化妝品中致敏原香豆素及其衍生物的高效液相色譜法測定及質(zhì)譜確證

孟憲雙，馬　強*，袁漢成，白　樺，張　慶，郭項雨

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京　100176；2.沃特世科技(上海)有限公司，上?！?01206)

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化妝品中致敏原香豆素及其衍生物的高效液相色譜法測定及質(zhì)譜確證

孟憲雙1，馬強1*，袁漢成2，白樺1，張慶1，郭項雨1

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100176；2.沃特世科技(上海)有限公司，上海201206)

建立了化妝品中致敏原香豆素及其7種衍生物(二氫香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、環(huán)香豆素、雙香豆素和醋硝香豆素)的高效液相色譜測定方法。樣品以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈(1∶9，體積比)混合溶液進(jìn)行超聲提取，提取液經(jīng)高速離心及微孔濾膜過濾后，ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱分離，0.05 mol/L乙酸銨溶液(含0.25%乙酸)和乙腈為流動相梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。疑似陽性樣品采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確證。結(jié)果表明，香豆素及其衍生物在一定濃度范圍內(nèi)線性良好(r2≥0.999 6)，定量下限為8～20 mg/kg。在低、中、高3個加標(biāo)水平下，香豆素及其衍生物的平均回收率為84.6%～100.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.8%～9.7%。該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好、特異性強，能夠為化妝品檢驗和日常生產(chǎn)質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)及技術(shù)支持。

香豆素及其衍生物；致敏原；高效液相色譜；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；化妝品

香豆素天然產(chǎn)物廣泛分布于植物界[1]，在日用化妝品中，通過添加一定量的香豆素類物質(zhì)，可增強化妝品的香氣[2]。香豆素類物質(zhì)對各種波長的光均有較強吸收，可引起皮膚的光敏感作用[3]，部分香豆素類物質(zhì)可引發(fā)肝損傷[4]，在使用高含量香豆素類化妝品的過程中，該類化合物可能通過皮膚進(jìn)入體內(nèi)[5]。歐盟化妝品指令(76/768/EEC)第七修正案規(guī)定[6]，香豆素作為致敏原在即洗型化妝品中含量超過0.01%或在滯留型化妝品中含量超過0.001%時必須在化妝品標(biāo)簽上予以標(biāo)注。鑒于香豆素衍生物可能具有與香豆素類似的毒副作用[7]，我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)[8]中規(guī)定，化妝品中限制或禁止使用香豆素衍生物，其中二氫香豆素、雙香豆素、環(huán)香豆素、醋硝香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素均被列入禁用物質(zhì)清單。

關(guān)于香豆素類致敏原的儀器分析方法大多為高效液相色譜法(HPLC)[9-11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[12-13]、氣相色譜法(GC)[14]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[15]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[16-17]等，采用的前處理方法多以甲醇或乙醇為提取溶劑超聲提取?？紤]到甲醇對唇膏等蠟質(zhì)類化妝品的分散效果不佳，不利于有效提取，并且目標(biāo)物質(zhì)在堿性溶劑中溶解效果較好，本研究比較了不同溶劑的提取效果，最終選用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈(1∶9，體積比，下同)混合溶液作為提取溶劑(對于蠟質(zhì)類樣品首先以四氫呋喃進(jìn)行分散)對香豆素類致敏原進(jìn)行超聲提取。優(yōu)化了各目標(biāo)分析物的檢測波長，并針對雙香豆素色譜峰形進(jìn)行了流動相種類及改性劑濃度的優(yōu)化，建立了化妝品中香豆素致敏原及其7種衍生物的高效液相色譜分析方法。對于疑似陽性樣品，進(jìn)一步采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確證，可有效避免假陽性結(jié)果產(chǎn)生。本方法準(zhǔn)確、可靠、特異性強且穩(wěn)定性好，可為化妝品中香豆素類致敏原的風(fēng)險監(jiān)測提供準(zhǔn)確可靠的技術(shù)手段。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；ACQUITY超高效液相色譜儀、XEVO TQ三重四極桿質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters 公司)；UV-3600型紫外可見光分光光度儀(日本Shimadzu公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；CR 21G高速冷凍離心機(日本Hitachi公司)；KQ-600超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS2型渦旋振蕩器(德國IKA公司)；AB204-S電子天平(美國Mettler Toledo公司)。

香豆素(CAS 91-64-5)、二氫香豆素(CAS 119-84-6)、7-甲氧基香豆素(CAS 531-59-9)、7-甲基香豆素(CAS 2445-83-2)、7-乙氧基-4-甲基香豆素(CAS 87-05-8)、環(huán)香豆素(CAS 518-20-7)、雙香豆素(CAS 66-76-2)及醋硝香豆素(CAS 152-72-7)標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于98%；甲醇、乙腈、四氫呋喃及二氯甲烷為色譜純(美國Fisher公司)；乙酸銨、氫氧化鈉(北京化工廠)及乙酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)均為分析純。

1.2高效液相色譜測定條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：A為0.05 mol/L乙酸銨(含0.25%乙酸)，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5.0 min，70%～55% A；5.0～8.0 min，55%～50% A；8.0～8.2 min，50%～10% A；8.2～13.0 min，10% A；13.0～13.2 min，10%～5%A；13.2～16.0 min，5% A；16.0～16.2 min，5%～70% A；16.2～18.0 min，70% A；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/ min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：香豆素、二氫香豆素、7-甲基香豆素和環(huán)香豆素為280 nm，雙香豆素和醋硝香豆素為306 nm，7-甲氧基香豆素和7-乙氧基-4-甲基香豆素為320 nm。

1.3高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證條件

色譜柱：XBridge Phenyl(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)；流動相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～4.5 min，70%～35% A；4.5～5.0 min，35%～5% A；5.0～6.0 min，5%A；6.0～6.1 min，5%～70%A；6.1～8.0 min，70%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

電噴霧離子源(ESI)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣：500 ℃，1 000 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；離子源溫度：150 ℃；萃取電壓：3.0 V；碰撞氣為氬氣；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；香豆素及其衍生物的前體離子、產(chǎn)物離子、錐孔電壓及碰撞能量等質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1　香豆素及其衍生物的質(zhì)譜分析參數(shù)

*ions with higher abundance

1.4標(biāo)準(zhǔn)儲備液及標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶中，除雙香豆素先用5 mL二氯甲烷溶解，再用乙腈定容至刻度外，其它目標(biāo)物均直接以乙腈溶解并定容至刻度。使用時以乙腈逐級稀釋成適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，均于4 ℃避光保存。

1.5樣品預(yù)處理

1.5.1化妝水、膏霜、香波與散粉類樣品稱取0.5 g試樣(精確至0.001 g)于具塞比色管中，加入8 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液-乙腈(1∶9)，渦旋振蕩混勻，在超聲波清洗器中超聲提取30 min，以1.0 mol/L乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，并用乙腈定容至10 mL，混勻，以10 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜，濾液供上機測定。

自2013年起，按照河北省文化廳邊遠(yuǎn)貧困地區(qū)人才支持計劃文化工作者專項工作要求與部署，河北省圖書館已圓滿完成4年的人才支持項目計劃，其中包括人員的選派工作和培養(yǎng)工作。在這四年間里，河北省圖書館共計派出業(yè)務(wù)骨干52人次進(jìn)行業(yè)務(wù)指導(dǎo)，包括讀者服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)化、業(yè)務(wù)管理自動化、數(shù)字資源推廣、文獻(xiàn)資源建設(shè)規(guī)范化等技術(shù)指導(dǎo)；為國定貧困縣公共圖書館培養(yǎng)了34名文化工作者，主要形式為組織各基層貧困縣公共圖書館工作人員到省館實地培養(yǎng)、以干代訓(xùn)，讓參加培養(yǎng)的學(xué)員邊學(xué)習(xí)、邊實踐，在實際工作中提高理論基礎(chǔ)和業(yè)務(wù)技能。

1.5.2唇膏類樣品稱取0.5 g試樣(精確至0.001 g)于具塞比色管中，先加入2 mL四氫呋喃，渦旋振蕩混勻，再加入6 mL 0.1 mol/L 氫氧化鈉水溶液-乙腈(1∶9)，渦旋振蕩混勻，其余步驟同“1.5.1”所述。

2　結(jié)果與討論

2.1檢測波長的選擇

采用紫外可見光分光光度儀對一定濃度的香豆素及其衍生物溶液進(jìn)行紫外波長全掃描(190～400 nm)，紫外光譜圖顯示，在210 nm波長下，各物質(zhì)的響應(yīng)強度較高，但在色譜分析過程中發(fā)現(xiàn)，隨著流動相中有機相比例的逐漸升高，基線漂移較為嚴(yán)重，因此未選擇210 nm作為最佳吸收波長。參照各目標(biāo)物質(zhì)的紫外光譜圖，選取的最優(yōu)檢測波長見“1.2”所述。

2.2流動相的優(yōu)化

根據(jù)香豆素及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及色譜保留行為相似的特點以及雙香豆素弱酸性的性質(zhì)，實驗比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液(含0.2%乙酸)、乙腈-0.05 mol/L乙酸銨溶液(含0.2%乙酸)和乙腈-0.05 mol/L乙酸銨溶液(含0.25%乙酸)作為流動相時的分離效果。結(jié)果表明，香豆素類物質(zhì)以甲醇-水洗脫時，隨著有機相比例的提升，基線漂移較嚴(yán)重；以乙腈-水作為流動相時，基線較平穩(wěn)，響應(yīng)強度較甲醇-水高，但雙香豆素的峰形前展嚴(yán)重；鑒于雙香豆素呈弱酸性，在流動相中添加了不同濃度的乙酸-乙酸銨緩沖體系，結(jié)果表明，雙香豆素在乙腈-0.05 mol/L乙酸銨溶液(含0.25%乙酸)流動相體系下的峰形較為對稱，且各目標(biāo)分析物實現(xiàn)了基線分離。香豆素及其衍生物的高效液相色譜圖見圖1。

2.3提取方法的優(yōu)化

2.4質(zhì)譜確證方法的優(yōu)化

鑒于化妝品基質(zhì)較為復(fù)雜的特點，在采用高效液相色譜法進(jìn)行分析時，其中的基質(zhì)成分可能會對目標(biāo)物的測定造成干擾。因此，本研究對疑似陽性樣品采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確認(rèn)。實驗結(jié)果表明，除雙香豆素和醋硝香豆素在電噴霧負(fù)電離模式下獲得較高豐度的[M-H]-前體離子外，其余6種目標(biāo)物均在電噴霧正電離模式下有較高響應(yīng)的[M+H]+前體離子。采用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，通過優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等主要參數(shù)，均獲得兩個響應(yīng)強度較高的產(chǎn)物離子。香豆素及其衍生物的質(zhì)譜確證圖譜見圖2。

2.5方法的特異性

為考察本方法的特異性，對空白溶劑及25例經(jīng)測定不含待測目標(biāo)物的化妝水、膏霜、乳液、散粉和唇膏類樣品進(jìn)行測定，代表性色譜圖見圖3。在目標(biāo)化合物出峰時間范圍內(nèi)，空白試樣無基質(zhì)干擾峰出現(xiàn)，表明方法建立的流動相洗脫程序合理，可有效避免樣品分析時的基質(zhì)干擾作用，提高方法對化妝品中香豆素及其衍生物檢測的特異性。

2.6線性關(guān)系、檢出限及定量下限

在最佳實驗條件下，移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈逐級稀釋成濃度分別為0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以色譜峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，香豆素及其衍生物在0.2～50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)不小于0.999 6(表2)。

向空白化妝品中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分渦旋混勻，按照本方法進(jìn)行處理和分析測定，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為方法的檢出限和定量下限。結(jié)果表明，對香豆素加標(biāo)水平分別為4 mg/kg和8 mg/kg的樣品進(jìn)行預(yù)處理和分析后，對應(yīng)的色譜峰信噪比分別約為3和10。以相同方式進(jìn)行樣品分析，確定了其它7種目標(biāo)化合物的檢出限和定量下限。8種化合物的檢出限為4～10 mg/kg,定量下限為8～20 mg/kg，結(jié)果見表2。

表2　香豆素及其衍生物的線性方程、檢出限及定量下限

2.7穩(wěn)定性考察

為考察目標(biāo)分析物在本方法中的穩(wěn)定性，分別制備0.5 μg/mL和5 μg/mL的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，日內(nèi)(0，3，9，12，15 h)伴隨標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定，計算含量，得到日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；連續(xù)測量5 d，計算得到日間RSD。經(jīng)測定，香豆素及其衍生物的日內(nèi)RSD及日間RSD均在0.5%～8.0%之間，表明方法具有較好穩(wěn)定性。

2.8回收率與精密度

稱取空白化妝品樣品0.5 g(精確至0.001 g)，分別添加低、中、高3個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以伴隨標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，進(jìn)行回收率實驗，結(jié)果見表3。香豆素及其衍生物的平均回收率為84.6%～100.7%，RSD為0.8%～9.7%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表3　化妝品中香豆素及其衍生物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

(續(xù)表3)

2.9實際樣品測定

應(yīng)用本實驗建立的方法對市售的進(jìn)出口化妝品(包括化妝水、膏霜、香波、散粉和唇膏類)共15例樣品進(jìn)行檢測，均未檢出目標(biāo)分析物，并通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證，無假陽性樣品出現(xiàn)。

3　結(jié)　論

本研究建立了不同類型化妝品中致敏原香豆素及其衍生物的高效液相色譜測定方法，疑似結(jié)果以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證，有效避免了假陽性結(jié)果。方法前處理簡便、特異性強、靈敏度高且穩(wěn)定性好，適用于化妝品中香豆素致敏原及其衍生物的測定。

[1]Liu J Y,Yang X D,Xu L Z,Yang S L.Chin.J.Chromatogr.(劉江云,楊學(xué)東,徐麗珍,楊世林.色譜)，2002,20(3):245-248.

[2]Ma Q,Bai H,Wang C,Li W T,Ma H J,Li J R,Meng X S,Chen Y X.J.Instrum.Anal.(馬強,白樺,王超,李文濤,馬會娟,李晶瑞,孟憲雙,陳云霞.分析測試學(xué)報),2014,33(3):248-255.

[3]Jiang J Q,Feng Y,Wang H M,Liu X Y,Zhang S W,Chen M Q.ActaPhysico-Chim.Sin.(江金強,馮艷,王紅梅,劉曉亞,張勝文,陳明清.物理化學(xué)學(xué)報),2008,24(11):2089-2095.

[4]The Federal Institute of Risk Assessment(BfR)[2013-12-23].http://ww.bfr.bund.de/cd/template/index_en.

[5]Ehrenforth S,Schenk J F,Scharrer I.Semin.Thromb.Hemost.,1999,25(1):79-83.

[6]Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council of 27 February 2003 Amending Council Directive 76/768/EEC on the Approximation of the Laws of the Member States Relating to Cosmetic Products.http://eur-lex.europa.eu/Lex-UriServ/LexUriServ.douri=OJ:L:2003:066:0026:0035:en:PDF.

[7]Pan T L,Wang P W,Aljuffali I A,Leu Y L,Hung Y Y,Fang J Y.Toxicol.Lett.,2014,226(2):173-181.

[8]Ministry of Health of the People's Republic of China.Hygienic Standard for Cosmetics.http://www.gov.cn/zwgk/2007-01/26/content_508651.htm.

[9]Xi H W,Ma Q,Li Q,Lei H M,Bai H,Wang C.J.Instrum.Anal.(席海為,馬強,李強,雷海民,白樺,王超.分析測試學(xué)報),2010,29(1):46-50.

[10]Xi H W,Ma Q,Wang C,Bai H ,Liu X,Wang Y.J.Instrum.Anal.(席海為,馬強,王超,白樺,劉茜,王燁.分析測試學(xué)報),2010,29(12):1168-1172.

[11]Cheng Y,Wang C,Xue Y M,Chen W,Wang X,Bai H,Cai T P,Hu K X.J.Instrum.Anal.(程艷,王超,薛一梅,陳偉,王星,白樺,蔡天培,胡孔新.分析測試學(xué)報),2008,27(2):196-199,202.

[12]Yang R J,Wei B W,Gao H,Yu W J.Chin.J.Chromatogr.(楊榮靜,衛(wèi)碧文,高歡,于文佳.色譜),2012,30(2):160-164.

[13]Zhang W,Zhu Z J,Zhang H,Zhang Y X.Chin.J.Anal.Lab.(張薇,朱智甲,張晗,張宇霞.分析試驗室),2012,31(5):104-108.

[14]Wisneski H H.J.AOACInt.,2001,84(3):689-692.

[15]Zhao X Y,Lin Y F,Hu X Z,Wang P,Fu X F,Li J.Chin.J.Anal.Lab.(趙曉亞,林雁飛,胡小鐘,王鵬,付曉芳,李晶.分析試驗室),2010,29(3):76-79.

[16]Li C Y,Li Z G,Zhou S Y,Ye D F,Liu W H.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(李長于,李祖光,周示玉,葉丹鳳,劉文涵.質(zhì)譜學(xué)報),2011,32(5):265-270.

[17]del Nogal Sanchez M,Perez-Pavon J L,Moreno Cordero B.Anal.Bioanal.Chem.,2010,397(6):2579-2591.

Determination of Coumarin Allergen and Its Derivatives in Cosmetics by HPLC and Their Verification by HPLC-MS/MS

MENG Xian-shuang1,MA Qiang1*,YUAN Han-cheng2,BAI Hua1,ZHANG Qing1,GUO Xiang-yu1

(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing100176,China；2.Waters Technologies(Shanghai),Ltd.,Shanghai201206,China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the determination of coumarin allergen and its seven derivatives,including dihydrocoumarin,7-methoxycoumarin,7-methylcoumarin,7-ethoxy-4-methylcoumarin,cyclocoumarol,dicoumarol and acenocoumarol in cosmetics.Cosmetic samples were ultrasonically extracted with 0.1 mol/L aqueous sodium hydroxide-acetonitrile(1∶9).The extract was centrifuged,and filtered by microporous membrane.The chromatographic separation for the analytes was achieved on a ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) column.Gradient elution was performed using 0.05 mol/L aqueous ammonium acetate solution(containing 0.25% acetic acid) and acetonitrile.The quantification was carried out by the external standard method,and the suspected samples were further verified by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The experimental results indicated that good linearities were observed over a certain concentration range with correlation coefficients better than 0.999 6,and the limits of quantitation(LOQs) were between 8 and 20 mg/kg.The average recoveries for the analytes at three spiked levels ranged from 84.6% to 100.7% with relative standard deviations(RSDs) of 0.8%-9.7%.The proposed method is accurate,robust and specific,and could provide scientific basis and a technical support for the inspection and quality control of cosmetics.

coumarin and its derivatives；allergen；high performance liquid chromatography(HPLC)；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；cosmetics

2015-12-19；

2016-02-01

國家科技支撐計劃項目(2013BAK04B03)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項項目(2012104013-4)；國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會計劃項目(20130980-T-607)

馬強，博士，副研究員，研究方向：消費品中化學(xué)危害物質(zhì)檢測技術(shù)及風(fēng)險評估，Tel：010-53897463，E-mail：maqiang@caiq.gov.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.004

O657.63；TQ658

A

1004-4957(2016)07-0799-06