骨髓細胞髓過氧化物酶染色質控體系的建立

蔣朝暉，邱先艷，余紅嵐

(貴陽市第一人民醫(yī)院檢驗科　550002)

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骨髓細胞髓過氧化物酶染色質控體系的建立

蔣朝暉，邱先艷，余紅嵐△

(貴陽市第一人民醫(yī)院檢驗科550002)

目的探討自制乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝正常外周靜脈血片作為骨髓細胞髓過氧化物酶(MPO)染色陽性對照的可能性，初步建立MPO染色的質控體系。方法選取EDTA抗凝的正常外周靜脈血制成200張血片，分為不固定組和固定組(95%乙醇固定)，每隔15 d各組取10張血片進行MPO染色，觀察其陽性率和積分變化。結果血片中MPO酶活性隨著時間推移而減弱，經(jīng)95%乙醇固定后，其陽性率能維持90 d左右；而MPO陽性積分一直隨時間推移而減低，且固定組與不固定組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論可選用自制EDTA-K2抗凝正常外周靜脈血片經(jīng)95%乙醇固定后作為MPO染色的陽性對照，其有效期約為90 d。

骨髓細胞；髓過氧化物酶染色；外周靜脈血；陽性對照；質控體系

目前臨床主要依靠骨髓細胞形態(tài)學(M)、細胞免疫學(I)、細胞遺傳學(C)和分子生物學(M)聯(lián)合方法(MICM分型)對白血病進行診斷和分型[1]。但部分基層醫(yī)院受到設備及技術水平的限制，對于白血病的初步診斷還主要依靠形態(tài)學。由于白血病細胞的異質性和多態(tài)性，加上閱片人員的經(jīng)驗及水平差異，形態(tài)學判斷符合率較低(64%～77%)，但結合細胞化學染色后，其符合率能提高至86%左右[2-3]。常規(guī)或電鏡下的骨髓細胞髓過氧化物酶(MPO)染色對輔助判斷急性白血病形態(tài)學具有重要價值，能初步區(qū)分髓系與非髓系[4-5]。但在一些特殊病例中，比如MPO缺失患者[6]，或者個別急性淋巴細胞白血癥患者骨髓中原幼淋巴細胞異常增生會抑制其他系統(tǒng)發(fā)育，有時會很難見到成熟的粒細胞，即所謂的染色“內對照”很難找到，此時很難判斷是真的陰性結果還是試劑失效或操作失誤，因此引入質控物尤其是陽性對照對結果判讀至關重要。由于MPO染色實驗過程受到試劑有效期、環(huán)境溫度、細胞數(shù)量及孵育時間等因素影響，主觀性強，很難實現(xiàn)標準化?，F(xiàn)有報道多集中在MPO與疾病的相關性，而對于MPO染色實驗本身質量控制的報道少見，本研究擬利用自制抗凝外周血片作為陽性對照，摸索其保存時間及保存條件，探討其作為MPO染色陽性對照的可行性，初步建立MPO染色的質控體系。

1　材料與方法

1.1材料所有標本均來源于貴陽市第一人民醫(yī)院門診患者；主要試劑：MPO染色試劑(聯(lián)苯胺法，珠海貝索生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1選取合適的靜脈血制成血片選取的陽性對照血片細胞組成：白細胞9.2×109/L，中性粒細胞占60%、淋巴細胞占34%、單核細胞占5%、嗜酸性粒細胞占1%。制成血片200張，取一半用95%乙醇固定，即分為固定組與不固定組。

1.2.2MPO染色染色步驟嚴格按照試劑說明書進行：涂片干燥后，滴加聯(lián)苯胺液數(shù)滴(覆蓋血膜)，再滴加H2O2數(shù)滴(兩者比例1∶1)，室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗2 min；甩干，瑞姬氏染液與磷酸鹽緩沖液1∶2混合染色3～5 min，流水沖洗，干后鏡檢。陽性反應呈棕黃色、藍色至黑色顆粒。為了更準確反映其陽性程度，筆者參照中性粒細胞堿性磷酸酶染色積分判讀標準對MPO陽性細胞進行積分：(-)0分，細胞質中無陽性染色顆粒；(+)1分，細胞質中含少量棕黃色顆粒；(++)2分，細胞質中含中等量棕黃色顆粒、藍色或黑色顆粒；(+++)3分，細胞質中含較多棕黃色、藍色或黑色顆粒；(++++)4分，細胞質中或整個細胞覆蓋黑色顆粒。根據(jù)以上判讀標準，計數(shù)100個白細胞，記錄其陽性率及積分。

1.2.3摸索血片的保存條件將制成的血涂片在相對穩(wěn)定的環(huán)境(室溫20 ℃，相對濕度40%)中遮光保存，每隔15 d各組取10張血片進行MPO染色，比較其MPO陽性率和積分的變化。

2　結　果

2.1固定組及不固定組外周血MPO染色陽性率受時間影響情況不固定組MPO酶活性能維持60 d左右，60 d后陽性率逐漸下降(P<0.05)；而經(jīng)95%乙醇固定后，其酶活性能維持更長時間達90 d左右。見圖1。

2.2固定組及不固定組外周血MPO染色陽性積分受時間影響情況固定組與不固定組MPO陽性積分隨時間逐漸減低(P<0.05)，不固定組與固定組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1　固定組與不固定組MPO陽性率比較

圖2　固定組與不固定組MPO陽性積分比較

3　討　論

MPO是人體中中性粒細胞內含量最多的一種蛋白質，該酶是粒細胞進入循環(huán)之前在骨髓內合成并存在于嗜天青顆粒中的一種血紅素蛋白酶，主要存在于中性粒細胞、單核細胞和某些巨噬細胞中[7-9]。MPO陰陽性或者其陽性強度對白血病的鑒別診斷具有重要價值，朱竑等[2]報道MPO的陽性指數(shù)強弱順序為M3>M2b>M2a>M6>M4>M1>M5>ALL。但目前MPO染色均由人工完成，聯(lián)苯胺工作液有效期很短需要現(xiàn)配，陽性率會受到試劑有效期的影響；而陽性強度又與細胞數(shù)量、染色時間及環(huán)境溫度息息相關；結果判讀主觀性強。因此，如果沒有質控體系，很難保證MPO染色結果的精密度和準確性。

由于關于MPO染色實驗本身質量控制的報道少見，本研究首次摸索了自制抗凝外周血片，探討其作為MPO染色陽性對照的可行性，初步建立MPO染色的質控體系。本研究對陽性對照血片的保存條件和有效期進行了實驗驗證。實驗發(fā)現(xiàn)：已知細胞組成的外周血(同時存在較多的中性粒細胞和淋巴細胞)在20 ℃、40%濕度左右的環(huán)境中遮光保存，MPO酶活性隨著時間推移而減弱，經(jīng)95%乙醇固定后，其陽性率能維持90 d左右；而MPO陽性積分一直隨時間推移而減低，且固定組與不固定組沒有明顯差異。在隨后的工作中，將該質控品應用于標本檢測，使用方便，也不存在試劑浪費，較好地起到了質控作用。

綜上所述，批量制作已知細胞成分的外周血片，經(jīng)95%乙醇固定后，可作為MPO染色的陽性對照，其效期約為90 d。今后的研究將集中在選擇合適的固定劑或改變保存條件(低溫)能否延長其效期；另外，由于中性粒細胞堿性磷酸酶、特異性酯酶同樣存在于中性粒細胞中，同一份陽性對照能否同時應用于其他化學染色的實驗中都有待實驗驗證。

[1]Steven HS，Elias C，Nancy LH,et al．WHO classification of tumor of haematopoietic and lymphoid tissues[M]．4 th ed．Geneva Switzerland：World Health Organization，2008：14-36．

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[6]任繼欣，吳連杰，馮燕.白細胞髓系過氧化物酶缺失一例分析[J].臨床誤診誤治,2015,28(2):84-85.

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2016-04-13修回日期：2016-05-26)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.041

A

1673-4130(2016)15-2155-03

·臨床研究·