慈姑活性成分對體外肝細胞損傷的保護作用

李冰 林殷 王春國 王晶 奚茜 潘詩霞 馬芳芳 呂威 廖艷

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論 著

慈姑活性成分對體外肝細胞損傷的保護作用

李冰 林殷 王春國 王晶 奚茜 潘詩霞 馬芳芳 呂威 廖艷

目的 研究慈姑活性成分的保肝作用及其機理。方法 采用系統(tǒng)化學(xué)溶劑萃取法制備慈姑不同活性成分，培養(yǎng)HepG2型肝細胞，建立異煙肼和利福平合用致體外肝細胞損傷模型，給予慈姑不同活性成分處理后，利用MTT法檢測肝細胞的存活率，并檢測細胞培養(yǎng)上清液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、丙二醛的濃度。結(jié)果 與模型組比較，慈姑乙酸乙酯組、慈姑石油醚組、慈姑總提取物組和慈姑水提組的細胞存活率均增加（P＜0.01）；慈姑石油醚組、慈姑總提取物組和慈姑水提組均可降低肝細胞培養(yǎng)上清液中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、丙二醛的水平（P＜0.05），其中慈姑水提組效果最為明顯（P＜0.01）。結(jié)論提示慈姑水提部分對體外異煙肼和利福平合用致肝細胞損傷有較強保護作用，其作用可能與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

慈姑活性成分； 異煙肼； 利福平； 肝損傷

近年研究發(fā)現(xiàn)藥物性肝損傷已成為國內(nèi)外常見且較嚴重的藥源性疾?。?］。異煙肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampicin，RFP）是標準抗結(jié)核化療方案中一線藥物，然而均有肝毒性［2］，故使患者堅持抗結(jié)核治療的關(guān)鍵是尋找護肝辦法。慈姑Sagittaria Sagittifolia L.為藥食兼用的天然資源［3］，含有豐富的抗氧化營養(yǎng)素［4］，已有文獻報道慈姑汁能減輕INH/RFP［5］、鎘［6］和四氯化碳［7］引起的肝臟損傷，慈姑保肝效果明顯，然而針對慈姑保肝活性成分的研究尚未見報道。本實驗將進一步對其不同活性成分的保肝作用強弱進行深入研究，為慈姑的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

慈姑不同活性成分：取新鮮慈姑，去皮切片，烤箱55℃烘干，粉碎得慈姑粉，稱取20 g，加入6倍量70%的乙醇，冷浸提取48小時，并時時搖晃，提取液經(jīng)布氏漏斗抽濾，將濾液進行減壓旋蒸，濃縮至15 mL左右，獲得慈姑總提取物；取部分慈姑總提取物于100 mL分液漏斗中，依次加入3倍量石油醚、乙酸乙酯和正丁醇逐次萃取，分別獲得慈姑正丁醇部分、乙酸乙酯部分、石油醚部分及水提部分這4種慈姑不同化學(xué)成分。

利福平（RFP，北京華威銳科化工有限公司）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和異煙肼（INH）（sigma公司）。

1.2 實驗細胞與分組

人肝癌細胞株HepG2細胞株由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈予，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。將HepG2細胞隨機分成9組：空白組、正常對照組、模型（INH+RFP）組、陽性對照（維生素E）組和慈姑各活性成分組（即慈姑總提取物組、慈姑正丁醇組、慈姑乙酸乙酯組、慈姑石油醚組和慈姑水提組）。

1.3 儀器設(shè)備

DU800紫外/可見光分光光度計（美國貝克曼庫爾特有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（日本 SANYO公司）；超凈工作臺（日本SANYO公司）；酶標儀（美國BIORED）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；高速離心機（美國IEC）。

1.4 細胞存活率的檢測

取HepG2細胞以每孔5×104個/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。24小時后，按1.2分組加藥，即空白組無細胞，只加培養(yǎng)基；正常對照組加入正常培養(yǎng)液；模型組加入INH/RFP使其質(zhì)量濃度為（0.1+0.2）mg/mL；陽性對照組加入質(zhì)量濃度為50 μmol/mL的維生素E；慈姑各活性成分組分別加入質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的各慈姑活性成分，加入慈姑各活性成分或維生素E，2小時后加入質(zhì)量濃度為（0.1+0.2）mg/mL的INH/RFP。每個組設(shè)6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，每孔加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10分鐘，放入酶標儀上測定570 nm處的光吸收值，重復(fù)3次，計算細胞存活率。

細胞存活率=（實驗組-空白組）/（正常對照組-空白組）×100%。

1.5 損傷細胞培養(yǎng)液中LDH、ALT、AST、MDA的釋放

取HepG2細胞以每孔5×104個/mL接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，按1.2分組加藥，24小時后收集上清，按試劑盒說明書步驟測定上清液中 LDH、ALT、AST、MDA活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，2個獨立樣本組間均數(shù)比較用t檢驗；多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慈姑各活性成分對肝細胞活力的影響

與正常對照組比較，模型組的細胞存活率明顯降低，具有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，經(jīng)慈姑各活性成分及維生素E的保護后細胞存活率由 56.0%分別增加到 57.9%、63.8%、61.4%、86.4%、83.3%和87.7%。其中慈姑正丁醇組與損傷組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其它組均差異顯著（P＜0.01）。見表1。

表1 MTT法測定各組細胞存活率情況（±s）

注：與正常對照組相比，aP＜0.01；與模型組相比，bP＜0.01。

組別　n　A值（OD）　　細胞存活率（%）正常對照組87.7 6　0.8422±0.0250　100 INH/RFP模型組　6　0.4717±0.0189a　56.0慈姑正丁醇組　6　0.4880±0.0205　57.9慈姑乙酸乙酯組　6　0.5372±0.0179b　63.8慈姑石油醚組　6　0.5173±0.0385b　61.4慈姑水提組　6　0.7278±0.0219b　86.4慈姑總提取物組　6　0.7018±0.0320b　83.3維生素E組　6　0.7382±0.0324b

2.2 慈姑各活性成分對肝細胞LDH、ALT、AST、MDA釋放的影響

HepG2細胞與INH/RFP共同孵育24小時后，細胞培養(yǎng)上清液中的LDH、ALT、AST、MDA水平均較正常組明顯升高，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，經(jīng)過慈姑各活性成分及維生素E處理后，細胞培養(yǎng)上清液中的LDH、ALT、AST、MDA水平均有下降，其中慈姑石油醚組、慈姑總提取物組和慈姑水提組的四個指標均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），尤其是慈姑水提組效果最明顯，具有顯著性差異（P＜0.01）。提示慈姑各活性成分均有保肝作用，效果最好的存在于水提部分。見表2。

3 討論

INH與RFP合用會明顯增加肝毒性。INH主要在肝臟進行代謝，在N-乙酰轉(zhuǎn)移酶和酰胺鍵水解酶的作用下，直接或間接生成具有肝毒性的乙酰肼和肼；而RFP誘導(dǎo)的肝藥酶加速了異煙肼的代謝［8-9］，代謝產(chǎn)物可產(chǎn)生大量的氧自由基，攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)可進一步加重生物膜的損傷，最終導(dǎo)致肝細胞損傷甚至壞死。本實驗選擇檢測培養(yǎng)基中LDH、ALT、AST、MDA的活性，通過肝細胞損傷的常用檢測指標來評價肝細胞的損傷情況并通過MTT實驗來檢測肝細胞的生長和存活情況。

本實驗結(jié)果顯示：INH與RFP合用損傷肝細胞后，與正常組相比，細胞存活率明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計有顯著性差異（P＜0.01），細胞培養(yǎng)上清液中的LDH、ALT、AST、MDA水平顯著升高，經(jīng)統(tǒng)計有顯著性差異（P＜0.01），表明造模成功，INH與RFP合用損傷肝細胞的機制與脂質(zhì)過氧化相關(guān)；給予慈姑各活性成分處理后，與模型組相比，細胞存活率有所升高，除慈姑正丁醇組之外，都有顯著差異（P＜0.01），細胞培養(yǎng)上清液中的LDH、ALT、AST、MDA水平有所降低，其中慈姑石油醚組、慈姑總提取物組和慈姑水提組的四個指標均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），尤其是慈姑水提組效果顯著（P＜0.01）。綜上，慈姑各活性成分中保肝效果最好的存在于水提部分，其保肝機制可能與清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

慈姑在中國資源豐富，民間常為藥用和風(fēng)味食用，已有研究證明其有抗氧化［10］、調(diào)節(jié)免疫［11］、降糖［12］等生物活性，本實驗初步揭示了慈姑活性成分具有保護肝細胞的作用，作為一種廣泛栽培、價格低廉的藥食同源資源，有望成為未來保肝產(chǎn)品的開發(fā)利用熱點，本研究初步篩查出慈姑保肝效果最顯著的活性成分存在于水提部分，有關(guān)慈姑水提部分的有效濃度范圍、保肝水提部分的主要活性成分及其作用機理值得進一步探討。

表2 各組LDH、ALT、AST、MDA的釋放情況（±s）

表2 各組LDH、ALT、AST、MDA的釋放情況（±s）

注：與正常對照組相比，aP＜0.01；與模型組相比，bP＜0.05，cP＜0.01

組別　n　AST/（U/L）　ALT/（U/L）　LDH/（U/L）　MDA/（U/mg）.42 INH/RFP模型組　6　28.83±6.16a　42.32±6.37a　844.44±73.03a　4.14±0.91a慈姑正丁醇組　6　23.91±9.51　37.10±4.53　774.07±116.25　3.20±0.68b慈姑乙酸乙酯組　6　21.03±4.78b　32.38±4.27c　755.56±88.89　2.97±0.82c慈姑石油醚組　6　20.24±6.31b　34.09±4.41b　692.59±117.10c　3.14±0.97b慈姑水提組　6　18.36±4.29c　23.26±5.38c　466.67±76.98c　2.64±0.60c慈姑總提取物組　6　21.06±8.34b　22.74±6.34c　581.48±125.25c　2.51±0.61c維生素E組　6　18.83±5.29b　22.47±5.40c　400.00±54.43c　2.27±0.48正常對照組　6　15.42±6.02　18.74±6.49　222.22±24.34　1.41±0 c

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（本文編輯：蒲曉田）

Protective effects of active part of Sagittaria Sagittifolia L.on hepatocytes injury in vitro

LI Bing，LIN Yin，WANG Chun-guo，et al.School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

LIAO Yan，E-mail：liaoyanaa@163.com

Objective To study the protective effects and mechanism of active components of Sagittaria Sagittifolia L.on hepatocytes injury induced by co-administration of isoniazid and rifampin. Methods Different active ingredients of Sagittaria Sagittifolia L.were prepared by systemic chemical solvent extraction method.HepG2 liver cells were incubated，and injured by co-administration of isoniazid and rifampin.MTT assay was used to evaluate the survival rate of liver cells after the cells had been treated with active part of Sagittaria Sagittifolia L.，culture media were collected to detected the levels of ALT，AST，LDH and MDA.Results Compared with the model group，the cell viability of ethyl acetate extract group，petroleum ether extract group，the total extract group and the water extract group was increased（P＜0.01）；the content of ALT，AST，LDH and MDA was reduced after preventive treatment with petroleum ether extract，the total extract and the water extract，the effect of water extract group was especially obvious （P＜0.01）.Conclusion The water extract from Sagittaria Sagittifolia L.has strong protective effect on hepatocytes injury induced by co-administration of isoniazid and rifampin，which may be related to inhibiting the lipid peroxidation.

Active part of Sagittaria Sagittifolia L.； Isoniazid； Rifampicin； Hepatocytes Injury

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.08.001

國家自然科學(xué)基金（81503633）；北京中醫(yī)藥新奧獎勵基金（1000062720044/004）

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院［李冰（碩士研究生）、林殷、王晶（碩士研究生）、奚茜（碩士研究生）、潘詩霞（碩士研究生）、馬芳芳（博士研究生）、廖艷］，科研實驗中心（王春國）；針灸推拿學(xué)院［呂威（碩士研究生）］

李冰（1991-），女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)養(yǎng)生與康復(fù)。E-mail：1145571606@ qq.com

廖艷（1975-），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥理毒理學(xué)。E-mail：liaoyanaa@ 163.com

（2016-01-28）