分離膠輔助VITEK-MS質譜儀快速鑒定血培養(yǎng)陽性菌的方法學研究

蔣月婷，黎健成，易建云△，陳定強

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣州 510260)

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·論著·

分離膠輔助VITEK-MS質譜儀快速鑒定血培養(yǎng)陽性菌的方法學研究

蔣月婷1，黎健成2，易建云1△，陳定強1

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣州 510260)

目的探討用分離膠采血管聯(lián)合基質輔助激光解析電離飛行時間質譜系統(tǒng)(VITEK-MS)快速鑒定血培養(yǎng)陽性菌的方法。方法收集2015年3～10月廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院BacT/ALERT3D血培養(yǎng)儀報陽性，且直接涂片染色為革蘭陰性菌的血培養(yǎng)標本50例，通過分離膠采血管直接從血培養(yǎng)瓶中提取細菌，采用VITEK-MS 對細菌進行快速鑒定；同時用常規(guī)方法對細菌進行轉種培養(yǎng)及鑒定，比較該方法的鑒定符合率。結果50例血培養(yǎng)陽性的革蘭陰性菌中，21例鑒定不出細菌名，29例鑒定出細菌名，陽性率58.0%，與常規(guī)鑒定方法陽性正確率為96.6%；分離膠聯(lián)合VITEK-MS較常規(guī)法提前近24 h。結論采用分離膠集菌聯(lián)合VITKE-MS鑒定細菌的方法，對血培養(yǎng)陽性革蘭陰性菌的鑒定符合率高，可以大大縮短鑒定的時間，方法快速、簡便。

分離膠采血管；VITEK-MS質譜鑒定系統(tǒng)；血培養(yǎng)

血流感染是臨床上重癥感染性疾病之一，致死率高，快速診斷是控制感染、降低病死率的關鍵。而傳統(tǒng)的微生物鑒定方法主要包括培養(yǎng)和生化試驗等，需要的時間長、鑒定范圍窄，影響了病原微生物鑒定的速度和準確性?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是近些年發(fā)展起來的一種新型的細菌鑒定技術。隨著技術不斷改進和數(shù)據庫完善，MALDI-TOF MS已可在細菌不經過前處理的情況下直接檢測細菌，因而被認為是鑒定細菌最有效的方法[1]。法國生物梅里埃公司的質譜系統(tǒng)VITEK-MS是利用MALDI-TOF質譜技術來分析檢測菌株蛋白組成成分，獲得特征性的峰譜，與數(shù)據庫中細菌圖譜進行比較，能夠吻合即可作出判斷，從而快速鑒定細菌。本研究對全自動血培養(yǎng)儀報陽的直接涂片鏡檢為革蘭陰性菌的標本，采用分離膠采血管直接分離收集細菌，用VITEK-MS質譜儀對待檢菌進行鑒定；同時以常規(guī)方法對血培養(yǎng)陽性標本進行培養(yǎng)及鑒定，比較兩者鑒定結果一致性；以探討該快速檢測方法的可行性。

1　材料和方法

1.1標本來源收集2015年3～10月廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院BacT/ALERT3D全自動培養(yǎng)儀報陽的血培養(yǎng)標本50例，且瓶中培養(yǎng)液直接涂片染色鏡檢為革蘭陰性菌(需氧或厭氧菌)，并于當天完成分離膠提菌及VITEK-MS直接鑒定。同一患者的需氧培養(yǎng)瓶和厭氧培養(yǎng)瓶也算入其中。

1.2儀器和試劑BacT/ALERT3D全自動血培養(yǎng)儀、血培養(yǎng)瓶、哥倫比亞血瓊脂平板、質譜樣品處理基質溶液、VITEK-MS DS靶板、VITEK-MS質譜系統(tǒng)、VITEK 2全血自動細菌鑒定系統(tǒng)、MYLA實驗室全自動工作站購于生物梅里埃中國有限公司；分離膠采血管購自BD公司；5415D高速臺式離心機購于Eppendorf公司；一次性接種環(huán)購于COPAN公司；質譜校準參考菌株ATCC8739大腸埃希菌由本院微生物室保存。所有試劑均在有效期內。

1.3方法

1.3.1收集并確認血培養(yǎng)陽性標本當BacT/ALERT3D全自動血培養(yǎng)儀報警，立即取出陽性需氧或厭氧培養(yǎng)瓶，從瓶中抽取培養(yǎng)液直接涂片染色鏡檢，確定有革蘭陰性桿菌生長的為陽性標本，排除假陽性。血培養(yǎng)瓶為加入碳粒的中和抗菌藥物瓶或是不含碳粒的普通瓶。

1.3.2分離膠采血管初步處理標本將血培養(yǎng)瓶搖勻，用無菌注射器吸取3 mL培養(yǎng)液，并注入到分離膠采血管內，室溫下，3 000 r/min離心2 min，通過離心能將碳粉及大部分紅細胞分離到分離膠下層，而細菌則離心至分離膠上層沉淀及上清液中，將離心后的上清液轉移至EP管。

1.3.3高速離心收集細菌先將EP管離心，5 000 r/min離心5 min，棄去EP管中的上清液；再加入200 μL生理鹽水于EP管中，混勻，8 000 r/min離心5 min，最后棄去上清液，得到沉淀物備用。

1.3.4質譜鑒定用1 μL一次性接種環(huán)輕輕刮取EP管上層細菌少量，點樣在金屬靶板的樣品孔中，后加入1 μL質譜樣品處理基質溶液覆蓋樣品，室溫待干后將靶板放到VITEK-MS質譜儀進行鑒定。當涂抹細菌時做到盡量薄、均勻，每個樣品雙孔檢測，每次取培養(yǎng)15～18 h的ATCC8739校準菌株純菌點樣于靶板質控孔。

1.3.5常規(guī)培養(yǎng)鑒定將BacT/ALERT3D全自動血培養(yǎng)儀報陽的血培養(yǎng)瓶取出，從瓶中抽取培養(yǎng)液直接涂片革蘭染色鏡檢，同時取少量培養(yǎng)液接種于血瓊脂平板，需氧或厭氧環(huán)境中孵育18～24 h 后，挑取平板上的純菌落，調菌液濁度后選用GN卡，放到VITEK 2系統(tǒng)進行鑒定。鑒定結果以常規(guī)培養(yǎng)鑒定方法的結果為準。

1.3.6質譜鑒定結果及比較分析VITEK-MS質譜系統(tǒng)的鑒定結果包括能夠鑒定到種或屬、頻譜錯誤、無鑒定結果、波峰不足等情況。能鑒定到種或屬的結果為陽性，其他情況為結果陰性。將該方法與常規(guī)培養(yǎng)鑒定方法比較，計算陽性正確率，陽性正確率為該實驗方法鑒定結果陽性的標本數(shù)與常規(guī)培養(yǎng)方法的鑒定結果相一致的概率。

2　結　果

2.1分離膠采集管聯(lián)合VITEK-MS質譜檢測結果50例血液培養(yǎng)陽性的革蘭陰性菌標本檢測結果見表1。從表1可見，血流感染革蘭陰性菌標本中需氧菌占98%(49/50)，厭氧菌只占2%(1/50)；需氧菌中大腸埃希菌最為常見，占70%(35/50)，其次是鮑曼不動桿菌。本實驗方法直接檢測大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的鑒定效果較差，檢出率低，出現(xiàn)鑒定不出(42.0%)及鑒定錯誤(2.0%)的結果。

2.2快速法與常規(guī)培養(yǎng)鑒定方法結果比較與常規(guī)培養(yǎng)鑒定方法比較結果見表1。 50株革蘭陰性菌的種類分為8種，除常見菌外還包括不常見的沙門傷寒菌、胎兒彎曲菌胎兒亞種及厭氧菌類腐敗梭菌，分離膠采集管聯(lián)合VITEK-MS質譜檢測對這些不常見菌的鑒定結果與常規(guī)方法結果一致，符合率達100%。而對常見的大腸埃希菌的鑒定，其符合率卻較低。

本實驗方法從培養(yǎng)液注入分離膠采集管開始到VITEK-MS質譜檢測出結果所需時間在2 h內，而用常規(guī)培養(yǎng)鑒定方法鑒定出結果所需時間平均為24～48 h。

表1　分離膠采集管聯(lián)合VITEK-MS質譜檢測結果

3　討　論

菌血癥和敗血癥是嚴重危及患者生命的疾病,傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法耗時長，無法滿足臨床急診所需，如何對血培養(yǎng)陽性標本進行快速、準確的菌種鑒定成為重中之重。國內外不少學者為此不斷進行實驗，以攻克這一難題，使致病菌在短時間內鑒定出來成為了可能。根據不同細菌所特有的蛋白，應用MALDI-TOF MS使細胞表面蛋白質形成不同的模式峰，與人類病原體數(shù)據庫中的蛋白質指紋圖譜進行比較，從而對該微生物的類別進行鑒定，這是一種與傳統(tǒng)鑒定方法完全不同的新型鑒定手段[2]。生物梅里埃公司的VITEK-MS就是基于MALDI-TOF原理運用于微生物鑒定的全自動質譜系統(tǒng)，在2012年通過國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準后，標志了VITEK-MS將真正進入臨床微生物診斷。

與傳統(tǒng)的生化及表型鑒定方法對比，VITEK-MS具有操作簡單、快速、自動化程度高、高通量的特點[3]。VITEK-MS既可以對臨床標本分離出的純菌落進行檢測，也可以對臨床上未經分離培養(yǎng)的標本進行直接檢測[4]。由于血培養(yǎng)標本中碳粒、血細胞等有形成分的存在,影響直接用陽性標本作細菌鑒定的效果及判定。本研究采用含分離膠的采血管處理陽性標本，離心后得到無血細胞的菌液。分離膠分離血液標本主要是因為碳粒和血細胞的比重大，經離心后處于下層，而血清及細菌比重較分離膠小，處于上層[5]，經離心后細菌在上層血清及血清與分離膠的交界處，為細菌的提取提供了條件。對于離心的速度，如果離心力過低，作用于分離膠的力較弱，使分離膠返轉性不佳，可出現(xiàn)纖維蛋白凝狀物停留在血清中或膠體層中。相反，如果離心時間過長，在分離膠凝聚體中由于氫鍵被切斷后再難以形成網狀結構，而失去觸變性[6]。

本研究分離膠采集管聯(lián)合VITEK-MS質譜快速檢測方法有以下優(yōu)點：(1)速度快。血液經無菌注射器抽離后注入到分離膠采血管中，低速離心后再經兩次高速離心便可收集病原體，然后直接對沉淀物中的病原菌進行鑒定，病原菌的鑒定結果在2 h內便可得到，所需時間遠遠小于傳統(tǒng)分離純化菌落再鑒定的方法(24～48 h)。(2)成本低。所需試劑在各大醫(yī)院普遍使用，標本處理中所需儀器僅為離心機，試劑成本比VITEK 2鑒定卡成本低。(3)步驟簡單。只需經抽提、3次離心便可進行快速鑒定，比其他預處理提取細菌蛋白方法簡單快速。但此方法也有不足：(1)菌量少。血培養(yǎng)陽性標本中病原菌數(shù)量相對較少，無法獲得足量的單一細菌用于VITEK-MS質譜的鑒定，導致VITEK-MS質譜無法鑒定或正確檢出率過低，因此需盡可能地收集上層血清及沉淀，為鑒定提供更多的細菌。(2)標本雜質多。部分血培養(yǎng)中的血液標本溶血，血液標本經分離膠分離后有破碎紅細胞、蛋白質、碳粉等雜質，會干擾VITEK-MS質譜鑒定細菌，對VITEK-MS質譜直接鑒定細菌造成一定的難度，故需對EP管中的沉淀進行1～2次洗滌，盡可能地把破碎紅細胞、蛋白質、碳粉等雜質去除，但洗滌次數(shù)不宜過多，這樣會造成沉淀物中的細菌丟失，從而影響標本中的菌量。

本實驗研究結果提示臨床標本應在報陽后的12 h內即當天完成檢測，確保細菌有足夠的活力和濃度。本次實驗在50例革蘭陰性菌中，大腸埃希菌檢出率低，有鑒定不出(42.0%)及鑒定錯誤(2.0%)的結果，這可能與血培養(yǎng)瓶中菌量較少或報陽后超過一定時間才處理有關。而肺炎克雷伯菌的鑒定效果差，可能與莢膜有關。陳峰等[7]的研究表明VITEK-MS可以直接鑒定血培養(yǎng)陽性的標本，但亦存在革蘭陽性細菌的鑒定率比革蘭陰性細菌低；莢膜細菌如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的鑒定率比其他無莢膜細菌低；細菌量不足或混合感染時鑒定率低；培養(yǎng)物其他成分嚴重影響結果分析等問題。由于本研究只收集了革蘭陰性菌進行檢測，而且樣本量較少，結果容易出現(xiàn)偏差。有待進一步加大樣本量檢測，獲得更多的數(shù)據結果。

現(xiàn)階段利用分離膠聯(lián)合VITEK-MS直接對報陽的血培養(yǎng)標本進行鑒定還存在的問題，比如革蘭陽性菌、真菌的檢測陽性率和符合率如何，比如檢出率不高，對混合菌鑒定能力不足等。但本實驗方法操作簡單、快速，把傳統(tǒng)分純培養(yǎng)鑒定時間由24～48 h大大縮短到2 h內，為患者進行早期、有效的治療提供的捷徑，減少患者病死率，且成本低[8]，實用性強，適合在臨床微生物實驗室中推廣應用。

[1]Du Z,Yang R,Guo Z,et al.Identification of staphylococcus aureus and determination of its methicillin resistance by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Anal Chem,2002,74(21):5487-5491.

[2]鄧間開，江凌曉，車小燕．基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在微生物檢測中的應用進展[J]．廣東醫(yī)學，2014，35(6)：957-960．

[3]Fothergil A,Kasinathan V,Hyman J,et al.Rapid identification of bacteria and yeasts from positive blood culture bottles by using a Lysis-Filtration method and MALDI-TOF mass spectrum analysis with SARAMIS database[J].J Clin Microbiol,2013,51(3):805-809.

[4]陳歡歡，文怡，劉根焰，等．血培養(yǎng)陽性標本直接細菌鑒定和藥敏中應用分離膠試管的方法探討[J]．實用臨床醫(yī)藥雜志，2011，15(15)：156-157．

[5]趙立飛，徐建華，解傳芬，等．臨床應用分離膠采血管需注意的問題[J]．臨床檢驗雜志，2012，30(7)：543-545．

[6]Chen JH,Ho PL,Kwan GS,et al.Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems[J].J Clin Microbiol,2013,51(6):1733-1739.

[7]陳峰，李媛睿，黃甫昱嬋，等.分離膠促凝管聯(lián)合MALDI TOF-MS直接檢測血培養(yǎng)陽性細菌[J]．檢驗醫(yī)學，2015，30(2)：113-121．

Methodological study of VITEK-MS assisted by separation gel tube for fast identification of positive blood culture bacteria*

JIANG Yueting1,LI Jiancheng2,YI Jianyu1△,CHEN Dingqiang1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China;2.KingMedSchoolofLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510260,China)

ObjectiveTo investigate the method of the separation gel vacuum tube combined with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry system(VITEK-MS) for fasting identifying positive blood culture bacteria.MethodsFifty cases of positive blood culture by the BacT/ALERT3D blood culture system and Gram-negative bacteria by direct staining in the First Affiliated Hospital of Guangzhou University from March to October 2015 were collected.The bacteria were directly extracted from the blood culture bottle by the separation gel tube and performed the fast identification by adopting the VITEK-MS system.At the same time the bacteria were performed the subcultivation and identification.then the coincidence of this method was compared.ResultsAmong 50 cases of Gram-negative bacteria by positive blood culture,21 cases of bacteria were not identified,29 cases of bacteria were identified,the positive rate was 58.0%.the coincidence rate with the conventional identification results was 96.6%;the method of separation gel combined with VITEK-MS was nearly 24 h in advance compared with the traditional method.ConclusionAdopting the separation gel vacuum tube combined with VITEK-MS for identifying bacteria has the higher coincidence rate of positive blood culture Gram negative bacteria,can greatly shorten the identification time,this method is rapid and simple.

separation gel tube;VITEK-MS;blood culture

2016-05-27修回日期：2016-06-17)

廣東省科技計劃項目(2013B021800272)。

蔣月婷，女，副主任技師，主要從事臨床常見細菌耐藥機制研究?！?/p>

，E-mail：liangrgyjy@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.008

A

1673-4130(2016)15-2071-03