當(dāng)歸多糖對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血細(xì)胞、免疫功能的影響

丁學(xué)蘭，趙信科，邱勇玉，陳開兵，李應(yīng)東

（1.甘南州衛(wèi)生學(xué)校，甘肅 合作 747000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅中醫(yī)藥防治慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000）

當(dāng)歸多糖對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血細(xì)胞、免疫功能的影響

丁學(xué)蘭1，趙信科2，3，邱勇玉2，陳開兵2，李應(yīng)東2，3

（1.甘南州衛(wèi)生學(xué)校，甘肅 合作 747000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅中醫(yī)藥防治慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討當(dāng)歸多糖對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血細(xì)胞、免疫功能的影響，為臨床進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用當(dāng)歸多糖提供理論依據(jù)。方法 采用環(huán)磷酰胺腹腔給藥建立小鼠骨髓抑制模型。將SPF級Wistar雄性小鼠72只按隨機(jī)對照原則分為6組，即正常組、模型組、當(dāng)歸多糖高劑量組、當(dāng)歸多糖中劑量組、當(dāng)歸多糖低劑量組及對照組。造模成功后各組分別給予蒸餾水、高劑量當(dāng)歸多糖（400 μg/g）、中劑量當(dāng)歸多糖（200 μg/g）、低劑量當(dāng)歸多糖（100 μg/g）及利血生（20 μg/g）干預(yù)。應(yīng)用常規(guī)法測外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群、酶聯(lián)免疫吸附法檢測IgM、放射免疫法檢測IgG。結(jié)果 與B組比較，C組、D組及F組可升高WBC（P〈0.05），C組可升高RBC（P〈0.05），D組、E組可升高PLT（P〈0.05）。與B組比較，C組、D組、E組和F組的IgG、IgM含量出現(xiàn)不同程度的增高（P〈0.01或P〈0.05）；C組IgG水平相比F組高（P〈0.05），比A組低（P〈0.01）；A組與B組IgG、IgM含量比較，有顯著性差異（P〈0.05）。當(dāng)歸多糖高劑量組（C組）T細(xì)胞亞群接近正常水平，與B組比較，C組、D組、E組和F組除CD8+顯著降低外（P〈0.05），其他亞群水平均升高（P〈0.05）。結(jié)論 當(dāng)歸多糖可以改善小鼠不同程度的骨髓抑制，且能增強(qiáng)化療后小鼠的免疫功能，還可升高骨髓抑制小鼠血清中的IgG、IgM含量，以調(diào)節(jié)體液免疫，進(jìn)而調(diào)控骨髓造血。

當(dāng)歸多糖；環(huán)磷酰胺；骨髓抑制；外周血細(xì)胞；免疫功能

惡性腫瘤是一種臨床上常見的疾病，在絕大多數(shù)國家，癌癥的發(fā)病率均呈明顯上升趨勢，已成為嚴(yán)重危害全球人類健康的常見致命性疾病之一［1］。此類患者將不可避免地接觸放化療藥物，然而無論放療或化療，均存在多種不良反應(yīng)。骨髓細(xì)胞增生及代謝旺盛，對放化療藥物相對敏感，臨床最為常見的副作用為骨髓抑制，實(shí)驗(yàn)室檢查一般體現(xiàn)在白細(xì)胞（WBC）和血小板（PLT）不同程度減少，嚴(yán)重患者會(huì)出現(xiàn)三系減少的情況。由于危害程度重，化療無法繼續(xù)，會(huì)嚴(yán)重威脅患者的生存預(yù)后?；熀蟮哪褪艹潭纫蛉硕悾撬?、免疫抑制程度各異，器官出血、感染等癥狀給臨床工作者帶來了很大挑戰(zhàn)，因此，加快腫瘤細(xì)胞凋亡，減輕對正常骨髓、免疫細(xì)胞抑制是改善臨床結(jié)局的關(guān)鍵措施之一［2］。近年來，西醫(yī)治療化療術(shù)后骨髓抑制的藥物種類越來越多，但大多數(shù)到目前為止無確切的治療效果，部分藥物價(jià)格不菲或有多種不良反應(yīng)［3-4］，因此臨床不常規(guī)使用。越來越多的學(xué)者開始研究中醫(yī)藥在腫瘤防治工作中的作用，其中研究相對較多的為當(dāng)歸。作為補(bǔ)血活血藥物，當(dāng)歸主要有效成分為當(dāng)歸多糖，部分研究者認(rèn)為當(dāng)歸具有預(yù)防腫瘤、提高免疫力等功效［5-6］。然而，對于當(dāng)歸能否改善化療后骨髓抑制及免疫抑制程度，目前無大樣本基礎(chǔ)隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)。因此，本研究采用環(huán)磷酰胺腹腔給藥模擬小鼠骨髓抑制模型，探討當(dāng)歸多糖對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血細(xì)胞、免疫功能的影響，旨在為當(dāng)歸多糖預(yù)防和減輕化療后骨髓抑制及增強(qiáng)免疫功能提供新思路，現(xiàn)介紹如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的屬性及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)信息（見圖1）

圖1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的屬性及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)信息

1.2藥品與試劑（見圖2）

圖2　藥品與試劑

1.3主要儀器（見圖3）

圖3　主要儀器

1.4動(dòng)物分組流程（見圖4）

圖4　動(dòng)物分組流程

1.5模型的建立與給藥

參照劉海偉等研究者造模研究方法及預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，除正常組外，其余各組腹腔注射150 mg/kg的環(huán)磷酰胺（CTX），CTX均采用生理鹽水配制，濃度為2 mg/ml，小鼠腹腔注射1.5 ml/20 g，每日1次，持續(xù)3天。造模成功后模型組、正常組按用藥組的方法，每日灌服蒸餾水；當(dāng)歸多糖高、中、低劑量組分別給予400 μg/g、200 μg/g、100 μg/g的當(dāng)歸多糖；對照組給予20 μg/g的利血生，各組小鼠均連續(xù)灌胃14天［7-8］。

1.6檢測指標(biāo)

末次灌胃后24小時(shí)，采用尾部靜脈采血方式檢測WBC、RBC和PLT水平；股動(dòng)脈取血，按試劑盒說明步驟進(jìn)行，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群、酶聯(lián)免疫吸附法檢測IgM、放射免疫法檢測IgG。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，若為正態(tài)分布，采用（x±s）表示；若為非正態(tài)分布，則以M（Q1、Q3）表示，指標(biāo)的參考范圍以M（P5、P95）表示。組間兩兩比較使用Dunnutt檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1造模后小鼠的一般情況

造模組（除A組外）與正常組（A組）在治療前對比，表現(xiàn)：外型消瘦，鼻唇蒼白，毛發(fā)卷縮、稀少無光澤；活動(dòng)度：蜷縮弓背，懶動(dòng)，活動(dòng)量減少；精神狀態(tài)：精神萎靡，攝食減少。治療開始后，C、D、E、F各組動(dòng)物狀態(tài)逐漸改善，具體表現(xiàn)：體重增加、唇周紅潤、毛發(fā)光澤且增多；活動(dòng)度：增多；精神狀態(tài)：精神興奮，攝食增多。實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物均無死亡。

2.2造模后小鼠外周血細(xì)胞數(shù)

經(jīng)環(huán)磷酰胺腹腔注射后，與A組比較，其他各組WBC、RBC、PLT都有所下降（P〈0.01或P〈0.05），且WBC下降明顯。除A組外，其他各組的外周血細(xì)胞數(shù)采用Dunnutt法兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功，見表1。

表1　造模后各組間外周血細(xì)胞數(shù)比較（x±s）

2.3當(dāng)歸多糖對骨髓抑制小鼠WBC、RBC、PLT的影響

治療后，C組、D組、F組WBC水平均較B組高（P〈0.05）；E 組WBC有上升趨勢，但與B組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組RBC水平較B組、F組高（P〈0.05）。與A組比較，B 組WBC、RBC、PLT顯著下降（P〈0.05）；D組、E組相比B組，PLT均顯著升高（P〈0.05），詳見表2。

表2　各組治療后外周血細(xì)胞數(shù)比較（x±s）

2.4當(dāng)歸多糖對骨髓抑制小鼠體液免疫的影響

A組與B組IgG、IgM比較，有顯著性差異（P〈0.05），符合造模標(biāo)準(zhǔn)。與B組比較：C組、D組、E組以及F組均可升高IgG、IgM含量（P〈0.05或P〈0.01），C組IgG相對于A組是下降的（P〈0.01），相對于F組是升高的（P〈0.05），見表3。

表3　各組治療后IgG、IgM對比結(jié)果（x±s，μg/ml）

2.5當(dāng)歸多糖對骨髓抑制小鼠細(xì)胞免疫的影響

當(dāng)歸多糖高劑量組（C組）T細(xì)胞亞群水平接近正常指標(biāo)。與B組相比，C組、D組、E組和F組除CD8+顯著降低外（P〈0.05），其他亞群水平均升高（P〈0.05）。見表4。

表4　各組治療后T細(xì)胞亞群對比結(jié)果（x±s，%）

3　討論

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的化療藥物，存在各種副反應(yīng)，其中臨床較為常見的為骨髓及免疫抑制。由于化療后的耐受程度因人而異，因此骨髓、免疫抑制程度各異，器官出血、感染等癥狀給臨床工作者帶來了很大挑戰(zhàn)。實(shí)驗(yàn)室檢查一般體現(xiàn)為白細(xì)胞（WBC）和血小板（PLT）不同程度減少，嚴(yán)重患者出現(xiàn)三系減少的情況，由于危害程度重，化療無法繼續(xù)，從而嚴(yán)重威脅患者的生存預(yù)后。因此，加快腫瘤細(xì)胞凋亡，減輕對正常骨髓、免疫細(xì)胞抑制是改善臨床結(jié)局的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前已批準(zhǔn)用于治療化療后骨髓抑制的藥物種類繁多，大多數(shù)藥物價(jià)格不菲且無確切療效，因此臨床上急需提供有顯著抗骨髓抑制的藥物，以改善腫瘤患者的治療結(jié)局。

近年來，中醫(yī)學(xué)通常將骨髓抑制、免疫抑制、白細(xì)胞減少等歸入“虛勞”范疇［8］。虛勞即中醫(yī)所關(guān)注的以各種臟器功能減退為主要表現(xiàn)的多種慢性虛弱癥候，包括氣虛、血虛、陰虛等，具體癥狀有面色蒼白、腰膝酸軟、頭暈眼花等。研究認(rèn)為，虛勞應(yīng)遵循扶正固本、益氣養(yǎng)血的治療原則。當(dāng)歸自金代開始便應(yīng)用于中醫(yī)的益氣補(bǔ)血，其主要有效成分為當(dāng)歸多糖。近年來研究逐步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸不僅能夠促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖，改善人體外周血液微環(huán)境，同時(shí)能促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，然而具體基礎(chǔ)調(diào)控機(jī)制目前仍眾說紛紜。

本研究根據(jù)小鼠的表現(xiàn)、全血細(xì)胞減少、體液免疫及細(xì)胞免疫受到抑制，說明造模成功。當(dāng)歸多糖可升高WBC、RBC及PLT，可能是當(dāng)歸多糖中的某些成分刺激粒系、紅系或造血干/祖細(xì)胞的增殖、分化或促進(jìn)造血細(xì)胞生長因子（如EPO）分泌作用增強(qiáng)所致，結(jié)果與先前文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。丁妍、張巖巖、張明等［9-11］的相關(guān)研究指出，當(dāng)歸多糖能顯著升高貧血小鼠的紅系、白系及股骨有核細(xì)胞，對因化學(xué)藥物、放射線照射引起的骨髓抑制，促進(jìn)造血的功能更為顯著。中藥可作用于免疫器官、細(xì)胞因子、T淋巴細(xì)胞等，同時(shí)促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，改善免疫系統(tǒng)功能，調(diào)節(jié)免疫機(jī)制［12-13］。觀察當(dāng)歸多糖對骨髓抑制小鼠的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖各組可明顯升高IgG、IgM的含量（P〈0.05）；A組與B組IgG、IgM比較，有顯著性差異（P〈0.05），說明小鼠被化療藥物損傷后，即使不再使用化療藥物，機(jī)體IgG、IgM仍恢復(fù)較慢，其機(jī)制可能是通過對神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的作用而對小鼠骨髓抑制起到治療作用。本研究著重從機(jī)體外周血象，免疫球蛋白IgG、IgM水平，T細(xì)胞亞群水平進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，當(dāng)歸多糖各組與模型組比較，除CD8+降低外（P〈0.05），其他亞群水平均升高（P〈0.05），當(dāng)歸多糖高劑量組更顯著，提示高劑量的當(dāng)歸多糖對T細(xì)胞亞群的作用效果更顯著，可能與刺激某些細(xì)胞因子引起淋巴系祖細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖、分化有關(guān)。外周血的穩(wěn)定是保證腫瘤患者順利放化療的根本，而體液免疫、細(xì)胞免疫的增強(qiáng)又可使機(jī)體對抗化療藥物的毒副作用，還可以協(xié)同細(xì)胞因子作用于各系造血祖細(xì)胞或造血干細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，促進(jìn)造血系統(tǒng)恢復(fù)及免疫系統(tǒng)增強(qiáng)［14］。當(dāng)歸多糖使機(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子之間相互作用，從而保護(hù)機(jī)體免受化療藥物或放射線的傷害。因此，使用當(dāng)歸可以降低烷化劑CTX化療所致的骨髓、免疫抑制等毒副作用，恢復(fù)外周血細(xì)胞水平，調(diào)節(jié)免疫功能，從而改善臨床結(jié)局、提高腫瘤患者的生存質(zhì)量。

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G424.31

B

1671-1246（2016）16-0153-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160478）；甘肅省2009年科技重大專項(xiàng)（092NKDA017）