PIK3CA基因突變狀態(tài)在乳腺癌不同臨床病理特征中的研究

鄧粵敏，徐韞健

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510095；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510120)

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PIK3CA基因突變狀態(tài)在乳腺癌不同臨床病理特征中的研究

鄧粵敏1，徐韞健2△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510095；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510120)

目的檢測乳腺癌組織磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α(PIK3CA)基因突變狀態(tài)，并分析突變與臨床病理特征的關(guān)系。方法選取176例原發(fā)性乳腺癌患者石蠟組織標(biāo)本，提取組織DNA，對外顯子9及20 進(jìn)行探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(ARMS-PCR)擴(kuò)增，檢測PIK3CA基因的突變狀態(tài)，另取20 例乳腺腺病組織標(biāo)本作為陰性對照。結(jié)果176 例乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)突變45例，突變率25.6%，其中以20號外顯子H1047R突變率為主，突變率26.7%(12/45)；PIK3CA 基因突變在ER陽性和陰性、PR陽性和陰性患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在HER2陽性和陰性患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PIK3CA基因突變與乳腺癌患者腫瘤大小、年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)之間無明顯相關(guān)性，但與組織學(xué)分級有相關(guān)性。結(jié)論P(yáng)IK3CA基因突變與乳腺癌激素受體表達(dá)和腫瘤進(jìn)展相關(guān)，PIK3CA 基因突變檢測對指導(dǎo)臨床制訂個(gè)體化治療有重要意義。

乳腺癌；PIK3CA 基因；突變

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，并趨于年輕化，目前已成為女性發(fā)病第一的惡性腫瘤，約占女性惡性腫瘤的16%[1]。乳腺癌腫瘤組織的雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和表皮生長因子受體-2(HER2)的表達(dá)對乳腺癌預(yù)后的判斷及治療方案的選擇具有重要的指導(dǎo)意義。乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制主要為癌基因激活和抑癌基因失活導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α(PIK3CA)基因突變通過PIK3/AKT信號通路與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)[2]。本研究通過對乳腺癌組織中的PIK3CA基因外顯子9和20兩個(gè)突變區(qū)檢測，探討 PIK3CA基因突變和乳腺癌分子病理及臨床特征的聯(lián)系，為本地區(qū)乳腺癌患者的個(gè)體化診療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2014～2015年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集的原發(fā)性乳腺癌組織176例?；颊呷脒x標(biāo)準(zhǔn)：(1) 所有病例均經(jīng)病理科確診均為乳腺癌并用免疫組織化學(xué)方法分型；(2)確保所獲得的標(biāo)本能滿足檢測需要；(3)取材均符合倫理要求。年齡36～65 歲，平均(50.2±9.80)歲。另收集乳腺腺病20例標(biāo)本作對照。

1.2主要試劑和儀器人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)和石蠟包埋組織DNA提取試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；微量紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CFX96熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1組織學(xué)評價(jià)常規(guī)對乳腺癌術(shù)后病理組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，測定ER、PR和HER2水平。ER及PR陽性定義：≥1%腫瘤細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)激素受體標(biāo)記陽性。HER2呈(+++)時(shí)為陽性：>10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色；(-)/(+)判為陰性；(++)表示>10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不完整和(或)弱至中等程度的細(xì)胞膜染色，應(yīng)該用免疫組織化學(xué)做進(jìn)一步檢測或選取不同的組織塊重新檢測[3]。ER、PR和HER2均表達(dá)缺失的乳腺癌為三陰性乳腺癌。

1.3.2組織學(xué)分級從以下3個(gè)方面進(jìn)行評估：(1)腺管形成，有多數(shù)明顯腺管為1分，有中度分化腺管為2分，細(xì)胞呈實(shí)性片塊或條索狀生長為3分。(2)細(xì)胞核大小、形狀及染色質(zhì)不規(guī)則，細(xì)胞核大小、形狀及染色質(zhì)一致為1分，細(xì)胞核中度不規(guī)則為2分，細(xì)胞核明顯多形性為3分。(3)染色質(zhì)增多及核分裂象(×400)，1/10HPF為1分，2～3/10HPF為2分，>3/10HPF為3分。各標(biāo)準(zhǔn)的3項(xiàng)指標(biāo)所確定的分?jǐn)?shù)相加，3～5分為Ⅰ級(分化好)，6～7分為Ⅱ級(中等分化)，8～9分為Ⅲ級(分化差)。

1.3.3石蠟切片樣品病理評估抽取用于檢測的連續(xù)切取石蠟切片一張，HE染色。低倍鏡下評估全片腫瘤組織的分布情況，如存在明顯的無腫瘤區(qū)域，蠟筆劃出，在所有待檢測石蠟切片上剔除該部分。高倍鏡下選擇切片上、下、左、右、中5個(gè)視野，每個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)細(xì)胞30個(gè)，合并5個(gè)視野的計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算平均腫瘤細(xì)胞含量作為送檢樣品的腫瘤細(xì)胞含量。

1.3.4DNA提取及ARMS-PCR反應(yīng)采用手工-柱提取法，嚴(yán)格按照艾德石蠟包埋組織DNA提取試劑盒的說明進(jìn)行操作。組織DNA調(diào)整濃度到3.0 ng/μL加樣，嚴(yán)格按照艾德人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒的說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃20 s，15個(gè)循環(huán)；93 ℃25 s，60 ℃35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)。在第三階段60 ℃收集信號。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分析PIK3CA基因突變的狀態(tài)與乳腺癌分子亞型、臨床病理特征關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1PIK3CA基因突變檢測結(jié)果176例乳腺癌組織中，PIK3CA基因突變 45例，突變率 25.6%，其中E542K突變10例(22.2%)，E545D突 變5例(11.1%)，E545K突變9例(20.0%),H1047R突變12例(26.7%)，H1047L突變3例(6.7%)。E542K、E545K、E545D均位于外顯子9，編碼螺旋區(qū)；H1047R、H1047L 位于外顯子20，編碼激酶區(qū)。在對照組20例良性病中均沒發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變。

2.2PIK3CA基因突變在乳腺癌不同腫瘤特征中的分布PIK3CA基因突變在乳腺癌分子亞型中：ER陽性型37例(30.6%)，PR陽性型35例(31.0%)，HER2 過表達(dá)型8例(27.6%)，三陰性乳腺癌3例(8.6%)。PIK3CA 基因突變在ER陽性和陰性、PR陽性和陰性患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在HER2陽性和陰性患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三陰組的PIK3CA基因突變率均低于各陽性組。見表1。

表1　PIK3CA基因在乳腺癌不同腫瘤特征中的突變狀態(tài)

注：-表示無數(shù)據(jù)。

表2　PIK3CA基因在不同臨床病理特征中的突變

2.3PIK3CA基因突變與患者臨床病理特征的關(guān)系PIK3CA基因突變與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小均無相關(guān)性，但與組織學(xué)分級有相關(guān)性，Ⅱ和Ⅲ級的PIK3CA基因突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Ⅰ級(P<0.05)。見表2。

3　討　論

PIK3CA基因編碼Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的p110催化亞單位，PI3K是一種脂質(zhì)激酶，是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異源二聚體。PIK3CA是目前PI3K家族成員中發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)可以發(fā)生體細(xì)胞突變而致癌的基因。PIK3CA基因突變通過PI3K/AKT的途徑引發(fā) AKT持續(xù)活化，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡，與乳腺癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)密切。研究表明，在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)PIK3CA 基因突變發(fā)生率為8%～40%，約4/5發(fā)生在螺旋區(qū)(exon9)和激酶區(qū)(exon20)這兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域[4]。本研究PIK3CA基因突變率為25.6%，以20號外顯子H1047R突變?yōu)橹?，?0例良性對照組中均沒發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變，基本與國內(nèi)外報(bào)道[5-6]相符。

本研究中PIK3CA基因突變在乳腺癌不同分子亞型中突變發(fā)生率不同，在ER陽性和陰性、PR陽性和陰性患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在HER2陽性和陰性患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三陰組的PIK3CA基因突變率均低于受體陽性組。PIK3CA基因突變存在于所有類型的乳腺癌中，更常見于PR陽性及ER陽性的乳腺癌。這與文獻(xiàn)[7]報(bào)道PIK3CA基因突變在激素受體(HR)陽性組(21.5%)比HR陰性組(15.4%)更加頻繁相符，其中HR陽性組包含了PR陽性及ER陽性。目前有關(guān)PIK3CA基因突變和HER2表達(dá)關(guān)聯(lián)的報(bào)道研究結(jié)果不完全一致。有報(bào)道認(rèn)為PIK3CA基因突變與HER2陰性表達(dá)相關(guān)，HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌PIK3CA基因突變率較無HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌低[8]；而另一些報(bào)道則認(rèn)為PIK3CA基因突變和HER2過表達(dá)相關(guān)，HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌PIK3CA基因突變率遠(yuǎn)高于無HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌[9]，而本研究與此報(bào)道相符。與患者臨床病理特征的關(guān)系上，PIK3CA基因突變與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小均無相關(guān)性，但與組織學(xué)分級有相關(guān)性，Ⅱ～Ⅲ級的PIK3CA基因突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Ⅰ級(P<0.05)，提示PIK3CA 基因突變可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起作用。Bozhanov等[10]報(bào)道 PIK3CA 基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分級相關(guān),本研究與此報(bào)道部分不符合，可能與研究病例和地域不同有關(guān)。

PIK3CA基因狀態(tài)還決定靶向藥物赫賽汀、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)、抗EGFR單抗和PI3K抑制劑的療效，HER2陽性乳腺癌患者的靶向藥物主要為赫賽汀和拉帕替尼。據(jù)Majewski等[11]研究在HER2陽性乳腺癌中，PIK3CA野生型患者的病理完全緩解率為53.1%，而PIK3CA基因突變患者的病理完全緩解率為28.6%。Henry 等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變的乳腺癌患者的病理完全緩解可能性較低，無進(jìn)展生存期較短。由于PIK3CA基因突變的HER2陽性乳腺癌患者接受赫賽汀治療的療效顯著降低，總生存期顯著縮短。因此，PIK3CA基因突變的HER2陽性乳腺癌患者將對化療和抗HER2治療產(chǎn)生耐藥，需要對此類人群確定其他的治療方案。

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Study of PIK3CA gene mutation status in different clinicopathological characteristics of breast cancer

DENG Yuemin1,XU Yunjian2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTumorHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

ObjectiveTo detect the mutation status of PIK3CA genes in breast cancer and to analyze its relation with clinicopathological characteristics.MethodsThe paraffin tissue samples in 176 cases of breast cancer were selected and the tissue DNA was extracted,exon9 and exon20 were amplified by ARMS-PCR.The mutation status of PIK3CA genes were detected,other tissue samples in 20 cases of mammary gland disease were taken as the negative control.ResultsAmong 176 samples of breast cancer tissues,45 cases of mutation were found with the mutation rate of 25.6%,which was dominated by H1047R mutation rate of exon20 with the mutation rate of 26.7%(12/45)；There were statistical difference between ER(+) and ER(-) and between PR(+) and PR(-),but no statistical difference was found between HER(+) and HER(-);PIK3CA gene mutation had correlation with cancer histological grade,but no obvious correlation with tumor size,age and lymph node status.ConclusionPIK3CA gene mutation is correlated with breast cancer hormone receptor(HR) expression and tumor progression;the PIK3CA gene mutation detection has an important significance for guiding the formulation of clinical indiidualized treatment.

breast cancer;PIK3CA;mutation

2016-01-24修回日期：2016-05-06)

鄧粵敏，女，主管檢驗(yàn)技師，主要從事臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究?！?/p>

，E-mail：vinkent@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.022

A

1673-4130(2016)15-2110-02

·論著·