腎移植術(shù)后巨細胞病毒感染的早期診斷

王 壘 綜述 彭貴主 審校

·腎臟移植·

腎移植術(shù)后巨細胞病毒感染的早期診斷

王 壘 綜述 彭貴主 審校

巨細胞病毒(CMV)感染是腎移植術(shù)后常見的并發(fā)癥，也是影響移植腎/人預后的重要因素。CMV感染潛伏期長、發(fā)生率高，因此早期診斷與治療意義重大。近年來，CMV診斷學取得了顯著的進展，包括DNA檢測手段的改進、流式細胞術(shù)的應用及多種檢測技術(shù)(如基因診斷與免疫檢測)的聯(lián)合應用。本文就此作一綜述。

腎移植 巨細胞病毒感染 早期診斷

巨細胞病毒(CMV)，也稱人皰疹病毒5型(HHV-5)，是一種表面有脂質(zhì)包膜，長度約為230 kb的線狀雙鏈DNA病毒，屬β皰疹病毒亞科，具有種屬特異性。腎移植術(shù)后CMV活動性感染發(fā)生率為20%～70%，其中15%～35%為有癥狀的CMV病，致死率高達11%，且多發(fā)生在腎移植術(shù)后1～4個月[1-3]。

CMV感染既包括無臨床癥狀的抗原血癥，也包括CMV病[4]。CMV感染不僅直接引起感染癥候群和組織侵襲病，如肺炎、腸炎、腎炎、肝炎；還可間接引起移植物損傷，如急慢性移植物排斥、心臟并發(fā)癥、腫瘤、移植后糖尿病、淋巴增殖紊亂性疾病等。 CMV常與其他病原體發(fā)生二重或多重感染，病情兇險、死亡率高、嚴重影響腎移植術(shù)后受者生存率。另外，研究報道CMV感染還是增加移植腎急性排斥反應的獨立危險因素，這可能與預防性抗病毒治療的時間有關(guān)[5]。因此，快速、及時、準確地診斷腎移植術(shù)后CMV感染，對臨床抗病毒治療意義重大。

腎臟穿刺活檢及病毒培養(yǎng)

雖然腎臟穿刺、組織活檢找到病原體成功率極低，且具有損傷性，但仍是CMV感染確診的金標準之一。

從病變組織中分離出的CMV增殖緩慢，檢測周期長(4～6周)，并且陽性率低(長時間培養(yǎng)易受細菌和真菌污染)，但也是診斷CMV感染的金標準，尤其適用于血標本抗原或DNA滴度較低隱性胃腸道侵襲性CMV感染患者。

Shell vial培養(yǎng)技術(shù)

直接將標本接種于成纖維細胞單層，24～48h后應用單克隆抗體檢測CMV復制時產(chǎn)生的即刻早期抗原。此法適用于組織標本、尿液或呼吸道肺泡灌洗液，但其靈敏度相對降低(<50%)。

影像學檢查

腎移植術(shù)后受者CMV肺部感染的CT表現(xiàn)有一定的特異性，早期或輕型CMV肺炎表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，晚期可見磨玻璃樣改變或?qū)嵶?。并且，CT能提供腎移植術(shù)后CMV感染與其他感染性疾病的鑒別診斷如侵襲性肺曲霉菌病(IPA)、卡氏肺囊蟲肺炎(PCP)及肺結(jié)核等。但是，腎移植術(shù)后CMV感染的影像學表現(xiàn)常在短時間內(nèi)迅速發(fā)生變化，且常與臨床表現(xiàn)不同步，在一定程度上限制了其臨床應用。

抗體檢測

目前腎移植供、受者常規(guī)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測CMV IgG和CMV IgM，但都不是腎移植術(shù)后CMV早期診斷的最佳指標。一方面，雖然CMV IgM反映的是原發(fā)感染或活動性感染，但是由于免疫抑制劑的使用，腎移植受者CMV IgM抗體檢測通常陽性率極低(2/56)[6]。另一方面，CMV IgG反映的是既往感染，并且缺乏特異性。研究報道CMV IgG陽性率在西方發(fā)達國家高達40～60%，在發(fā)展中國家接近100%[7-8]。所以，通常認為在腎移植術(shù)后CMV感染中CMV IgG滴度升高4倍才有意義。

一般來說，CMV IgG(+)受者接受CMV IgG(+)供者的腎臟通常不會出現(xiàn)CMV感染，但是如果沒有接受抗病毒預防治療仍有20%～30%的患者出現(xiàn)CMV 感染；另一方面，CMV IgG(-)的受者如果沒有接受抗病毒預防治療通常都會出現(xiàn)CMV 感染。但是研究發(fā)現(xiàn)30%～40%的患者即使不接受抗病毒預防治療依然不會出現(xiàn)CMV 感染。因此，單純的抗體檢測預后意義有限。

基因檢測

CMV-DNA PCR 搶先治療是目前腎移植術(shù)后CMV感染最為有效的預防策略，其關(guān)鍵是早期及時準確地評估患者體內(nèi)病毒DNA載量。定性PCR可檢出低水平感染的CMV-DNA，敏感度好，但假陽性高。實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測速度快，具有較高的敏感度及特異度，是診斷CMV感染的可靠方法，特別適用于CMV-PP65抗原檢測陰性的侵襲性CMV肺炎肺泡灌洗液的檢查[9]。并且對檢測樣本沒有要求，不受中性粒細胞數(shù)量的影響，耗時少，可多個樣本一起檢測。

目前，通過RT-PCR檢測CMV DNA的方法很多，包括分析物特異性研究(ASR)、實驗室開發(fā)的測試(LDT)、EraGen Multicode、 Focus Simplexa、 Elitech MGB Alert CMV及Abbott CMV等。2011年，WHO把LDT作為CMV PCR檢測的標準方法。Binnicker和Espy[10]通過對這6種檢測方法的比較分析發(fā)現(xiàn)，Abbott、Elitech、EraGen和Focus的敏感度均為100%，而ASR的敏感度為89%，LDT的敏感度為98%。Elitech的特異度為97%、LDT為100%。研究發(fā)現(xiàn)，與LDT相比，Cobas能檢測更低濃度的CMV DNA[11]，更適合腎移植術(shù)后CMV DNA低負荷的檢測與監(jiān)視[12]。

另外，Babady等[11]研究發(fā)現(xiàn)Cobas CMV DNA全血的敏感度和特異度分別為85.2%和98.1%，而Cobas CMV DNA血漿敏感度和特異度分別為100%和90.5%。并且，腎移植術(shù)后全血CMV DNA含量一般高于血漿。

CMV早期基因 CMV自我復制周期可分為即刻早期(IE)、早期(E)和晚期(L)。相應地，其基因組也分為IE、E和L。其中，即刻早期基因IE2表達產(chǎn)生的調(diào)控蛋白IE86是病毒復制所必需的。劉鵬等[13]研究發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后IE2陽性率52.5%(21/40)，其中10例(25%)發(fā)展為癥狀性感染。并且，IE2出現(xiàn)陽性的時間早于其他方法，極大縮短了監(jiān)測的窗口期(7D)，可有效區(qū)分潛伏感染和活動性感染。

磷酸化蛋白抗原檢測

PP65抗原 CMV-PP65是一種重要的CMV被膜蛋白，其生理功能主要是調(diào)節(jié)病毒基因表達，改變宿主細胞的生理代謝過程，在不同病毒株中PP65具有高度的保守性。對CMV感染患者進行CMV PP65抗原檢測，可在出現(xiàn)臨床癥狀體征的前幾天至1周內(nèi)顯示出陽性結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)只要外周血白細胞中有一個或幾個熒光顯像表現(xiàn)，即可判斷為CMV-PP65抗原檢測陽性，輔助臨床觀察確診為CMV病[14]。腎移植術(shù)后CMV-PP65抗原檢測陽性率為48.1%，其中15例(60%)發(fā)生CMV感染；并且，CMV-PP65抗原檢測首次出現(xiàn)陽性的平均時間明顯短于CMV-IgM抗體檢測術(shù)后首次出現(xiàn)陽性的平均時間(4.2±3.3周vs8.7±5.8周，P<0.05)[15]。目前，CMV-PP65檢測是腎移植術(shù)后CMV活動性感染的標準之一，同時CMV-PP65抗原血癥也是臨床啟動抗CMV的標志。但是，PP65抗原血癥檢測要求血液新鮮，4～6h內(nèi)分析，且結(jié)果易受主觀性干擾。

PP67 抗原 CMV-PP67是L-mRNA 編碼的CMV基質(zhì)表層蛋白，PP67的L-mRNA可真正反映活動性的CMV感染[16]。研究發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后CMV感染組PP67的陽性率高達66.1%，并且PP67出現(xiàn)陽性的時間早于未感染組[17]。

免疫功能監(jiān)測

腎移植術(shù)后受者免疫狀態(tài)的監(jiān)測與評估非常重要：一方面，腎移植后受者的免疫狀態(tài)與移植效果密切相關(guān)；另一方面，CMV活動性感染后，病毒通過多種機制影響免疫系統(tǒng)，機體免疫應答狀態(tài)發(fā)生改變直接反映在免疫因子水平和免疫細胞亞群變化上。

甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL) 天然免疫分子MBL血清水平低下是機體易患感染性疾病的重要危險因素。MBL能選擇性與病原菌表面的糖蛋白結(jié)合，通過凝集素途徑激活補體系統(tǒng)，可溶解、清除病原菌和免疫復合物；還可與吞噬細胞表面受體結(jié)合，直接介導吞噬功能或借補體片段間接調(diào)理吞噬作用。白紀民等[18]研究報道腎移植術(shù)前血MBL<500 ng/ml的受者術(shù)后易發(fā)生CMV感染，并且Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)術(shù)前MBL< 500ng/ml 是CMV感染的獨立危險因素。

T淋巴細胞亞群 CMV、T、B細胞等單核細胞中復制，因此淋巴細胞的檢測對診斷CMV感染十分重要。CMV在體外主要刺激CD8+T細胞增殖，使得CD4+T/CD8+T比值倒置。研究發(fā)現(xiàn)，在腎移植術(shù)前CMV感染組外周血CD3+CD4+T細胞計數(shù)明顯低于未感染組；在術(shù)后CMV感染患者CD3+CD4+T細胞比例及絕對計數(shù)明顯降低，CD3+CD8+T細胞比例及絕對計數(shù)明顯升高，CD4+T/CD8+T比值顯著降低[19-20]。然而，并非所有的CD3+CD8+T淋巴細胞都是效應性T細胞(effector T cells,Teff)。其中，CD8+CD28-T抑制細胞是一群抑制性T細胞(suppressor T cells,Ts)，通過抑制T細胞的活化與增殖等誘導移植腎的耐受。這在一定程度上解釋了臨床上“感染不排斥，排斥不感染”的現(xiàn)象。

自然殺傷(NK)細胞 NK細胞是固有免疫細胞中一類重要的抗病毒感染的效應細胞，研究報道缺乏T細胞的嚴重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID) 患者NK 細胞可控制CMV 感染[21]，這提示NK細胞參與抗CMV感染過程。NK細胞數(shù)量控制 CMV感染細胞表面表達了多種活化性受體和抑制性的受體，兩類受體的比例決定了NK細胞的活化和殺傷水平。研究發(fā)現(xiàn)NK 細胞重要的活化性分子CD226屬于免疫球蛋白超家族成員，是NK細胞表面一種重要的活化型受體，參與NK細胞抗腫瘤和抗感染過程[22]。研究證實外周血CD226+NK細胞比例在腎移植術(shù)后CMV感染患者顯著降低，在感染恢復期回升[23]。

淋巴細胞代謝標志物——三磷酸腺苷(ATP) ATP是CD4+T細胞的代謝標志物，CD4+T細胞接受外來抗原刺激后，其反應能力的強弱表現(xiàn)為ATP的多少，因此可用ATP數(shù)值量化CD4+T細胞的免疫反應能力，從而評估患者的免疫功能。根據(jù)ATP含量，患者免疫狀態(tài)可分為：弱免疫細胞反應(ATP≤225 μg/L)、中免疫細胞反應(ATP 226～524 μg/L)、強免疫細胞反應(ATP≥525 μg/L)。研究發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后發(fā)生CMV重癥肺炎患者的ATP含量顯著低于其他感染的患者[24]。

血漿白細胞介素10(IL-10) IL-10在腎移植術(shù)后CMV感染中發(fā)揮多重作用，盡管很多機制仍待進一步研究。ELISA是血清或胞質(zhì)內(nèi)細胞因子的重要手段。Limaye等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與腎移植術(shù)后未發(fā)生CMV病的患者相比，腎移植術(shù)后血漿IL-10陽性率明顯增高(P<0.05)；該研究還發(fā)現(xiàn)IL-10陰性可作為CMV 預防性用藥的指標，其敏感度和特異度分別為85%和78%。

CMV特異性免疫應答 CMV特異性的免疫反應在腎移植術(shù)后CMV感染中扮演重要的角色，尤其是CMV特異性的T細胞免疫應答。酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(EliSpot)是細胞免疫應答檢測的重要手段，可有效檢測在CMV感染中發(fā)揮主要免疫應答的γ干擾素(IFN-γ)陽性T細胞的數(shù)量。

IE2基因表達產(chǎn)生的調(diào)控蛋白IE86是病毒復制所必需的調(diào)控因子，而EliSpot技術(shù)是檢測細胞免疫應答最敏感的檢測方法。Bestard等[28]發(fā)現(xiàn)EliSpot檢測腎移植受者術(shù)前抗IE-1特異性T細胞免疫應答能很好地預測術(shù)后CMV的發(fā)生，其曲線下面積>0.70。但在CMV IgG(+)的腎移植受者中結(jié)果可能不一樣。Kim等[4]研究發(fā)現(xiàn)在42例IE1-特異性 ELISPOT陽性的患者中僅14例發(fā)生CMV感染，而在27例陰性患者中卻有13例發(fā)生CMV感染(P=0.22)。產(chǎn)生這種差異的原因可能是后者納入的研究對象均為CMV IgG(+)腎移植受者。該研究發(fā)現(xiàn)IE1-特異性 ELISPOT的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為48%、67%、48%和67%。因此，IE1-特異性 ELISPOT在腎移植術(shù)后CMV感染的早期診斷方面的價值仍需進一步研究。

PP65是腎移植術(shù)后CMV感染T細胞免疫應答中的另一個重要靶點，并且PP65 特異性T細胞免疫應答能力與CMV病毒血癥高度相關(guān)。Kim等[4]研究發(fā)現(xiàn)48例PP65-特異性 ELISPOT陽性中僅15例發(fā)生CMV感染，而21例結(jié)果為陰性的患者中有12例發(fā)生CMV感染P=0.04)。因此，術(shù)前可采用該法預測腎移植術(shù)后CMV感染的風險。

細胞因子信號抑制劑(SOCS) SOCS在獲得性免疫和天然免疫中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。SOCS不僅能調(diào)節(jié)免疫細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞等的免疫活性，還是T、B細胞必要的生長因子和分化因子。另外，SOCS家族兩個成員SOCS1和SOCS3作為Toll樣受體，參與CMV抗原的識別。其中，SOCS1作為IFNⅠ和Ⅱ的重要阻斷劑參與IFN-γ通路的免疫調(diào)節(jié)，SOCS3則通過調(diào)節(jié)IL-6和IL-10的分泌和釋放參與抗病毒免疫調(diào)節(jié)。Shin等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，SOCS1高表達于CMV陽性造血干細胞移植的患者中，尤其是未發(fā)生過GVHD的CMV陽性患者中；而SOCS3則相反。因此，未來SOCS的檢測可作為移植術(shù)后CMV感染診斷的輔助檢測手段。

小結(jié)：CMV感染仍然是腎移植術(shù)后不可回避的話題之一，“普遍預防”或“搶先治療”是目前各移植中心廣泛采用的防治策略。“普遍預防”是無的放矢的無奈之舉，而“搶先治療”的關(guān)鍵在于早期診斷。傳統(tǒng)的檢測手段比如組織活檢、病毒培養(yǎng)在診斷上存在明顯的滯后性，未來如果能夠聯(lián)合多項檢測手段如CVM DNA 、CMV-PP65、即刻早期基因IE2及免疫學檢測技術(shù)實現(xiàn)對CMV感染的術(shù)前預測和術(shù)后監(jiān)測，必將給CMV防治上帶來突破性進展。

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(本文編輯 逸 沐)

Early diagnostics of cytomegalovirus infection after kidney transplantation

WANGLei,PENGGuizhu

ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,InstituteofliverandgallbladderdiseaseofWuhanUniversity,TransplantcenterofWuhanUniversity,HubeikeyLaboratoryofMedicalTechnologyonTransplantation,Wuhan430071,China

The infection of cytomegalovirus (CMV) is one of the most common complications in the post-operative kidney transplantation, and is also one of the key factors of patients and renal grafts’ prognosis. Furthermore, early diagnosis and treatment means a lot to CMV infection because of its long latent period and high incidence. Recently, significant advances have happened on the diagnosis of CMV including the improvement of DNA test, application of flow cytometry and interaction of different methods.

kidney transplantation cytomegalovirus infection early diagnosis

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.03.017

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(2042015kf101)

武漢大學中南醫(yī)院，武漢大學肝膽疾病研究院，武漢大學移植中心，移植醫(yī)學技術(shù)湖北省重點實驗室(武漢，430071)

2016-04-05