肉羊二細(xì)胞期胚胎（二分胚）移植試驗(yàn)研究

陳　卓，谷紅偉，方治中，陶昱菲，李　賀，萬(wàn)鵬程，郭延華，劉長(zhǎng)彬*（.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 8005；.克拉瑪依市白堿灘區(qū)肉用羊研究所，新疆 白堿灘 84000；.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 8000）

肉羊二細(xì)胞期胚胎（二分胚）移植試驗(yàn)研究

陳卓1，谷紅偉2，方治中2，陶昱菲2，李賀2，萬(wàn)鵬程3，郭延華3，劉長(zhǎng)彬3*
（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.克拉瑪依市白堿灘區(qū)肉用羊研究所，新疆 白堿灘 834000；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000）

2014～2015年，在克拉瑪依市白堿灘區(qū)肉用羊研究所進(jìn)行了不同品種肉羊超數(shù)排卵和胚胎移植（MOET），取二細(xì)胞期胚胎進(jìn)行移植試驗(yàn)。對(duì)47只供體采用FSH遞減法進(jìn)行超數(shù)排卵處理，通過(guò)宮管結(jié)合部取胚，回收二細(xì)胞期胚胎542枚，平均獲得二細(xì)胞期胚胎11.5枚。將542枚二細(xì)胞期胚胎移植給522只受體，經(jīng)過(guò)45 d后妊娠檢查，懷孕陽(yáng)性受體325只，平均受胎率為62.3%。結(jié)果表明，肉羊二細(xì)胞期胚胎移植能獲得較多的胚胎和較高的妊娠率，為同行從業(yè)者提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，可以將此項(xiàng)技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中加以推廣應(yīng)用。

肉羊；二細(xì)胞；胚胎移植

胚胎移植技術(shù)俗稱(chēng)為“借腹懷胎”、又稱(chēng)為“受精卵移植”［1-2］。根據(jù)胚胎移植來(lái)分，可分為原核期、二細(xì)胞期和桑椹胚或囊胚期的胚胎移植工作。胚胎移植技術(shù)經(jīng)歷了上百年的發(fā)展，最早是由英國(guó)劍橋大學(xué)的Walter Heape學(xué)者在1890年4月，用安哥拉兔作為試驗(yàn)動(dòng)物，成功地獲得了世界上第一個(gè)動(dòng)物胚胎移植后代。美國(guó)科學(xué)家Warwick等，1934年，在綿羊胚胎移植上獲得了成功。該技術(shù)已發(fā)展了82年［3］。根據(jù)胚胎移植相關(guān)理論基礎(chǔ)，胚胎的胚齡與受體羊的子宮所處的階段越接近，受胎率就會(huì)越高。據(jù)馬保華（2004）報(bào)道，供、受體之間同期發(fā)情處理后子宮、卵巢同期發(fā)情同步差在±1 d或0～24 h，胚胎移植受胎率最高［4-8］。徐平（2001）報(bào)道，小鼠二細(xì)胞胚胎在不同品種小鼠中進(jìn)行了二細(xì)胞胚胎的移植研究，在移植后12～14 d時(shí)，解剖小鼠，獲得受胎率平均達(dá)到了51%左右［9］。

目前，肉羊胚胎移植工作在全國(guó)大部分養(yǎng)殖地區(qū)正如火如荼的進(jìn)行，由此，給肉羊產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展帶來(lái)了契機(jī)，逐年增大純種肉羊在我國(guó)本地羊群中所占的比例，可預(yù)見(jiàn)未來(lái)幾年，我們?cè)诓妥郎暇蛯⒁?jiàn)到顏色鮮美、口感好、脂肪含量低的高檔羊肉進(jìn)入到餐館。近年來(lái)，新疆地區(qū)在肉羊胚胎生產(chǎn)及胚胎移植中的投入不斷增大，在多地開(kāi)展了肉羊胚胎移植工作，如：克拉瑪依、昌吉、哈密、二師、三師和十師等地，開(kāi)展了千枚或萬(wàn)枚胚胎移植工程。這些工程的逐年實(shí)施將給新疆本地肉羊發(fā)展和育種工作帶來(lái)便利，迎來(lái)肉羊育種的曙光。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源本試驗(yàn)材料來(lái)源是克拉瑪依市白堿灘區(qū)肉用羊研究所提供的薩?？?、陶賽特、白薩?？撕投挪慈庋?。選擇繁育過(guò)1胎以上的成母羊，年齡段在3～5歲，發(fā)情周期正常，無(wú)生殖道疾病，膘情適中。

1.1.2主要藥品和試劑常用消毒、藥品有：新吉爾滅，500 ml/瓶（遼寧修正生物制藥有限公司）；75%酒精：100 ml/瓶（新疆佳寧八四消毒液制品有限公司）；碘酒：500 ml/瓶（新疆佳寧八四消毒液制品有限公司）。

促卵泡素（FSH）400 mg/瓶（加拿大）；氯前列烯醇（PG）0.2 mg/支（上海計(jì)劃生育研究所）；孕馬血清促性腺激素（PMSG）1 000 IU/瓶（寧波三生藥業(yè)股份有限公司）；促黃體生成素（LH）200 IU/支（寧波三生藥業(yè)股份有限公司）；CIDR 20個(gè)/包（新西蘭進(jìn)口）；沖胚液、胚胎保存液等為ICP公司；黃體酮注射液；麻醉藥、解麻藥和長(zhǎng)效土霉素為國(guó)產(chǎn)。

1.1.3主要器材常用器材：恒溫水浴鍋、恒溫臺(tái)、實(shí)體顯微鏡、剪毛剪、止血鉗、帕巾鉗、手術(shù)刀柄和刀片、鑷子、手術(shù)保定架、平皿（100 mm、35 mm）和四孔板、沖胚管、撿胚針、縫合針和縫合線、采精設(shè)備等。

1.2方法

1.2.1供體超數(shù)排卵供體羊采用CIDR+FSH+PMSG+ LH法進(jìn)行處理，F(xiàn)SH總劑量為12.2 ml，遞減肌肉注射，每天2次，間隔12 h。放置CIDR陰道栓的第1天設(shè)置為0 d，第9～11 d開(kāi)始肌肉注射FSH，分7次注射，共計(jì)注射劑量為12.2 ml，在FSH倒數(shù)第2次肌肉注射時(shí)，撤出CIDR栓并肌肉注射PMSG，移除CIDR后的24～48 h開(kāi)始試情，如有發(fā)情立即靜脈或肌肉注射LH，在發(fā)情后的6～8 h陰道輸精或10～18 h后采用子宮角輸精，在輸精后的第6天，采取手術(shù)法取胚胎。在手術(shù)法取胚胎前的24 h，要給供體羊控食、控水，等待手術(shù)。

1.2.2受體同期發(fā)情處理受體羊?yàn)榱私档统杀疽话闶欠胖煤＞d栓，放置第1天為0 d，撤栓時(shí)間安排在供體羊移除CIDR栓前的6 h受體羊移除海綿栓，同時(shí)肌肉注射PMSG，24～48 h受體羊試情，并標(biāo)記記號(hào)，記錄發(fā)情日期，待供體沖胚日進(jìn)行受體移植工作。

1.2.3胚胎移植二細(xì)胞期胚胎移植采用的是手術(shù)法移植，在受體羊后腿兩側(cè)芡窩部剃毛、消毒和脫碘，技術(shù)人員勾或夾出子宮角細(xì)端，另一技術(shù)員翻開(kāi)找到輸卵管傘部，并將移胚針從傘口插入輸卵管5～12 mm處，將二細(xì)胞胚胎放置在此處，縫合后，消毒，待45～60 d時(shí)妊娠檢查。

1.2.4試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行X2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同肉羊品種對(duì)FSH超排效果的影響

4個(gè)不同肉羊品種經(jīng)FSH超數(shù)排卵后，卵巢上紅體數(shù)、卵泡數(shù)以及獲得二細(xì)胞胚胎數(shù)、未受精數(shù)，詳見(jiàn)表1。從表1中可以看出，4個(gè)不同肉羊品種，經(jīng)超數(shù)排卵處理后，平均每只供體獲得二細(xì)胞胚胎數(shù)為11.5枚，獲得較好的效果。

表1不同品種肉羊超數(shù)排卵后所取得的二細(xì)胞胚胎數(shù)

2.2不同肉羊品種二細(xì)胞胚胎受胎率

4個(gè)不同肉羊品種二細(xì)胞胚胎，經(jīng)鏡檢分類(lèi)，挑出分裂不好的胚胎，搭配正常二細(xì)胞胚胎，輸卵管傘端移植，于45～60 d B超檢查，懷孕陽(yáng)性率平均達(dá)到62.3%。詳見(jiàn)表2。

表2不同肉羊品種二細(xì)胞胚胎移植結(jié)果

3　討論

3.1不同肉羊品種獲得二細(xì)胞胚胎數(shù)分析

本試驗(yàn)中采用同一廠家的、同一型號(hào)的激素，并采取同樣的激素處理劑量和方案，得到較好的結(jié)果。通過(guò)對(duì)不同品種試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)可知，本文所列四個(gè)肉羊品種中，平均獲得可用二細(xì)胞期胚胎11.2枚，平均回收率85.2%，二細(xì)胞期胚胎位于輸卵管傘端或壺腹部，胚胎集中分布，取卵時(shí)從宮管結(jié)合部打孔插入先穴式?jīng)_胚針，使用沖胚液較少，沖胚液回流好，胚胎回收率高，且易于撿胚操作。在這四個(gè)薩?？?、陶賽特、白薩?？撕投挪慈庋蚱贩N中使用同一超排方案平均獲得胚胎10.2、10.3、12.2和14.6枚。通過(guò)目測(cè)這四個(gè)肉羊品種體重均在60～80 kg，說(shuō)明了基本相同體重的情況下，品種之間的差異不大。同時(shí)，因?yàn)檫@四個(gè)肉羊品種均為進(jìn)口品種，且雙羔率基本維持在5%～15%左右。從以上兩個(gè)方面說(shuō)明了體重懸殊不大和雙羔率較低的供體肉羊，在同一超排方案下可以取得較好的胚胎生產(chǎn)效果。

3.2不同肉羊品種二細(xì)胞胚胎的移植受胎率

本試驗(yàn)中將獲得的全部二細(xì)胞期胚胎用于移植研究，從得到的數(shù)據(jù)可以看出，二細(xì)胞期胚胎移植受胎率為62.3%，取得較好的受胎結(jié)果，可能與二細(xì)胞期胚胎正在處于細(xì)胞分裂的基數(shù)分裂期，細(xì)胞活動(dòng)旺盛，不易損傷細(xì)胞；或二細(xì)胞期胚胎移植部位在輸卵管壺腹部，更有利于二細(xì)胞期胚胎的繼續(xù)發(fā)育［10］。但是二細(xì)胞期胚胎移植的成功率受到移植的二細(xì)胞期胚胎數(shù)和供、受體羊生殖生理周期的同步化程度密切相關(guān)［11］。與桑椹胚或囊胚移植相比，在胚胎移植時(shí)桑椹胚或囊胚直接移植到子宮角小彎，而二細(xì)胞期胚胎則直接被移植送至輸卵管壺腹部，這樣更有利于胚胎進(jìn)一步發(fā)育，對(duì)隨后的胚胎著床更為有利［12-14］。

二細(xì)胞期胚胎移植工作雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，如胚胎回收率高、受精率高、節(jié)約沖胚液和受胎率較高等等。但是在胚胎生產(chǎn)和移植過(guò)程中還是遇到了一些不足之處。主要表現(xiàn)為沖胚時(shí)供體羊輸卵管傘端易受損傷、輸卵管粘連比率高、受體羊手術(shù)刀口較大（與腹腔鏡手術(shù)相比）和傷口愈合的問(wèn)題等等。這些不足在一定程度上制約了二細(xì)胞期胚胎移植的工作效率。因此，有必要進(jìn)一步深入研究諸多因素對(duì)該技術(shù)實(shí)施效果的影響，配合無(wú)菌手術(shù)技術(shù)將有助于進(jìn)一步提高二細(xì)胞期胚胎移植的工作效率，并將其推廣應(yīng)用于胚胎移植生產(chǎn)實(shí)踐中。

［1］傅文棟，李風(fēng)德，牛建克.綿羊胚胎移植研究進(jìn)展［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，2010，（18）5：20-21.

［2］侯引緒.綿羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［3］肖西山，程鵬，李玉冰，等.胚胎移植在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，60（18）：26-28.

［4］馬保華，張紅，李鍵，等.山羊胚胎移植受體同期發(fā)情優(yōu)化程序研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，17（5）：664-667.

［5］Armstrong D T，Pfitzner A P，Warnes G M，et al.Superovulation treatments and embryo transfer in Angora Goats［J］.J Reprod Fert，1983，67（2）：403-410.

［6］李鍵，馬保華，張紅，等.胚胎移植不同品種受體羊同期發(fā)情研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，18（3）：343-347.

［7］馬保華，王光亞，趙曉娥.胚胎移植供受體山羊發(fā)情控制及配比問(wèn)題的研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1999，20（3）：35-38.

［8］劉長(zhǎng)彬，楊永林，張賓，等.阿勒泰大尾羊受體羊同期發(fā)情處理程序優(yōu)化效果［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2013，43（1）：36-37.

［9］徐平.不同日齡小鼠的超排、體外受精及二細(xì)胞胚胎的比較研究（簡(jiǎn)報(bào)）［J］.實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，2001，34（3）：253-255.

［10］徐志鵬.波爾山羊胚胎移植及配子移植研究［D］.南京師范大學(xué)，2003.

［11］成國(guó)祥，王玉閣，成勇.超排山羊卵巢卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1997，17（1）：57-60.

［12］張涌，劉澤隆，李裕強(qiáng).山羊卵泡卵母細(xì)胞體外成熟的研究［J］.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，2：14-18.

［13］劉海軍，候容，張美佳.山羊卵泡卵母細(xì)胞體外成熟體外受精研究［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，7（3）：35-38.

［14］陳大元.受精生物學(xué)一受精機(jī)制與生殖工程［J］.科學(xué)出版社，2001.

（編輯：高真貞）

S821.3+6

B

1006-799X（2016）11-0083-03

兵團(tuán)院士基金專(zhuān)項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：2013BB023）；國(guó)家級(jí)肉羊“胚胎移植基地”和兵團(tuán)級(jí)肉羊“胚胎生產(chǎn)”基地；兵團(tuán)重大科技項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2013AA003-2）。

陳卓（1989-），男，江蘇南通人，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物科學(xué)。

劉長(zhǎng)彬（1977-），男，河南虞城人，副研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。