性［11］。木質(zhì)素被認(rèn)為是不利于纖維素酶作用的主要障礙之一，因此脫除木質(zhì)素通常能增強(qiáng)底物的酶水解效率［12-17］。亞氯酸鈉法、石灰處理、臭氧處理和堿性過氧化氫處理等方法已被報(bào)道用于脫除木質(zhì)素并提高酶解效率。

不過，關(guān)于木質(zhì)素脫除的方面仍存在爭論，尤其是更為劇烈的木質(zhì)素脫除處理方式［11，17］。較高程度的脫除木質(zhì)素沒有明顯增加底物可及性，并不能引起相應(yīng)底物酶降解效率的提高。據(jù)報(bào)道，次氯酸鈉處理后的料漿木質(zhì)素含量低于15%時(shí)，酶水解效率持平而不是繼續(xù)明顯提高［11］。

一般認(rèn)為，內(nèi)切纖維素酶在木質(zhì)纖維素水解中具有重要作用，內(nèi)切纖維素酶在纖維素多糖鏈上的非結(jié)晶區(qū)域隨機(jī)性地內(nèi)切β-1，4-葡萄糖苷鍵，釋放長短不一的纖維寡糖，在水解過程中與其他纖維素酶形成很好的協(xié)同作用［18］。本文針對原木質(zhì)纖維素及NaOH處理、堿性Na2SO3和堿性H2O2處理得到的樣品，比較不同脫木質(zhì)素方法對內(nèi)切纖維素酶的吸附量及酶解效率（還原糖生成量）的影響。同時(shí)，獲得不同處理得到的底物酶吸附與底物酶降解之間的關(guān)系。最后，進(jìn)行了不同木質(zhì)素脫除水平的研究，確定進(jìn)一步脫除木質(zhì)素對底物酶水解的影響。

1　材料與方法

1.1原材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用干燥玉米秸稈由山東諸城興茂玉米開發(fā)有限公司提供。玉米秸稈用植物粉碎機(jī)磨碎并篩取粒徑250～380 μm的作為原材料。篩選的原材料室溫下儲(chǔ)存于自封袋中。實(shí)驗(yàn)中所用纖維素酶（22178-25G，Lot#BCBM7947V，5 FPU·ml-1，1.4 mg 蛋白質(zhì)·ml-1），是一種內(nèi)切纖維素酶，購買于Sigma，溶解在0.05 mol·L-1pH 4.5的檸檬酸緩沖溶液里。纖維素酶濾紙酶活通過標(biāo)準(zhǔn)方法確定［19］，纖維素酶蛋白質(zhì)含量通過Bradford方法確定，且以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品［20］。

1.2原材料預(yù)處理方法

1.2.1NaOH處理30 g（干）原料放入240 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaOH溶液中，在120℃反應(yīng)30 min［21］。反應(yīng)后混合體系通過過濾進(jìn)行固液分離，固體部分用去離子水洗到中性。洗過之后的濕渣全部轉(zhuǎn)移到衡重的容器中，并在4℃密封儲(chǔ)存。一部分固體殘?jiān)糜诔煞址治觯?2］。

1.2.2堿性Na2SO3處理（ASSP）30 g（干）原料放入300 ml堿性Na2SO3溶液，120℃反應(yīng)50 min。其中，堿用量為0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），氫氧化鈉與亞硫酸鈉的質(zhì)量比為4：1［23］。反應(yīng)之后的混合體系通過過濾進(jìn)行固液分離，固體部分用去離子水洗到中性。洗過之后的濕渣全部轉(zhuǎn)移到衡重的容器中，并在4℃密封儲(chǔ)存。一部分固體殘?jiān)糜诔煞址治觯?2］。

1.2.3堿性H2O2處理30 g（干）原料放入600 ml堿性H2O2溶液中，50℃反應(yīng)6 h。H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，且其pH用5 mol·L-1NaOH調(diào)到11.5［24］。反應(yīng)之后的混合體系通過過濾進(jìn)行固液分離，固體部分用去離子水洗到中性。洗過之后的濕渣全部轉(zhuǎn)移到衡重的容器中，并在4℃密封儲(chǔ)存。一部分固體殘?jiān)糜诔煞址治觯?2］。

1.2.4濃堿處理進(jìn)一步脫除木質(zhì)素為進(jìn)一步研究木質(zhì)素含量尤其是更高水平脫除木質(zhì)素對酶吸附及木質(zhì)纖維素酶降解的影響，原木質(zhì)纖維素用不同濃度的NaOH處理。其中，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%～4%，固液比為1：8，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為120℃、30 min［21，25］。預(yù)處理后的固體部分用去離子水洗到中性。洗過之后的濕渣全部轉(zhuǎn)移到衡重的容器中，并在4℃密封儲(chǔ)存。一部分固體殘?jiān)糜诔煞址治觯?2］。

1.3預(yù)處理前后的底物對纖維素酶的吸附

底物對纖維素酶的可及性可用纖維素酶蛋白質(zhì)在底物上的吸附量［mg·（g 葡聚糖）-1］來表征［25-26］。不同底物纖維素酶吸附實(shí)驗(yàn)在0.05 mol·L-1體積為100 ml的檸檬酸緩沖溶液體系里進(jìn)行，溫度控制在4℃以避免底物部分水解，保持反應(yīng)體系中葡聚糖含量為1 g/100 ml，且初始纖維素酶添加量為6.5 mg·（g 葡聚糖）-1，其中攪拌槳轉(zhuǎn)速為130 r·min-1。在加入纖維素酶之前，過量的牛血清蛋白（最終濃度0.2 mg·ml-1）加入到反應(yīng)體系中，并在60 min內(nèi)達(dá)到平衡。牛血清蛋白可以非特異性結(jié)合到木質(zhì)素表面并阻礙纖維素酶不可逆地吸附到木質(zhì)素上，從而木質(zhì)素對纖維素酶的影響可以忽略［27-28］。反應(yīng)體系中與木質(zhì)素結(jié)合的牛血清蛋白通過Bradford法確定［20］。在反應(yīng)期間，0、15、30、45、60和75 min時(shí)分別從體系里取出約1 ml樣品，立刻用孔徑0.22 μm的濾膜過濾除去懸浮的固體。濾液中總蛋白質(zhì)含量通過Bradford法確定［20］。通過從總的初始纖維素酶和牛血清蛋白添加量里扣除未吸附的纖維素酶和牛血清蛋白，可以確定吸附到纖維素上的酶量［26］。以沒有添加纖維素酶的底物作為空白實(shí)驗(yàn)以去除木質(zhì)纖維素底物中蛋白質(zhì)的影響。

Langmuir吸附動(dòng)力曲線通常用于描述纖維素酶在底物上的吸附過程。為確定吸附等溫線，不同質(zhì)量的纖維素酶（6.5～18 mg·g-1葡聚糖）加入到100 ml的0.05 mol·L-1檸檬酸緩沖溶液里，反應(yīng)體系中葡聚糖含量控制為1%，在4℃保持90 min從而達(dá)到吸附平衡。吸附到底物上的纖維素酶量確定方法同上。吸附參數(shù)（最大吸附量Wmax，平衡常數(shù)K）通過使用Origin軟件模擬Langmuir吸附方程確定［29］。

式中，W為吸附的蛋白質(zhì)量，mg·ml-1；K為吸附平衡常數(shù)，ml·mg-1；C為游離蛋白質(zhì)量，mg·ml-1。

1.4預(yù)處理對木質(zhì)纖維素底物酶水解效率的影響

濃度0.05 mol·L-1檸檬酸（pH 4.5）緩沖溶液水解反應(yīng)體系中，葡聚糖含量為1 g/100 ml。所有反應(yīng)成分添加到150 ml的三角瓶里，總體積為100 ml。體系在50℃的水浴鍋中反應(yīng)12 h，轉(zhuǎn)速160 r·min-1。添加纖維素酶之前，在預(yù)置的溫度下反應(yīng)體系維持15 min從而使體系達(dá)到平衡。纖維素酶添加量6.5 mg·（g葡聚糖）-1，不同底物的酶水解程度（還原糖生成量）被確定。分別在1、2、4、8和12 h取大約1 ml的反應(yīng)混合物，取樣后立刻煮沸10 min進(jìn)行酶滅活，然后用三硝基水楊酸法（DNS）確定還原糖生成量［14，30］。反應(yīng)體系中沒有酶和沒有底物的空白實(shí)驗(yàn)作為對照組。

為了研究纖維素酶吸附量與底物水解程度之間的關(guān)系，不同初始量的纖維素酶（6.5～18 mg·g-1葡聚糖）分別加入到上述反應(yīng)體系中。

1.5X射線衍射分析

原料與不同處理的木質(zhì)纖維素的X射線衍射結(jié)晶度通過使用Bruker D8衍射儀測得。其中，掃描范圍10°～50°，掃描速度2 （°）·min-1，掃描電壓與電流分別為30 kV、30 mA。玉米秸稈的結(jié)晶度（CrI），通過衍射數(shù)據(jù)及Segal方程計(jì)算獲得［31］

式中，I002為木質(zhì)纖維素結(jié)晶區(qū)（纖維素）的強(qiáng)度，2θ=22°；Iam為非結(jié)晶區(qū)（半纖維素、木質(zhì)素）峰強(qiáng)度，2θ=18°。

2　結(jié)果與討論

2.1不同處理對木質(zhì)纖維素化學(xué)成分的影響

表1總結(jié)了預(yù)處理前后木質(zhì)纖維素主要成分含量的變化情況。與未處理和其他手段處理獲得的木質(zhì)纖維素相比，NaOH處理脫除最多的木質(zhì)素。同時(shí)，由于部分木質(zhì)素的脫除，所有預(yù)處理方法均導(dǎo)致底物中葡聚糖和木聚糖成分相對含量提高。NaOH處理有最低的物料得率，ASSP次之，而堿性H2O2處理有最高的物料得率，這不僅與木質(zhì)素脫除有關(guān)，還與提取物溶解和葡聚糖、木聚糖部分降解有關(guān)。結(jié)果表明，NaOH處理是一種非常有效的脫除木質(zhì)素方法，氫氧根離子更容易破壞成分之間的化學(xué)鍵，使木質(zhì)素溶解在堿溶液里，從而導(dǎo)致大量木質(zhì)素脫除［32］。

表1　R預(yù)處理前后底物組分含量Table 1　Compositions for corn stover solids produced by different delignification approaches/%

2.2纖維素酶在不同底物上的吸附

纖維素酶吸附到底物表面上通常是木質(zhì)纖維素酶水解的第1步。對于內(nèi)切纖維素酶，深入了解其吸附過程對理解底物酶水解機(jī)制有重要作用。圖1顯示了不同木質(zhì)纖維素底物的纖維素酶吸附曲線。對所有底物，酶吸附在15 min內(nèi)達(dá)到最大值，并在90 min內(nèi)基本達(dá)到平衡，這個(gè)結(jié)果和相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果一致［28］。與原木質(zhì)纖維素相比［2.5 mg·（g 葡聚糖）-1］，木質(zhì)素含量最低的NaOH處理的底物具有最高的纖維素酶吸附量［4.7 mg·（g 葡聚糖）-1］，ASSP次之［3.5 mg·（g 葡聚糖）-1］，而堿性H2O2處理有最低的纖維素酶吸附量［3.2 mg·（g 葡聚糖）-1］，表明木質(zhì)素和半纖維素的脫除有利于纖維素酶的吸附。

圖1　纖維素酶在不同處理底物上的吸附曲線Fig.1　Cellulase adsorption kinetics for different substrates

圖2　4℃不同底物的Langmuir等溫吸附曲線Fig.2　Adsorption of cellulase versus unbound enzyme at 4℃ characterized by Langmuir adsorption isothermal

Langmuir吸附等溫曲線通常用于描述不同底物的吸附行為［29，33］。4℃條件下，內(nèi)切纖維素酶的吸附行為滿足Langmuir方程（R2＞0.95），如圖2所示。通過模擬Langmuir得到的吸附常數(shù)、最大吸附量和底物與酶的結(jié)合強(qiáng)度（吸附常數(shù)與最大吸附量的乘積），見表2。很明顯，NaOH處理的底物具有最大的纖維素酶吸附能力（比原木質(zhì)纖維素提高20%），ASSP次之（比原木質(zhì)纖維素提高15%），而堿性H2O2處理有最小的纖維素酶吸附能力（比原木質(zhì)纖維素提高12%），這與之前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是一致的。結(jié)果表明，通過預(yù)處理脫除木質(zhì)素有利于纖維素酶的吸附，從而促進(jìn)更多的酶與底物相結(jié)合。同時(shí)，這些預(yù)處理方法中，NaOH處理的固體所具有的吸附常數(shù)幾乎是其他預(yù)處理方法產(chǎn)生底物的酶吸附常數(shù)平均值的2倍，這可能與NaOH處理能最大程度脫除木質(zhì)素有關(guān)。NaOH處理的底物有較大酶吸附能力，木質(zhì)素脫除可能是一個(gè)潛在的主要原因，因?yàn)樘幚磉^程中孔洞的產(chǎn)生及木質(zhì)素與碳水化合物的復(fù)合物被破壞引起空間位阻作用減小，從而提高了底物的可及性［11］。

表2　R不同底物的最大吸附量（Wmax），吸附常數(shù)（K）及結(jié)合強(qiáng)度（T=WmaxK）Table 2　Maximum cellulase adsorption capacities （Wmax），affinity constants （K）， and strengths of adsorption（T=WK） for corn stover solids

2.3不同預(yù)處理木質(zhì)纖維素酶水解效率的比較

控制相同的初始酶添加量［6.5 mg·（g 葡聚糖）-1］，對預(yù)處理前后的的玉米秸稈進(jìn)行酶水解動(dòng)力學(xué)研究。圖3中，NaOH處理的底物12 h內(nèi)酶解效率最大，為18.9%，ASSP次之，為15.6%，原玉米秸稈為最小，為7.3%，而堿性H2O2處理的底物為15%?？偟貋砜矗械孜锩杆庑示桓?，這與所用纖維素酶是內(nèi)切纖維素酶有關(guān)，而內(nèi)切纖維素酶通常更傾向作用于非結(jié)晶區(qū)纖維素［34］。與原材料相比，所有預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物酶降解效率均有顯著的提高，這是因?yàn)槊摮举|(zhì)素對底物酶水解中有重要影響。與本發(fā)現(xiàn)類似，研究報(bào)道木質(zhì)素為含量14.6%的石灰處理的底物具有最高酶解效率，這與其較高的纖維素酶吸附能力有關(guān)［25］。據(jù)報(bào)道，隨著木質(zhì)素的脫除，纖維素的降解逐漸提高［35］。對于木質(zhì)素含量比較高的木質(zhì)纖維素，木質(zhì)素對于底物酶水解效率具有重要影響，部分脫除木質(zhì)素有助于獲得較高的糖轉(zhuǎn)化率。

圖3　不同預(yù)處理底物酶解效率比較Fig.3　Comparison of enzymatic saccharification over different reaction time for different delignified substrates

2.4不同底物的吸附能力與酶解之間的關(guān)系

纖維素酶吸附量與酶作用有效性是影響纖維素水解的兩個(gè)主要方面［34］。一般認(rèn)為，纖維素酶吸附到底物表面或嵌插其內(nèi)部是木質(zhì)纖維素酶水解的第1步。為了確定纖維素酶吸附量與酶降解之間的關(guān)系，分別在兩種情況下對12 h酶水解效率與纖維素酶吸附量進(jìn)行比較，一種是相同纖維素酶初始添加量下不同底物之間的比較，另一種是固定底物濃度而改變初始纖維素酶添加量。結(jié)果表明，相同纖維素酶初始添加量下不同底物之間，底物酶解效率與纖維素酶吸附量之間均具有較好的線性關(guān)系（R2＞0.80），如圖4（a）～（e）；而通過改變初始纖維素酶添加量，所有反應(yīng)底物的酶水解效率與所測纖維素酶吸附量明顯呈線性關(guān)系（R2＞0.90），如圖4（f）所示。其他文獻(xiàn)也報(bào)道了纖維素水解與酶吸附能力有很好的線性關(guān)系［36］。這種線性關(guān)系表明，提高底物對纖維素酶的吸附量是促進(jìn)木質(zhì)纖維素底物酶水解產(chǎn)糖的最重要因素之一［27］。

2.5濃堿進(jìn)一步脫除木質(zhì)素對成分的影響

為研究更劇烈脫除木質(zhì)素對木質(zhì)纖維素底物成分的影響，用不同質(zhì)量濃度的NaOH溶液處理原木質(zhì)纖維素以選擇性脫除木質(zhì)素。見表3，預(yù)處理后50%～90%的木質(zhì)素被脫除。原材料在更劇烈的處理?xiàng)l件下，木質(zhì)素脫除更為有效，這可能由于木質(zhì)素更容易遭到破壞。但同時(shí)隨著NaOH處理濃度的增大，木質(zhì)素脫除率的增長幅度逐漸減小，且處理后物料得率明顯下降，尤其是在劇烈的處理?xiàng)l件下。隨著更為劇烈地脫除木質(zhì)素，葡聚糖和木聚糖的保留率分別從95%、90%下降到46.6%、81%，木聚糖保留率明顯比葡聚糖保留率減少得更多，表明濃堿處理過程中半纖維素比纖維素更容易遭到破壞。

圖4　不同底物的纖維素酶吸附能力與12 h酶解效率之間關(guān)系Fig.4　Relationship between cellulase adsorption capacity and 12 h enzymatic digestibility for raw material and pretreated corn stover solids

2.6濃堿進(jìn)一步脫除木質(zhì)素對纖維素酶吸附及酶水解的影響

預(yù)處理脫除木質(zhì)素有利于纖維素酶吸附及底物酶降解。目前為止，已經(jīng)提出了幾個(gè)機(jī)制解釋木質(zhì)素對酶解的影響。盡管一般認(rèn)為木質(zhì)素通過阻止底物對纖維素酶的可及性減緩水解過程，但木質(zhì)素脫除是提高底物可及性還是提高酶作用有效性還是其共同作用仍有爭議。因此本研究嘗試確定進(jìn)一步脫除木質(zhì)素對底物可及性和酶水解的影響，而初始纖維素酶添加量仍為6.5 mg·（g 葡聚糖）-1。

進(jìn)一步脫除木質(zhì)素對纖維素酶吸附及底物酶水解的影響如圖5所示。由圖可見，一定程度地脫除木質(zhì)素明顯有利于提高底物可及性，而在更劇烈的處理?xiàng)l件下進(jìn)一步脫除木質(zhì)素卻不利于底物對纖維素酶的吸附，呈現(xiàn)出底物可及性下降的趨勢。據(jù)報(bào)道，脫除木質(zhì)素過程中，預(yù)處理產(chǎn)生孔洞并打破木質(zhì)素與碳水化合物之間的復(fù)合物，能有效提高纖維素的可及性［37］。然而，木質(zhì)素含量減少到一定程度，將不會(huì)對酶水解有明顯作用［38］。一種可能的原因是，劇烈的處理過程中大量非結(jié)晶區(qū)纖維素被破壞，影響了纖維素的結(jié)構(gòu)。而內(nèi)切纖維素酶通常對非結(jié)晶區(qū)纖維素有更高的親和作用力，因此導(dǎo)致木質(zhì)纖維素底物可及性的下降。

表3　R進(jìn)一步脫除木質(zhì)素后底物組分及結(jié)晶度Table 3　Lignin removal， solid yield， compositions and crystallinity of extensive delignified corn stover solids/%

圖5　進(jìn)一步脫除木質(zhì)素對底物可及性與酶水解的影響Fig.5　Effect of selective lignin removal by different concentrations of NaOH on cellulase adsorption capacity and enzymatic digestibility

同時(shí)，圖5中顯示，處理后底物的酶水解行為與纖維素對酶的吸附呈現(xiàn)相似規(guī)律。當(dāng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaOH處理木質(zhì)纖維素而脫除85%的木質(zhì)素時(shí)，預(yù)處理的底物具有最高的酶水解效率。然而，原木質(zhì)纖維素經(jīng)更劇烈NaOH（3%、4%）處理，分別脫除88.90%和91.10%的木質(zhì)素時(shí)，預(yù)處理后底物的酶水解效率反而下降。更高水平的脫除木質(zhì)素沒有明顯提高底物的可及性，也不會(huì)引起底物相應(yīng)的高水平酶水解效率，呈現(xiàn)出邊際效應(yīng)，從而再次表明在木質(zhì)纖維素有效生成可發(fā)酵糖過程中，提高底物可及性是比脫除木質(zhì)素更為重要的考慮因素。

上述結(jié)果顯示，更高水平的脫除木質(zhì)素沒有引起更高的酶降解效率。其中，一個(gè)可能的原因是酶水解過程受底物結(jié)晶度的影響。通常高結(jié)晶度不利于底物酶水解［39-41］，因?yàn)榻Y(jié)晶區(qū)的纖維素不易被纖維素酶尤其是內(nèi)切纖維素酶水解。表3中，隨著NaOH濃度增大，處理后底物的結(jié)晶度不斷增大，從而不利于底物的水解。另外，在進(jìn)一步處理過程中，由于木質(zhì)素對纖維素酶形成的物理障礙已被充分移除，因此木質(zhì)素已不再是酶水解過程中的主要障礙［37］，底物酶水解效率開始取決于其他重要的因素［17，23］。同時(shí)，在進(jìn)一步脫除木質(zhì)素的過程中，大量的非結(jié)晶區(qū)纖維素被破壞而減少［40］，不利于內(nèi)切纖維素酶的吸附而導(dǎo)致底物酶降解效率的下降。

3　結(jié)　論

與其他預(yù)處理方法相比，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaOH處理后底物木質(zhì)素含量最低，并且分別有最高的底物可及性［4.7 mg·（g 葡聚糖）-1］與酶解效率（18.9%），而除原木質(zhì)纖維素外堿性H2O2處理后底物的可及性與酶解效率最低，表明木質(zhì)素脫除在木質(zhì)纖維素酶水解過程中有重要作用。對各反應(yīng)底物，木質(zhì)纖維素酶水解效率與纖維素酶吸附量具有很好的線性關(guān)系，適當(dāng)脫除木質(zhì)素能很好提高底物可及性與酶解效率。然而，進(jìn)一步脫除木質(zhì)素不利于可及性與底物酶解效率的提高。因此，為獲得更加有效的酶水解，采用適當(dāng)?shù)哪举|(zhì)素脫除手段并提高底物對纖維素酶的可及性是極為重要的考慮因素。

References

［1］HIMMEL M E， DING S-Y， JOHNSON D K， et al. Biomass recalcitrance： engineering plants and enzymes for biofuels production［J］. Science， 2007， 315 （5813）： 804-807.

［2］ZHANG Y H P， DING S Y， MIELENZ J R， et al. Fractionating recalcitrant lignocellulose at modest reaction conditions ［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2007， 97 （2）： 214-223.

［3］崔美， 黃仁亮， 蘇榮欣， 等. 木質(zhì)纖維素新型預(yù)處理與頑抗特性［J］. 化工學(xué)報(bào)， 2012， 63 （2）： 677-687. DOI： 10.3969/j.issn.0438-1157.2012.03.002. CUI M， HUANG R L， SU R X， et al. An overview on lignocellulose pretreatment and recalcitrant ［J］. CIESC Journal， 2012， 63 （2）：677-687. DOI： 10.3969/j.issn.0438-1157.2012.03.002.

［4］MOSIER N， WYMAN C， DALE B， et al. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass ［J］. Bioresource Technology， 2005， 96 （6）： 673-686.

［5］劉黎陽， 牛坤， 劉晨光， 等. 離子液體預(yù)處理油料作物木質(zhì)纖維素［J］. 化工學(xué)報(bào)， 2013， 64 （S1）： 104-110. DOI： 10.3969/j.issn.0438-1157.2013.z1.015. LI L Y， NIU K， LIU C G， et al. Effect of ionic liquid pretreatment on lignocellulosic biomass from oilseeds ［J］. CIESC Journal， 2013， 64（S1）： 104-110. DOI： 10.3969/j.issn.0438-1157.2013.z1.015.

［6］KIM S， HOLTZAPPLE M T. Effect of structural features on enzyme digestibility of corn stover ［J］. Bioresource Technology， 2006， 97 （4）：583-591.

［7］ALVIRA P， TOMAS P E， BALLESTEROS M， et al. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis： a review ［J］. Bioresource Technology， 2010，101 （13）： 4851-4861.

［8］SALEHI S M A， KARIMI K， BEHZAD T， et al. Efficient conversion of rice straw to bioethanol using sodium carbonate pretreatment ［J］. Energy & Fuels， 2012， 26 （12）： 7354-7361.

［9］BERLIN A， BALAKSHIN M， GILLKES N， et al. Inhibition of cellulase， xylanase and β-glucosidase activities by softwood lignin preparations ［J］. Journal of Biotechnology， 2006， 125 （2）： 198-209.

［10］ DING S Y， LIU Y S， ZENG Y， et al. How does plant cell wall nanoscale architecture correlate with enzymatic digestibility？ ［J］. Science， 2012， 338 （6110）： 1055-1060.

［11］YU Z， JAMEEL H， CHANG H M， et al. The effect of delignification of forest biomass on enzymatic hydrolysis ［J］. Bioresource Technology，2011， 102 （19）： 9083-9089.

［12］LIU Z， PADMANABHAN S， CHENG K， et al. Two-step delignification of miscanthus to enhance enzymatic hydrolysis： aqueous ammonia followed by sodium hydroxide and oxidants ［J］. Energy & Fuels， 2014， 28 （1）： 542-548.

［13］ MOU H， LI B， FARDIM P. Pretreatment of corn stover with the modified hydrotropic method to enhance enzymatic hydrolysis ［J］. Energy & Fuels， 2014， 28 （7）： 4288-4293.

［14］KIM S， HOLTZAPPLE M T. Lime pretreatment and enzymatic hydrolysis of corn stover ［J］. Bioresource Technology， 2005， 96 （18）：1994-2006.

［15］LI C， WANG L， CHEN Z， et al. Ozonolysis pretreatment of maize stover： the interactive effect of sample particle size and moisture on ozonolysis process ［J］. Bioresource Technology， 2015， 183： 240-247.［16］SELIG M J， VINZANT T B， HIMMEL M E， et al. The effect of lignin removal by alkaline peroxide pretreatment on the susceptibility of corn stover to purified cellulolytic and xylanolytic enzymes ［J］. Applied biochemistry and Biotechnology， 2009， 155 （1/2/3）： 94-103.

［17］ LI M， FOSTER C， KELKAR S， et al. Structural characterization of alkaline hydrogen peroxide pretreated grasses exhibiting diverse lignin phenotypes ［J］. Biotechnology Biofuels， 2012， 5 （1）： 38.

［18］KLEMAN-LEYER K M， SIIKA-AHO M， TEERI T T， et al. The cellulases endoglucanase Ⅰ and cellobiohydrolase Ⅱ of Trichoderma reesei act synergistically to solubilize native cotton cellulose but not to decrease its molecular size ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1996， 62 （8）： 2883-2887.

［19］GHOSE T. Measurement of cellulase activities ［J］. Pure and Applied Chemistry， 1987， 59 （2）： 257-268.

［20］SMITH P， KROHN R I， HERMANSON G， et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid ［J］. Analytical Biochemistry， 1985，150 （1）： 76-85.

［21］CHEN M， ZHAO J， XIA L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility ［J］. Biomass and Bioenergy， 2009， 33 （10）： 1381-1385.

［22］SLUITER A， HAMES B， RUIZ R， et al. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass ［R/OL］. National Renewable Energy Laboratory （NREL）. 2007. http：//www.nrel.gov/biomass/pdfs/ 42618.pdf.

［23］LI Q， GAO Y， WANG H， et al. Comparison of different alkali-based pretreatments of corn stover for improving enzymatic saccharification［J］. Bioresource Technology， 2012， 125： 193-199.

［24］QI B， CHEN X， SHEN F， et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of wheat straw pretreated by alkaline peroxide using response surface methodology ［J］. Industrial & Engineering Chemistry Research， 2009，48 （15）： 7346-7353.

［25］KUMAR R， WYMAN C E. Cellulase adsorption and relationship to features of corn stover solids produced by leading pretreatments ［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2009， 103 （2）： 252-267.

［26］ROLLION J A， ZHU Z， SATHITSUKSANOH N， et al. Increasing cellulose accessibility is more important than removing lignin： a comparison of cellulose solvent-based lignocellulose fractionation and soaking in aqueous ammonia ［J］. Biotechnology and Bioengineering，2011， 108 （1）： 22-30.

［27］YANG B， WYAMN C E. BSA treatment to enhance enzymatic hydrolysis of cellulose in lignin containing substrates ［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2006， 94 （4）： 611-617.

［28］ZHU Z， SATHITSUKSANOH N， VINZANT T， et al. Comparative study of corn stover pretreated by dilute acid and cellulose solvent-based lignocellulose fractionation： enzymatic hydrolysis， supramolecular structure， and substrate accessibility ［J］. Biotechnology and Bioengineering，2009， 103 （4）： 715-724.

［29］DU R， SU R， LI X， et al. Controlled adsorption of cellulase onto pretreated corncob by pH adjustment ［J］. Cellulose， 2012， 19 （2）：371-380.

［30］ZHANG J， MA X， YU J， et al. The effects of four different pretreatments on enzymatic hydrolysis of sweet sorghum bagasse ［J］. Bioresource Technology， 2011， 102 （6）： 4585-4589.

［31］SEGAL L， CREELY J， MARTIN A， et al. An empirical method for estimating the degree of crystallinity of native cellulose using the X-ray diffractometer ［J］. Textile Research Journal， 1959， 29 （10）：786-794.

［32］CHANG V S， HOLTZAPPLE M T. Fundamental factors affecting biomass enzymatic reactivity ［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2000， 84 （1）： 5-37.

［33］LU Y， YANG B， GREGG D， et al. Cellulase adsorption and an evaluation of enzyme recycle during hydrolysis of steam-exploded softwood residues ［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2002，98/100 （1/2/3/4/5/6/7/8/9）： 641-654.

［34］ZHANG Y H P， LYND L R. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose： noncomplexed cellulase systems［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2004， 88 （7）： 797-824.

［35］LEU S Y， ZHU J. Substrate-related factors affecting enzymatic saccharification of lignocelluloses： our recent understanding ［J］. Bioenergy Research， 2013， 6 （2）： 405-415.

［36］KOTIRANTA P， KARLSSON J， SIIKA-AHO M， et al. Adsorption and activity of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Ⅰ， endoglucanaseⅡ， and the corresponding core proteins on steam pretreated willow［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 1999， 81 （2）： 81-90.

［37］ MOONEY C A， MANSFIELD S D， TOUHY M G， et al. The effect ofinitial pore volume and lignin content on the enzymatic hydrolysis of softwoods ［J］. Bioresource Technology， 1998， 64 （2）： 113-119.

［38］ZHU L， O'DWYER J P， CHANG V S， et al. Structural features affecting biomass enzymatic digestibility ［J］. Bioresource Technology，2008， 99 （9）： 3817-3828.

［39］MANSFIELD S D， MOONEY C， SADDLER J N. Substrate and enzyme characteristics that limit cellulose hydrolysis ［J］. Biotechnology Progress， 1999， 15 （5）： 804-816.

［40］FAN L， LEE Y H， BEARDMORE D. The influence of major structural features of cellulose on rate of enzymatic hydrolysis ［J］. Biotechnology and Bioengineering， 1981， 23 （2）： 419-424.

［41］FAN L， LEE Y H， BEARDMORE D H. Mechanism of the enzymatic hydrolysis of cellulose： effects of major structural features of cellulose on enzymatic hydrolysis ［J］. Biotechnology and Bioengineering， 1980，22 （1）： 177-199.

Comparison of different lignin removal processes for corn stover on cellulase adsorption and enzymatic hydrolysis

TIAN Shunfeng， CHENG Li， GU Zhengbiao， HONG Yan， LI Zhaofeng， LI Caiming
（State Key Laboratory of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China； School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China； Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China）

Experiments were conducted for various pretreated substrates to investigate the impact of lignin content on cellulase adsorption and substrate digestibility. Compared with other treatments， 2% （mass） NaOH pretreated solids with the highest level of lignin removal （85%） exhibited the highest accessibility to cellulase ［4.7 mg protein·（g glucan）-1］ and enzymatic digestibility （18.9%）. The obtained maximum adsorption capacity （Wmax） and equilibrium constant （K） derived from fitting the Langmuir adsorption isotherm for different delignified substrates indicated that the removal of lignin benefited cellulase adsorption. The relationship between cellulase adsorption capacities and enzymatic digestibility for raw and pretreated solids correlated well （R2＞0.8）， supporting the hypothesis that carbohydrate conversion was primarily dominated by enhancing substrate accessibility owing to lignin removal. Nevertheless， further delignification by NaOH with concentrations of 3% （mass） and 4% （mass）was unfavorable to improving substrate accessibility to cellulase and enhancing carbohydrates conversion to monosaccharide. It appeared that the appropriate delignification to some degree was a significant pretreatment factor to be taken into consideration to achieve more effectively enzymatic digestibility.

date： 2015-10-19.

chenglichocolate@163.com

supported by the Key Program of the National Natural Science Foundation of China （31230057）， the National Natural Science Foundation of China （31371787） and the Twelfth Five-Year National Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of China （2012BAD34B07）.

corn stover； biomass； bioenergy； cellulase adsorption； pretreatment； lignin removal； enzymatic digestibility

TS 721.1

A

0438—1157（2016）05—2084—09

2015-10-19收到初稿，2016-01-08收到修改稿。

聯(lián)系人：程力。第一作者：田順風(fēng)（1990—），男，碩士研究生。

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31230057）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371787）；十二五科技部國家重點(diǎn)科技研究與發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（2012BAD34B07）。