基于SPR技術(shù)高通量呼吸道病毒檢測方法研究*

孫秋香，王小華，顧大勇

(1.廣東省東莞市鳳崗鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心　523000；2.重慶市公安局渝中區(qū)分局物證鑒定所，重慶 400013；3.廣東省深圳市檢驗檢疫科學研究院　518045)

?

·論著·

基于SPR技術(shù)高通量呼吸道病毒檢測方法研究*

孫秋香1，王小華2，顧大勇3△

(1.廣東省東莞市鳳崗鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心523000；2.重慶市公安局渝中區(qū)分局物證鑒定所，重慶 400013；3.廣東省深圳市檢驗檢疫科學研究院518045)

目的結(jié)合表面等離子共振(SPR)和基因芯片技術(shù)優(yōu)勢，針對9種常見呼吸道病毒[包括A型、B型流感病毒(Influ A,B)，甲型H1N1，呼吸道融合病毒(RSV)，副流感病毒1～3型(PIV1、2、3)，腺病毒(ADV)以及引發(fā)嚴重急性呼吸綜合征的冠狀病毒(SARS)]，構(gòu)建特異性強、通量高的生物傳感器方法。方法首先利用軟件premier 5等在保守序列上設(shè)計相關(guān)病毒的特異性引物及探針；將所設(shè)計的9種相應(yīng)呼吸道病毒的探針固定于化學修飾后的SPR芯片的特定區(qū)域，利用SPR技術(shù)實時監(jiān)測探針與PCR產(chǎn)物的雜交過程，最后通過生物素與鏈霉親和素系統(tǒng)實現(xiàn)信號的放大。結(jié)果設(shè)計的基因芯片可以高通量地檢測9種呼吸道病毒，具有很好的檢測特異性；芯片表面通過一定的再生條件后可以重復利用，避免芯片批間差對結(jié)果的影響；檢測靈敏度都達到納摩爾級。結(jié)論初步研究結(jié)果表明，利用SPR傳感技術(shù)建立高通量檢測呼吸道病毒的檢測方法具有一定的實用性和可行性，有望成為快速、大規(guī)模、高通量篩查呼吸道病毒感染的手段，具有較好的應(yīng)用前景。

表面等離子共振；呼吸道病毒；高通量；免標記；基因芯片

呼吸道病毒是導致上、下呼吸道疾病的主要原因[1]。常見的呼吸道病毒主要包括流感病毒A型、B型(Influ A、B)，甲型H1N1、呼吸道融合病毒(RSV)、副流感病毒1～3型(PIV1～3)、腺病毒(ADV)以及引發(fā)嚴重急性呼吸綜合征的冠狀病毒(SARS)[2]。呼吸道病毒感染往往呈現(xiàn)一般的呼吸道癥狀，臨床醫(yī)生難以作出判斷[3]。因此迫切需要一種快速檢測呼吸道病毒的方法，以便幫助醫(yī)生快速確定病毒，并選擇合理的治療方案[4]。目前，呼吸道病毒的常規(guī)培養(yǎng)法耗時長，需培養(yǎng)2～10 d，然后通過形態(tài)特征進行鑒定，需要在專用的實驗室開展。血清學方法包括核酸序列依賴性擴增(NASBAs)[5]、限制性內(nèi)切酶分析(REA)[6]和直接免疫熒光法[7]或針對病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗[8]，相對而言具有操作簡單、快速、便捷的特點，適用于基層實驗室，但存在檢測靈敏度低的局限性。隨著分子生物診斷技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測RNA病毒培養(yǎng)物也很常見，即從樣品中提取病毒的核酸轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后放大并利用熒光或發(fā)光免疫檢測[9-10]。雖然這種方法比較簡單，但它不能提供基因序列信息并且從非特異性序列的擴增會產(chǎn)生較高的假陽性結(jié)果。因此，需要建立一種更高特異性、相互作用的雜交分析方法。表面等離子共振(SPR)技術(shù)是一種簡便、快速和無標記的生物分子檢測方法[11-12]。本文充分利用SPR快速、便捷和基因芯片高通量的技術(shù)優(yōu)勢，嘗試應(yīng)用于呼吸道病毒的檢測。首先，利用氨基化學將9種呼吸道病毒的探針固定在化學修飾的SPR芯片表面的特定區(qū)域，制備成呼吸道病毒診斷基因芯片，然后利用SPR技術(shù)平臺直接檢測PCR產(chǎn)物。本文建立同時檢測9種呼吸道病毒的技術(shù)方法，為及時應(yīng)對呼吸道感染疫情提供重要信息。

1　資料與方法

1.1儀器與試劑SPR檢測儀器為PlexArrayTMHT生物分子相互作用分析系統(tǒng)(美國Plexera公司)；C1000 Thermal cycler PCR(美國伯樂公司)；Bio-RAD凝膠成像儀(美國伯樂公司)；ND-1000微量紫外可見分光光度計(美國Nanodrop公司)。12-巰基十二酸(12-Mercaptododecanoic)(Sigma-Aldrich，美國)；鹽酸乙醇胺(TCI，日本)；1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(Bio Basic Inc，加拿大)；N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(上海共價化學科技有限公司)；鏈霉親和素(北京生物合成技術(shù)有限公司)。所有其他試劑均為分析純。所有生物試劑4 ℃儲存。所有溶劑均用超純水制備(>18.2 MΩ·cm-1)。用0.2 g KCl、8.0 g NaCl、0.24 g KH2PO4和1.44 g Na2HPO4溶解于1 000 mL 水中制備0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.4)。氨基標記的寡核苷酸探針和生物素標記的引物均由英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1SPR-生物芯片構(gòu)建和表面修飾首先在玻璃基片(ITO光學玻璃)上蒸鍍一層2.5 nm厚的鉻膜，再在其上蒸鍍47 nm的金膜，構(gòu)成SPR裸金膜芯片。裸金芯片表面由等離子清洗儀清洗1 min后，浸泡在1 mmol/L的12-巰基十二酸(MDA)溶液中進行分子自組裝，然后用無水乙醇徹底清洗，氮氣吹干。

1.2.2基因芯片設(shè)計用0.4 mol/L的EDC和0.1 mol/L NHS混合溶液處理金膜表面10 min，以活化羧基為酯鍵。將9種呼吸道病毒的探針用PBS緩沖液(10 mmol/L，pH7.4)配置10 μmol/L，實驗采用mini Q-array 點樣儀將探針固定于芯片的特定位置，室溫下孵育2 h，探針上的氨基與活化的酯鍵反應(yīng)而固定于芯片表面。然后將芯片直接浸入1 mmol/L的乙醇胺(pH 8.5)中10 min，以封閉剩余的活性酯鍵。

1.2.3PCR擴增呼吸道病毒RNA從200 μL的咽拭子樣品中提取，采用的是北京天恩澤基因科技有限公司的柱式病毒RNA提取試劑盒(產(chǎn)品編號71001-50)，按照產(chǎn)品說明書操作。提取的RNA用一步法PCR進行擴增。具體操作步驟如下：0.3 μL的RNA模板，3 μL 的10×PCR緩沖液(TAKARA)，9.6 μL的引物混合物，0.5 μL的Taq DNA 聚合酶，0.25 μL的AMV RT，0.6 μL的dNTP混合物，然后加無菌水至30 μL。同時設(shè)置一個空白質(zhì)控管。樣品按照以下循環(huán)條件進行擴增：42 ℃，40 min；95 ℃，2 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5個循環(huán)；95 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃，2 min；4 ℃，10 min。DNA的濃度采用ND-1000微量紫外可見光分光光度計檢測。PCR擴增產(chǎn)物在進樣前95 ℃ 5 min熱變性，再置入冰中1 min，使雙鏈變?yōu)閱捂溡员愫凸潭ㄔ谛酒系奶结橂s交。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳驗證檢測。

1.2.4SPR檢測所有PCR產(chǎn)物用PBS(10 mmol/L，pH7.4)緩沖液稀釋至所需要的濃度。由于PCR擴增產(chǎn)物為雙鏈，在進樣前需95 ℃ 5 min的熱變性和冰浴1 min的冷卻過程，使雙鏈變?yōu)閱捂溡员愫凸潭ㄔ谛酒系奶结橂s交。SPR檢測實驗均采用PlexArrayTMHT 系統(tǒng)(美國Plexera公司)。將基因芯片固定在SPR監(jiān)測儀上。PBS緩沖液(10 mmol/L，pH7.4)用于雜交反應(yīng)運行時的緩沖液，流速50 μL/s。待儀器基線穩(wěn)定后，注入500 μmol/L的PCR產(chǎn)物溶液，設(shè)定流速為 5 μL/s，時間為270 s。觀察反應(yīng)5 min，然后用雜交緩沖液自動沖洗傳感器芯片以除去未結(jié)合的DNA物質(zhì)。雜交后，再泵入60 μg/mL的鏈霉親和素溶液以增強反應(yīng)信號。反應(yīng)前后的基線差值為檢測信號值。雜交反應(yīng)結(jié)束后，注入100 mmol/L NaOH溶液移除結(jié)合到芯片表面的DNA分子，使得芯片的探針陣列恢復單鏈狀態(tài)，實現(xiàn)芯片重復使用。檢測原理見圖1。

圖1　DNA芯片的修飾及探針固定、堿基互補配對結(jié)合、鏈霉親和素放大信號、NaOH再生芯片過程的原理

2　結(jié)　果

2.1PCR產(chǎn)物的凝膠電泳在本次試驗中，檢測的目標RNA采用RT-PCR擴增。結(jié)果如圖2所示，瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果驗證了提取的9種呼吸道病毒RNA可以現(xiàn)實特定靶片段擴增。

注：M為DL2000；1～9分別為ADV(297 bp)，SARS(68 bp)，Influ A(104 bp)，PIV2(116 bp)，PIV1(129 bp)，Influ B(145 bp)，RSV(155 bp)，PIV3(154 bp)，H1N1(202bp)。

圖2單一模板擴增電泳圖

本研究運用多重PCR擴增靶RNA。多重PCR對4個病毒的靶向基因(ADV，RSV，PIV2，SARS)同時擴增，擴增結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳(圖3)進行了驗證。

注：M道為DL2000，1道從上至下依次為ADV(297 bp)，RSV(155 bp)，PIV(116 bp)，SARS(68 bp)。

圖3多重模板擴增電泳圖

2.2檢測特異性芯片的檢測特異性非常重要，它要求在點置探針陣列時各探針點之間無交叉污染，在檢測不同靶目標時無交叉反應(yīng)。為了驗證芯片檢測不同呼吸道病原的可行性，本研究首先單重擴增產(chǎn)物分別與芯片雜交，然后通過10 mmol/L NaOH溶液再生芯片，可依次通入9種呼吸道病毒PCR產(chǎn)物。實驗結(jié)果見圖4(以流感A為例)。其中PCR空白包含PCR混合物的所有試劑，除模板DNA，進行測試，以檢查任何非特異性反應(yīng)效應(yīng)。結(jié)果表明，從注入緩沖液到獲取無模板DNA的PCR產(chǎn)物，信號的變化接近于儀器噪聲信號的變化。

注：A為SPR檢測實驗結(jié)果；B為根據(jù)SPR檢測信號，結(jié)合SA的前后基線差值重建的柱狀圖。

圖4檢測流感病毒PCR產(chǎn)物的結(jié)果圖

本研究應(yīng)用基因芯片結(jié)合SPR技術(shù)分析混合PCR產(chǎn)物。在一份PCR產(chǎn)物中同時針對多種呼吸道病毒檢測，從而提高臨床診斷的敏感性。采用四重PCR對4種呼吸道病毒(ADV、PIV2、RSV、SARS)進行目標片段擴增，然后通過SPR技術(shù)直接分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明可以特異性檢測其中4種呼吸道病毒，該檢測平臺可以在十余分鐘內(nèi)對4種呼吸道病毒的特異性檢測，這為疾病的病原體快速診斷提供了思路。

2.3檢測重復性本文采用A型流感病毒的PCR產(chǎn)物作為模型，系統(tǒng)驗證芯片的重復性。圖5顯示的是在同一張芯片上用A型流感病毒的PCR產(chǎn)物進行4個循環(huán)的雜交檢測和再生芯片的反應(yīng)曲線圖。芯片再生后響應(yīng)曲線回到原始基線值，表明靶DNA可以被NaOH完全移除。再生后的結(jié)合曲線與典型的SPR反應(yīng)曲線幾乎重合。平均信號值為128 RU，信號值的相對標準偏差值僅為0.3%。表明反應(yīng)存在良好的重復性。

圖5　用Influ A產(chǎn)物為模型分析SPR檢測的重復性

2.4檢測靈敏度采用PBS緩沖溶液稀釋目標產(chǎn)物，通過SPR檢測這一系列濃度梯度的目標物的情況。當分析物濃度從1～1 000 nmol/L濃度梯度變化，SPR檢測信號值與濃度的對數(shù)值呈線性相關(guān)，見圖6。從而得出9種病毒病毒PCR產(chǎn)物的檢測靈敏度，數(shù)值如表1。

圖6　SPR檢測Influ A產(chǎn)物的系列濃度

名稱InfluAInfluBPIV1PIV2PIV3RSVADVSARAH1N1濃度(nmol/L)5112.53.530.523

3　討　論

本試驗中，利用基于SPR的生物傳感器，結(jié)合基因芯片技術(shù)，可以高通量地檢測9種不同的呼吸道病毒PCR產(chǎn)物。從以上實時檢測曲線可以看出，當通入其中一種呼吸道病毒的PCR產(chǎn)物時，靶向DNA與相應(yīng)探針雜交結(jié)合，表現(xiàn)出檢測曲線的上升。另一方面，其他呼吸道病毒的探針點曲線并無顯著的信號變化，這表明研制的SPR可以實現(xiàn)在一張芯片上高特異性檢測9種呼吸道病毒。在許多試驗中，為減少芯片間的差異和節(jié)約檢測成本，傳感器的芯片需重復利用。芯片要實現(xiàn)重復利用，必須滿足兩個基本條件：(1)使用再生試劑能將雜交反應(yīng)的靶DNA必須移除，而探針需要完整的保留；(2)再生后的探針保持原有的生物活性[13]。本文采用InfluA的PCR產(chǎn)物作為模型，系統(tǒng)驗證芯片具有較好的重復性。多重PCR技術(shù)的發(fā)展為疾病的診斷節(jié)省了檢測成本，縮短了檢測時間，增加了臨床診斷的敏感性。多重PCR具有通過使用多個引物的反應(yīng)混合物來擴增多個靶系列而不影響試驗效果的潛力。到目前為止，本研究驗證了4種從呼吸道病毒中提取的RNA混合物已經(jīng)成功進行四重PCR擴增，擴增效果通過瓊脂糖凝膠電泳驗證。最后采用SPR技術(shù)平臺在半小時內(nèi)完成了多重PCR產(chǎn)物的檢測。該技術(shù)方法的主要特點包括：(1)針對現(xiàn)有呼吸道病毒檢測方法存在通量低等不足之處，著眼實際運用，構(gòu)建高通量的檢測方法，采用實時、在線監(jiān)測的SPR技術(shù)平臺實現(xiàn)了樣品的快速檢測；(2)SPR技術(shù)和基因芯片強強聯(lián)合，保持了基因芯片的高通量技術(shù)特點的同時，無需

引入熒光探針等報告分子，簡化檢測流程；(3)采用了生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)提高檢測靈敏度。總之，SPR生物傳感器結(jié)合PCR擴增展現(xiàn)了一個新的分子檢測工具，可以高通量特異性檢測呼吸道病毒，提高疾病的臨床診斷敏感性，從而有效控制呼吸道病毒的感染和治療的效果。

[1]吳茜，倪林仙，李楊芳，等．急性下呼吸道感染患兒病毒病原學分析[J]．中國實用兒科雜志，2007，22(12)：938-939．

[2]張雪清，胡駿，寧小曉，等．2425例小兒呼吸道感染7種常見病毒檢出情況分析[J]．檢驗醫(yī)學，2013，28(7)：602-605．

[3]張蓉芳．急性呼吸道感染患兒呼吸道病毒分子流行病學和臨床特征的研究[D]．蘭州：蘭州大學，2011．

[4]Caygill RL,Blair GE,Millner PA.A review on viral biosensors to detect human pathogens[J].Anal Chim Acta,2010,681(1/2):8-15.

[5]Kievits T,Van Gemen B,Van Strijp D,et al.NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection[J].J Virol Methods,1991,35(3):273-286.

[6]Gouvea V,Hoke CH,Innis BL.Genotyping of hepatitis E virus in clinical specimens by restriction endonuclease analysis[J].J Virol Methods,1998,70(1):71-78.

[7]廖冰潔，周迎春，李翠，等．呼吸道病原體IgM抗體聯(lián)合檢測在呼吸道感染診斷中的應(yīng)用[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2014,35(10)：1339-1340．

[8]Boon AC,French AM,Fleming DM,et al.Detection of influenza a subtypes in community-based surveillance[J].J Med Virol,2001,65(1):163-170.

[9]姚亞萍，徐冉行，呂棠山．呼吸道病原體多重實時熒光定量PCR的檢測[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，2010，20(4)：592-594．

[10]方健，王靜宇，宋海燕，等．15種呼吸道病原體的實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]．解放軍醫(yī)學雜志，2010，35(10)：1254-1257．

[11]孫秋香，史蕾，顧大勇．SPR傳感技術(shù)在呼吸道病毒檢測中的應(yīng)用[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22(2)：406-408．

[12]Liu X,Song D,Zhang Q,et al.An optical surface plasmon resonance biosensor for determination of tetanus toxin[J].Talanta,2004,62(4):773-779.

[13]Elnifro EM,Ashshi AM,Cooper RJ,et al.Multiplex PCR:optimization and application in diagnostic virology[J].Clin Microbiol Rev,2000,13(4):559-570.

Study on high-throughput respiratory tract virus detection method based SPR*

SUN Qiuxiang1，WANG Xiaohua2，GU Dayong3△

(1.FenggangTownCommunityHealthServiceCenter,Dongguang,Guangdong523000,China;2.InstituteofEvidenceIdentificationofYuzhongDistrictPublicSecurityBranchBureau,Chongqing400013,China;3.ShenzhenAcademyofInspectionandQuarantine,Shenzhen,Guangdong518045,China)

ObjectiveTo develop a biosensor method with strong specificity and high-throughput by combining with the surface plasmon resonance (SPR) and gene chip technique and aiming at 9 kinds of common respiratory tract viruses including influenza A and influenza B,(Influ A,B),H1N1,respiratory syncytial virus (RSV),parainfluenza virus 1-3 (PIV1-3),adenovirus (ADV) and coronavirus (SARS) leading to severe acute respiratory syndrome.MethodsFirstly the software primer 5 was used to design the specific primer and probe of related viruses in the conserved sequence;the designed nine kinds of corresponding respiratory virus probes were immobilized in the specific region of SPR chip after chemical modification.The SPR technique was applied to conduct the real time monitoring the hybridization process of the probe with the PCR products.Finally the signal amplification was realized by the biotin and streptavidin system.ResultsThe designed gene chip could detect 9 kinds of respiratory tract viruses by high-throughput with better detection specificity;the chip surface could be reutilized after certain regeneration condition,which avoided the influence of intra-batch difference on the results;the detection sensitivity reached the nanomole level.ConclusionThe preliminary study results demonstrate that using the SPR biosensor technique to establish a high--throughput detection of respiratory tract viruses has some practicability and feasibility,and is expected to become a rapid,large scale and high- throughput measure for screening respiratory tract viruses with good application prospect.

surface plasmon resonance;respiratory virus;high-throughput;label-free;gene chip

2016-01-20修回日期：2016-05-05)

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2013IK237)；廣東省深圳市科技研發(fā)資金(基礎(chǔ)研究)項目(JCYJ20120618172144495)。

孫秋香，女，主管檢驗技師，主要從事衛(wèi)生檢驗與檢疫方面的工作?！?/p>

,E-mail:wanhood@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.007

A

1673-4130(2016)15-2068-03