一例豬偽狂犬病病毒的診斷

王　霞　福建省泉州市惠安縣農(nóng)林局　362100

一例豬偽狂犬病病毒的診斷

王霞福建省泉州市惠安縣農(nóng)林局362100

2015年11月，當(dāng)?shù)啬仇B(yǎng)殖戶15日齡仔豬出現(xiàn)角弓反張、精神沉郁等疑似豬偽狂犬病病毒感染的典型神經(jīng)癥狀，但查看免疫程序，已免疫豬偽狂犬病疫苗（Bartha-k61株）。經(jīng)gE基因血清學(xué)調(diào)查和針對(duì)gE基因的PCR診斷，證實(shí)該病例為豬偽狂犬病病毒感染所致。

豬偽狂犬病病毒感染gE基因診斷

豬偽狂犬病病毒 （porcine pseudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、α-皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）、水痘病毒屬（Varicellovirus）。PRV基因組為雙股DNA，病毒全基因組長(zhǎng)150 kb左右，病毒基因組中存在獨(dú)特長(zhǎng)（Unique long，UL）區(qū)和獨(dú)特短（Unique short，US）區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)PRV的GC含量超過70%，其UL區(qū)和US區(qū)序列在基因組中方向并不完全一致 （表現(xiàn)為同向和反向兩種情況）［1-4］。在US區(qū)中存在PRV的一種主要糖蛋白gE，該蛋白是一種主要的豬神經(jīng)性因子，促進(jìn)細(xì)胞融合后導(dǎo)致PRV在動(dòng)物機(jī)體有效擴(kuò)散，現(xiàn)已證實(shí)該蛋白在PRV入侵血腦屏障和疾病傳播中起到重要作用［5］。

當(dāng)前，在我國(guó)豬群中廣泛使用豬偽狂犬病病毒匈牙利弱毒株（Bartha-k61株）來防控PRV感染和傳播，使得PR曾經(jīng)在我國(guó)得到有效控制。對(duì)PRV疫苗株Bartha-k61株進(jìn)行基因組序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該株表現(xiàn)為gE基因缺失。基因缺失疫苗的出現(xiàn)，使PRV的血清學(xué)鑒別診斷成為可能。通過gE基因血清學(xué)鑒別診斷試劑盒，多國(guó)已啟動(dòng)PRV根除計(jì)劃，使PRV在全球部分國(guó)家已得到根除。

1　材料與方法

1.1豬偽狂犬病病毒gE基因血清學(xué)診斷采集仔豬血液后，按照常規(guī)分離血清的方法小心分離豬血清。按照豬偽狂犬病病毒gE抗體診斷試劑盒說明書推薦的步驟進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。

1.2豬偽狂犬病病毒gE基因病原學(xué)診斷

1.2.1病料采集和處理剖殺感染仔豬后，采集其肺臟、腹股溝淋巴結(jié)，研磨后反復(fù)凍融3次，4 000 r/ min離心20 min后，小心吸取上清備用。

1.2.2gE基因的擴(kuò)增針對(duì)PRV的gE基因特征，利用分子生物學(xué)軟件Oligo7設(shè)計(jì)引物。上游引物gE-1F：ATGACCTCAACGGCGACCTC；下游引物gE-1R：TCGCCCACCGCCACAAAGAACA。引物預(yù)期擴(kuò)增片段大小為460 bp。本研究擴(kuò)增采用動(dòng)物組織直接擴(kuò)增試劑盒，簡(jiǎn)要步驟如下：取試劑盒中的AD1試劑40 μL、AD2試劑10 μL，混勻后加入20 μL組織研磨液上清，繼續(xù)混勻一次，55℃水浴10 min后94℃作用 5 min，待恢復(fù)室溫后加入AD3試劑40 μL，混勻后作為PCR擴(kuò)增的模板基因組DNA。PCR反應(yīng)液的配置為，模板10 μL、上、下游引物（gE-1F/gE-1R，20 μM）各0.5 μL、2*PCR擴(kuò)增試劑20 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積40 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為，94℃預(yù)變性10 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，進(jìn)行常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3基因序列測(cè)定和分析符合試驗(yàn)預(yù)期的電泳目的條帶經(jīng)膠回收試劑盒切膠回收后，將目的片段與T克隆載體連接。隨機(jī)選取8個(gè)單菌落搖菌后提取相應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定所使用的引物為gE-1F/gE-1R，擴(kuò)增的目的片段大小仍為460 bp。該步PCR反應(yīng)液的配置為，模板1 μL，上、下游引物（gE-1F/gE-1R，20 μM）各1 μL，2*PCR擴(kuò)增試劑25 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積50 μL，PCR擴(kuò)增條件同上。將經(jīng)PCR驗(yàn)證符合試驗(yàn)預(yù)期的重組質(zhì)粒送由專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行BLAST分析比較。

2　結(jié)　果

2.1豬偽狂犬病病毒gE基因血清學(xué)檢測(cè)經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定，樣品OD450值為0.91。試劑盒陽性對(duì)照和陰性對(duì)照OD450值均符合試劑盒質(zhì)控要求，表明仔豬的偽狂犬病病毒gE基因血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果為陽性，經(jīng)查免疫程序發(fā)現(xiàn)，該豬已免疫豬偽狂犬病疫苗（Bartha-k61株），表明該豬群存在PRV感染。

2.2豬偽狂犬病病毒gE基因病原學(xué)檢測(cè)

2.2.1PCR檢測(cè)使用針對(duì)gE基因的引物 （gEF1/gE-R1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠上靠近500 bp條帶附近出現(xiàn)特異性條帶，與擴(kuò)增的預(yù)期相符，見圖1。

2.2.2序列測(cè)定將陽性重組質(zhì)粒經(jīng)序列測(cè)定后經(jīng)BLAST分析符合預(yù)期后獲得所擴(kuò)增的gE的核苷酸序列，結(jié)果如下。

ATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGA CCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCC TGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGT GTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCG GCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTC CTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGGTGAC CACGGTGTGCTTCGAGACCGCGTGCCACCCGGACC TGGTGCTGGGCCGCGCCTGCGTCCCCGAGGCCCGG GAGATGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGG TGCCGCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACC CCGGAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCG GGCCACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTG CACGACGCCTCCGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGT GGCGGTGGGCGA。

將擴(kuò)增的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)PRV分離株的gE基因 （GenBank號(hào)分別AF171937、KJ526427、KJ526429、KU601801和KU601804）進(jìn)行核苷酸同源性比較，可見本研究測(cè)定的gE基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)PRV分離株的gE基因核苷酸同源性均在99.0%以上，見圖2。

3　討　論

在過去一段時(shí)期內(nèi)，PRV曾經(jīng)在我國(guó)得到有效控制，但自2011年以來，我國(guó)多地均報(bào)道過免疫經(jīng)典PR弱毒疫苗 （Bartha k61株）后仍然發(fā)生典型PRV感染的情況。國(guó)內(nèi)多家單位對(duì)其病原學(xué)和疫苗學(xué)均進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)新近流行的PRV毒株與經(jīng)典PRV存在毒力差異和抗原性變異，PR疫苗（Bartha k61株）無法對(duì)豬群提供100%有效保護(hù)。但是，研究也發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)前尚無有效疫苗防控該型PRV之前，經(jīng)典疫苗仍可提供部分保護(hù)，專家建議需繼續(xù)對(duì)PR進(jìn)行免疫，可有效降低因PRV感染導(dǎo)致的損失［6-7］。

值得欣喜的是，目前針對(duì)該病疫苗的研究已見有大量的報(bào)道，如針對(duì)新PRV進(jìn)行g(shù)E單基因缺失、gE/gI雙基因缺失和gE/gI/TK多基因缺失在實(shí)驗(yàn)室均表現(xiàn)較好的免疫保護(hù)［8-9］，該免疫保護(hù)可同時(shí)抵抗經(jīng)典和新發(fā)PRV的感染。需要指出的是，疫苗的研發(fā)到上市還需要較長(zhǎng)的時(shí)間，豬場(chǎng)在當(dāng)前階段除繼續(xù)接種疫苗外，還需要在引種、日常飼養(yǎng)等環(huán)節(jié)加強(qiáng)防控，注意患病豬群的隔離和凈化，也可在一定程度上減少豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。

［1］陳煥春，方六榮，何啟蓋，等.豬偽狂犬病病毒鄂A株的分離鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，28（2）：156-161.

［2］童光志，陳煥春.偽狂犬病流行現(xiàn)狀及我國(guó)應(yīng)采取的防制措施［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，19（1）：1-2.

［3］王勤.豬偽狂犬病病毒gE基因的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2002，34（10）：42-44.

［4］Klupp B，Hengartner C，Mettenleiter T，et al.Complete，annotated sequence of the pseudorabies virus genome［J］.J Virol，2004，78（1）：424-440.

［5］李碧，朱玲，周遠(yuǎn)成，等.偽狂犬病毒神經(jīng)傳導(dǎo)研究［J］.病毒學(xué)報(bào)，2014，30（3）：332-337.

［6］彭金美，安同慶，趙鴻遠(yuǎn)，等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35 （1）：1-4.

［7］An T，Peng J，Tian Z，et al.Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs，China，2012［J］.Emerg Infect Dis，2013，19（11）：1749-1755.

［8］Gu Z，Dong J，Wang J，et al.A novel inactivated gE/gI deleted pseudorabies virus（PRV）vaccine completely protects pigs from an emerged variant PRV challenge［J］.Virus Res，2015，195：57-63.

［9］Hu R，Zhou Q，Song W，et al.Novel pseudorabies virus variant with defects in TK，gE and gI protects growing pigs against lethal challenge［J］.Vaccine，2015，33（43）：5733-5740.

The diagnosis of porcine pseudorabies virus

Wang Xia
（Huian county agricultural and forestry bureau，Quanzhou Fujian 362100）

At november of 2015，15-day-old piglets showed typical opisthotonus，depression and other neural symptoms，which shared the same as typical porcine pseudorabies virus（PRV）infection，but the piglets had been immunized with PR vaccine（Bartha-k61 strain）.Based on the epidemiological investigation and serological investigation，PCR diagnosis targeting with the gE gene of PRV，the results showed this was PRV infection.

porcine pseudorabies virus infection gE gene diagnosis

A

1003-4331（2016）04-0020-03