新一代測序技術(shù)在局灶節(jié)段性腎小球硬化遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用

劉 劍 綜述 陳 楠 審校

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

新一代測序技術(shù)在局灶節(jié)段性腎小球硬化遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用

劉 劍 綜述 陳 楠 審校

局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是我國常見的腎小球疾病之一。近年來，新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展已廣泛應(yīng)用于基因突變檢測、SNP測定和連鎖分析，其具有高通量、費(fèi)用相對低等優(yōu)勢，是研究FSGS遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的良好方法，并為臨床遺傳學(xué)診斷提供了有利的依據(jù)。本文對新一代測序技術(shù)在家族性FSGS中的研究進(jìn)展及前景進(jìn)行綜述。

局灶節(jié)段性腎小球硬化 測序技術(shù) 遺傳

遺傳變異是影響腎臟疾病發(fā)生和進(jìn)展的重要因素。全基因組連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)分別為定位符合經(jīng)典孟德爾遺傳規(guī)律的單基因遺傳病和復(fù)雜性疾病的經(jīng)典遺傳學(xué)方法，在過去數(shù)十年間其為探索人類疾病遺傳機(jī)制做出重大貢獻(xiàn)。但這些方法尚存在一定局限性，比如連鎖分析費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對家系規(guī)模要求較高，且受到多種因素影響(如滲透率、表型差異等)。而GWAS代價(jià)昂貴，需要大量樣本，且往往不能直接定位致病變異。隨著高通量二代測序技術(shù)(NGS)的出現(xiàn)、發(fā)展及成本降低，全外顯子測序(WES)、全基因組測序(WGS)、候選基因測序(Gene Panel Sequencing)和目的區(qū)域測序(Targeted Sequencing)已經(jīng)成為遺傳學(xué)研究的重要工具之一。本文對NGS技術(shù)及其在家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FFSGS)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

新一代測序技術(shù)

概述 NGS也稱為二代測序，高通量測序或新一代測序，指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組或部分基因組DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法，可同時(shí)對幾十萬到幾百萬條短序列進(jìn)行測序，是一種研究基因組的編碼序列的高效策略。NGS在遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括全外顯子測序、全基因組測序、候選基因測序及目的區(qū)域測序。

基于探針雜交捕獲測序原理，NGS過程一般包括捕獲、建庫、測序及分析步驟。首先應(yīng)用超聲或霧化方法將基因組DNA斷裂為250 bp小片段，并與接頭連接，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備文庫。而后與覆蓋全外顯子探針進(jìn)行雜交，未雜交的DNA洗去。雜交的DNA進(jìn)行高通量測序。高通量測序結(jié)果需經(jīng)過序列組裝、比對、SNP標(biāo)記等過程，一般未處理過的一次測序結(jié)果可發(fā)現(xiàn)2～5萬變異，這些變異需經(jīng)過一系列篩選，如去除可能為假陽性的變異(每個(gè)候選變異至少有5個(gè)reads，若為純合變異需為80%，雜合變異為20%)，去除非編碼區(qū)變異和同義變異，經(jīng)過初步篩選，可以初步候選5 000個(gè)左右變異。其后，將發(fā)現(xiàn)的變異與已知單核苷酸多態(tài)性庫進(jìn)行比對(如dbSNP)，去除非致病變異，對篩選到的候選致病變異可應(yīng)用sanger測序、sequenom質(zhì)譜方法、openarray等方法驗(yàn)證[1]。

目前為止，WES是二代測序技術(shù)在人類遺傳學(xué)研究的主要應(yīng)用之一，WES相對于WGS成本較低，對研究已知基因的SNP、插入缺失突變具有較大的優(yōu)勢。人類外顯子序列占全基因組的1%，約30Mb，而以往發(fā)現(xiàn)并且經(jīng)功能研究證實(shí)的人類致病突變(孟德爾遺傳疾病)大多數(shù)位于蛋白蛋白編碼區(qū)域(85%)。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)測序深度為10X時(shí)，其發(fā)現(xiàn)雜合突變的概率為78.6%，而當(dāng)深度為20X時(shí)概率為95.2%，30X時(shí)幾乎100%[1]。因此，全外顯子測序?qū)τ谶z傳相關(guān)性疾病，尤其是孟德爾遺傳疾病有一定的優(yōu)勢。

2004年，大規(guī)模并行DNA測序技術(shù)的引入后，NGS的逐漸應(yīng)用于遺傳學(xué)研究。WES最早應(yīng)用于Miller綜合征，在三個(gè)家系中解釋了DHODH突變導(dǎo)致疾病發(fā)生。2009年，Choi等[2]在腎臟疾病中應(yīng)用Illumina測序平臺(tái)對39例臨床診斷為Bartter綜合征的患者(排除NKCC2,ROMK,ClC-Kb和Barttin基因突變)進(jìn)行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)5例患者存在SLC26A3突變，最后診斷為Gitelman綜合征，為外顯子測序在科研和臨床上的應(yīng)用提供了可能性。隨后，越來越多的WES技術(shù)應(yīng)用于不同的疾病研究中，截止2012年WES已應(yīng)用于100多種孟德爾遺傳病研究中，其中56%為常染色體顯性遺傳，37%為常染色體隱性遺傳[3]。

影響因素 測序結(jié)果受許多因素影響，比如DNA文庫構(gòu)建試劑盒、測序平臺(tái)?，F(xiàn)在應(yīng)用于WES的外顯子捕獲試劑盒包括NimbleGen(SeqCap EZ ExomeLibray)、Agilent(Sure Select)、Illumina(TruSeq和NexteraRapidCpatureExomekit)等，不同的建庫試劑盒有不同的特性，如SeqCap EZ ExomeLibray對高GC含量的區(qū)域有較好地效果，Sure Select對插入缺失突變效果較好。而現(xiàn)有測序平臺(tái)包括羅氏公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexa technology公司開發(fā)的Illumina測序儀、美國Applied biosystems公司的SOLID測序儀。盡管大部分建庫試劑盒能覆蓋50～62 Mb基因，但是有研究顯示，SeqCap EZ ExomeLibray V3、Sure Select V4以及Illumina試劑盒建庫測序后僅26.2Mb是相互重疊的[4]。

基本策略 WES或WGS在單基因遺傳疾病已有較好地應(yīng)用，對不同遺傳方式的家系有不同的策略，包括連鎖分析、Homozygosity策略、Double-hit策略、Overlap策略、候選基因策略、de novo策略等。全外顯子測序連鎖分析適用于家系成員表型較為明確的較大的遺傳家系，Homozygosity策略對近親結(jié)婚的小家系較為適用，double-hit策略對隱性遺傳的家系較為有效，overlap策略適用于顯性遺傳的家系[5]。盡管如此，多種策略聯(lián)合分析亦較為常見。候選區(qū)域多與連鎖分析聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)行后續(xù)的基因精確定位研究。對于已知候選基因的測序研究可采用候選基因測序的方法更為有針對性和節(jié)約成本，更適合于臨床診斷。

優(yōu)缺點(diǎn) 相對于傳統(tǒng)Sanger測試技術(shù)，NGS具有一定的優(yōu)勢：(1)相對成本低。把成本從 0.01美元/bp降低至0.000 1美元/bp甚至更低；(2)高度并行化?？赏瑫r(shí)檢測多至幾千萬個(gè) DNA 序列；(3)通量高且速度快。一次測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量達(dá)幾～幾十Gb，且僅需1周時(shí)間，測序結(jié)果敏感性達(dá)99%，特異性達(dá)98%；(4)相對樣本需要量小。以WES為例，僅需1～6 μg即可完成全外顯子的測序工作，而傳統(tǒng)的Sanger測序10 ng僅能完成1 000 bp測序工作。

WES可發(fā)現(xiàn)常見變異和頻率<5%低頻突變，只對基因組的約1%測序，更加經(jīng)濟(jì)、高效，在相同預(yù)算情況下，可提供更高深度測序。

盡管WGS也為二代測序的重要應(yīng)用，并且能檢測全基因組水平變異。但相較于WES，其價(jià)格更高、測序深度不夠，雖然能獲得更多地變異，但其獲得的一大部分變異位于非編碼區(qū)，且對后期的龐大數(shù)據(jù)量計(jì)算機(jī)分析及驗(yàn)證提出了更高的要求。因此，基于現(xiàn)階段技術(shù)和分析能力，WES是更有便于利用的手段。但近來有研究顯示在同樣的測序深度下，WGS對蛋白編碼區(qū)的測序結(jié)果優(yōu)于WES[6-7]。因此，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和存儲(chǔ)技術(shù)的發(fā)展，WGS是NGS應(yīng)用的未來方向。

盡管NGS是一種應(yīng)用較為廣泛的手段，但是也存在不足。首先，由于測序reads較短，所以對重復(fù)區(qū)域的變異識(shí)別能力較弱。此外，測序深度不夠、沒有捕獲的區(qū)域的變異容易出現(xiàn)假陰性；在隱性遺傳疾病中對利用NGS測序?qū)AF<1%的變異比較容易比較出現(xiàn)假陰性；且由于NGS前期需經(jīng)過擴(kuò)增，因此其對高GC區(qū)域的變異識(shí)別能力較差。

新一代測序技術(shù)在局灶節(jié)段腎小球硬化中的應(yīng)用

盡管NGS已在多種腎臟疾病中廣泛應(yīng)用，包括腎小球腎炎、糖尿病腎病、兒童先天性腎臟和尿路畸形(CAKUT)[8]、腎單位腎癆及溶血尿毒綜合征[9]等，但近來在FFSGS中的研究取得了較為有意義的成果。

FSGS是一類臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿和進(jìn)展性腎功能衰竭，病理特征為局灶節(jié)段性腎小球硬化以及足突融合的疾病，分為FFSGS、繼發(fā)性FSGS和特發(fā)性FSGS。以往通過Sanger測序或者連鎖分析發(fā)現(xiàn)FFSGS致病基因，如ACTN4[10-11]、NPHS2、TRPC6[12-13]、INF2[14]等。隨著NGS在FFSGS遺傳學(xué)研究的開展， FFSGS新的致病基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。

新發(fā)現(xiàn)的已知致病基因的新突變 利用NGS在遺傳性FSGS的研究發(fā)現(xiàn)了一部分已知致病基因的新突變，比如INF2和WT1等。INF2屬成蛋白家族，為肌動(dòng)蛋白的重要調(diào)控因子，維持骨架正常結(jié)構(gòu)和功能。早在2010年Brown等[15]在一個(gè)較大的FSGS家系中Affymetrix 250K SNP芯片和微衛(wèi)星方法定位到14q32區(qū)域，并首次驗(yàn)證出INF2突變導(dǎo)致家族性FSGS的重要原因，本課題組也通過對一個(gè)較大家系進(jìn)行連鎖分析并通過Sanger測序方法和體外功能研究發(fā)現(xiàn)INF2 S85W突變導(dǎo)致FFSGS發(fā)生[14]。近來，Park等[16]對一個(gè)腓腸肌萎縮伴FSGS家系的先證者進(jìn)行WES，發(fā)現(xiàn)INF2的新突變。WT1編碼wilm’瘤抑癌基因，參與泌尿生殖系發(fā)育,早在1999年即有學(xué)者應(yīng)用候選基因Sanger測序方法發(fā)現(xiàn)Fansier綜合征和Denys-Drash綜合征伴有FSGS改變，存在WT1突變[17]。近來Hall等[18]在一個(gè)FSGS家系中應(yīng)用連鎖分析聯(lián)合WES的方法發(fā)現(xiàn)WT1的第三鋅指區(qū)新的致病突變。

新發(fā)現(xiàn)的FFSGS致病基因 NGS研究不僅發(fā)現(xiàn)了已知致病基因的新突變，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一系列導(dǎo)致FFSGS的新的致病基因。Gbadegesin等[19]應(yīng)用全基因組連鎖分析對一個(gè)AD FSGS家系進(jìn)行分析，定位到2p、5p和7p，聯(lián)合應(yīng)用WES和足細(xì)胞相關(guān)的候選基因測序的方法，發(fā)現(xiàn)6個(gè)變異，其中ANLN R431C存在于7p，且與疾病存在共分離現(xiàn)象，首次發(fā)現(xiàn)actin結(jié)合蛋白的基因突變導(dǎo)致FSGS的發(fā)生。Esposito等[20]對一個(gè)FSGS伴心臟傳導(dǎo)阻滯的XR家系進(jìn)行連鎖分析定位于X染色體21.19 cM，其后對2例患者進(jìn)行外顯子測序策略，首次發(fā)現(xiàn)NXF5-R113W突變導(dǎo)致FFSGS。Barua等[21]對1個(gè)較小的常染色體顯性遺傳家系的2位患者進(jìn)行外顯子測序，結(jié)合功能和蛋白定位分析，發(fā)現(xiàn)基因PODXL p.L442R突變，影響其編碼蛋白Podocalyxin跨膜區(qū)域，但其功能尚需進(jìn)一步闡述。

最近的NGS研究也發(fā)現(xiàn)了一些已知導(dǎo)致其他疾病的基因突變也可引起FSGS，如PAX2、TTC21B、LMX1B、Col4A3等。既往認(rèn)為COL4A3基因突變主要導(dǎo)致Alport綜合征，本課題組通過對40個(gè)FSGS家系、50例散發(fā)性FSGS和190例正常人進(jìn)行外顯子組測序和Sanger測序[22]，在5個(gè)家系(12.5%)中發(fā)現(xiàn)雜合COL4A3突變與疾病共分離，此外在1例散發(fā)患者(2%)中亦發(fā)現(xiàn)該基因突變，絕大部分突變均位于Ⅳ型膠原功能域的高度保守區(qū)域，這些患者均無明顯腎外表現(xiàn)，皮膚及腎組織Ⅳ型膠原染色正常，電鏡下可見GBM局部節(jié)段性變薄，未見分層、網(wǎng)籃樣改變或彌漫變薄等改變。同時(shí)，Duke大學(xué)報(bào)道在70個(gè)FFSGS家系中發(fā)現(xiàn)7個(gè)家系(10%)攜帶COL4A3或COL4A4雜合突變[23]。PAX2突變既往認(rèn)為主要與CAKUT相關(guān)，而Martin R. Pollak課題組對一個(gè)顯性遺傳的FSGS家系進(jìn)行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)PAX2與成人起病的FSGS相關(guān)[24]，將PAX2突變的研究從CAKUT研究延伸到FSGS疾病中。TTC21B主要與腎單位腎癆相關(guān)，而Huynh Cong等[25]對2個(gè)較小的隱性遺傳近親家系中應(yīng)用純合子定位方法mapping到2號(hào)染色體，隨后應(yīng)用對2個(gè)家系中進(jìn)行外顯子測序，首次發(fā)現(xiàn)TTC21B p.P209L突變導(dǎo)致FSGS和間質(zhì)損傷，TTC21B編碼蛋白細(xì)胞纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白139(Intraflagellar Transport 139,IFT139)，功能學(xué)研究其可能與微管功能相關(guān)，該研究首次報(bào)道了纖毛相關(guān)基因突變參與FSGS發(fā)病過程。LMX1B突變最初在1998年認(rèn)為與指甲髕骨綜合征相關(guān)，最近Boyer等[26]在不伴有腎外表現(xiàn)的常染色體顯性遺傳的遲發(fā)型FSGS家系中發(fā)現(xiàn)LMX1B突變，且這些突變多位于LIM 區(qū)域和homeo結(jié)構(gòu)域。Colin等[27]應(yīng)用連鎖分析聯(lián)合外顯子測序在表現(xiàn)為小頭和腎病綜合征的Galloway-Mowat綜合征家系中檢測出WDR73基因突變，而WDR73蛋白主要分布于人的頭和腎臟等，且2個(gè)家系腎穿刺為FSGS，同時(shí)功能學(xué)研究顯示確實(shí)足細(xì)胞WDR73基因突變后結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常，進(jìn)一步證實(shí)WDR73突變可以引起Galloway-Mowat綜合征。

兒童起病FFSGS 在兒童起病的FFSGS中，外顯子測序也發(fā)現(xiàn)了一些重要的突變基因。有研究顯示病理表現(xiàn)為FSGS的SRNS家系進(jìn)行純合子定位，并應(yīng)用外顯子測序，發(fā)現(xiàn)CRB2和KANK4基因突變均會(huì)引起SRNS發(fā)生[28-29]。

展望

NGS是一門飛速發(fā)展的新技術(shù)。雖然該技術(shù)存在其本身的缺陷，但是在對遺傳性疾病的研究中，不同的研究策略聯(lián)合應(yīng)用對新的突變基因的發(fā)現(xiàn)有很大的幫助。在FFSGS中，現(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)一部分致病基因，僅21%左右的FSGS可由已知致病基因解釋，大量未知致病基因亟待發(fā)現(xiàn)。而在散發(fā)FSGS患者中，盡管鮮有研究利用NGS探索散發(fā)性FSGS的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，但由于NGS發(fā)現(xiàn)低頻變異(MAF<5%)和罕見變異(MAF<1%)能力強(qiáng)，而這些變異具有生物學(xué)功能的可能性更大，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)GWAS研究多發(fā)現(xiàn)常見變異(MAF>5%)的缺陷。不僅如此，NGS是GWAS精定位的重要方法之一。因此，在以后散發(fā)性的FSGS研究中， NGS聯(lián)合GWAS將對散發(fā)患者的遺傳學(xué)研究具有重要的意義。

在臨床檢測應(yīng)用中，NGS技術(shù)可對患者潛在遺傳風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行全方位評估，從而進(jìn)行早期預(yù)防、早期診斷和早期個(gè)性化干預(yù)。而與WGS相比，由于候選基因測序和WES成本相對較低，其在開展臨床診斷和推廣精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)具有重要意義。

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(本文編輯 加 則)

Applications of new generation sequencing in the genetic study of focal segmental glomerulosclerosis

LIUJian,CHENNan

DepartmentofNephrology,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,NephrologyInstituteofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

Focal segmental glomerulosclerosis is one of the most important glomerular diseases in China. In recent years, next-generation sequencing technologies have been improving as high-throughput and cost-effective approaches to detect gene mutation, SNP and do linkage analysis. And it has become a good tool to fulfill medical diagnosis and research demands for familial focal segmental glomerulosclerosis. In this review, we describe the development of next-generation sequencing in genetic research of familial focal segmental glomerulosclerosis and discuss the implementation of this novel technology in identified new causal genes.

focal segmental glomerulosclerosis next generation sequencing genetic

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.03.012

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB517604),國家自然科學(xué)基金(81570598)，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士創(chuàng)新基金(BXJ201409)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腎臟科；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腎臟病研究所(上海，200025)

2015-10-10