3-甲基腺嘌呤對急進(jìn)高原缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞損傷的自噬影響研究

鄭曉鳳，張久聰，鄧尚新，王彬彬，周慧茹，楊永林，馬　強(qiáng)，張方信*

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3-甲基腺嘌呤對急進(jìn)高原缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞損傷的自噬影響研究

鄭曉鳳1,2，張久聰2，鄧尚新2，王彬彬2，周慧茹2，楊永林2，馬強(qiáng)2，張方信2*

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化科，蘭州 730030；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院消化科，蘭州 730050

[摘要]目的探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)對急進(jìn)高原缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞自噬水平及損傷程度的影響。方法將50只Wistar大鼠隨機(jī)分成5組(A～E組),在低氧氧艙環(huán)境下建立急進(jìn)高原缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞損傷模型，用3-MA進(jìn)行處理，肉眼觀察各組大鼠的行為學(xué)改變，HE染色分析大鼠腸組織的損傷程度，免疫組織化學(xué)檢測自噬相關(guān)蛋白LC-3、Beclin-1的表達(dá)情況，RT-PCR方法檢測LC-3、Beclin-1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果3-MA作用于缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞后，腸組織的病理性損傷明顯加重，自噬相關(guān)蛋白LC-3、Beclin-1及其相關(guān)mRNA表達(dá)也顯著降低,細(xì)胞自噬水平下降。結(jié)論3-MA可能通過降低細(xì)胞自噬水平加重急進(jìn)高原缺氧腸上皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞自噬可能是急進(jìn)高原缺氧腸上皮細(xì)胞損傷過程中的重要保護(hù)因素之一。

[關(guān)鍵詞]3-甲基腺嘌呤；腸上皮細(xì)胞損傷；自噬；高原；缺氧

0　引言

腸上皮細(xì)胞對缺氧反應(yīng)敏感，易引起一定的損傷。最近的研究發(fā)現(xiàn)，急進(jìn)高原缺氧環(huán)境促進(jìn)腸上皮細(xì)胞損傷，且與自噬活性的表達(dá)有關(guān)[1]。自噬與腫瘤細(xì)胞缺氧的關(guān)系已得到國內(nèi)外研究的證實，但具體是一種保護(hù)作用還是抑制作用仍存有爭議，目前的研究多認(rèn)為自噬可保護(hù)腫瘤細(xì)胞增加對缺氧的耐受[2]，然而自噬在高原環(huán)境引起的缺氧應(yīng)激腸上皮細(xì)胞損傷中是否也是一種保護(hù)機(jī)制尚不明確。本實驗通過建立大鼠急進(jìn)高原缺氧模型，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)干預(yù)自噬的表達(dá)，初步探討細(xì)胞自噬在急進(jìn)高原缺氧引起的腸上皮細(xì)胞損傷中的作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物和分組選擇50只SPF級雄性Wistar大鼠(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗中心提供)，大鼠體重180～280 g，6～9周齡。將大鼠隨機(jī)平均分為A、B、C、D、E 5組，A組為平原對照組，B組為急進(jìn)高原缺氧24 h組，C組為急進(jìn)高原缺氧24 h(3-MA)干預(yù)組，D組為急進(jìn)高原缺氧48 h組，E組為急進(jìn)高原缺氧48 h(3-MA)干預(yù)組。利用模擬高原低壓氧艙建立急進(jìn)高原缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞損傷模型，模型建立前0.5 h分別給予A～C組腹腔注射1 mL 0.9%生理鹽水，C組和E組腹腔注射3-MA(劑量為20 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水中)。各組大鼠在模型建立后不同時間點斷頸處死后，打開腹腔，暴露十二指腸及空回腸，距十二指腸起始處15 cm處截取兩段2～5 cm長的空腸上段組織，用生理鹽水沖洗干凈，一段立即放入4%甲醛固定液中，一段放入凍存管中-80 ℃冰箱中保存，待檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2主要試劑LC3A/B(兔多克隆)抗體，Beclin-1(小鼠單克隆)抗體均購自美國Abcam公司；3-Methyladenine購自Sigma公司，LC3、Beclin-l及β-actin引物序列由Takara公司合成，用于RT-PCR的RNAiso plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR熒光定量PCR試劑盒均購自Takara公司，即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋試劑公司，水合氯醛、4%多聚甲醛、PBS緩沖液均由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實驗科提供。

1.3檢測指標(biāo)和方法

1.3.1大鼠行為學(xué)及腸道組織病理學(xué)觀察肉眼分別觀察給予缺氧處理及應(yīng)用3-MA后大鼠精神、呼吸、動作等的變化，處死大鼠后，在空腸上段取材，制成切片，經(jīng)過HE染色，在電子顯微鏡下觀察每組大鼠腸道組織的病理損傷情況，按Chiu氏病理評分進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，具體評分標(biāo)準(zhǔn)參照表1。

表1　腸黏膜Chiu氏病理評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2免疫組織化學(xué)方法檢測自噬相關(guān)蛋白LC-3、Beclin-1采用SABC方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)，小鼠單克隆Beclin-1抗體按1∶50稀釋，兔多克隆LC3抗體按1∶100稀釋，將浸泡在多聚甲醛中的腸組織取出裁剪，固定，制成厚度為4 μm的切片，然后依次經(jīng)過烤箱烘烤-脫蠟脫水-檸檬酸高壓熱修復(fù)-雙氧水-加入BSA-加稀釋后一抗-加入二抗-SABC-DAB顯色-蘇木素復(fù)染-鹽酸、氨水酒精分化-脫水-封片等處理。由兩位病理醫(yī)生在光鏡高倍鏡下(×200)隨機(jī)選取5個不同視野觀察分析并拍照，腸上皮細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中顆粒顏色為棕黃色為陽性表達(dá)，通過Image-Pro-Plus分析軟件對圖像進(jìn)行分析，陽性細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)用平均光密度值(MOD值)表示。

1.3.3RT-PCR方法檢測自噬相關(guān)基因的表達(dá)從GenBank中查找LC3、Beclin-1基因序列，基因的設(shè)計及合成由Takara試劑公司完成，最后經(jīng)BLAST檢測合成的引物序列證實為特異性引物序列(見表2)。將保存在-80 ℃冰箱中的腸組織取出，稱取50～100 g，采用Trizol試劑盒提取腸組織總RNA，用分光光度計對所提取的RNA進(jìn)行檢測，算出OD260/OD280，范圍在1.8～2.0之間即可繼續(xù)進(jìn)行下面的操作，所提的總RNA可于-70 ℃冰箱中保存；也可直接將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min-85 ℃ 5 s-4 ℃，合成的cDNA于-20 ℃冰箱內(nèi)保存；PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將合成的引物稀釋備用，采取SYBRGreen Ⅰ嵌合熒光法，配成20 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，每個樣本每個基因重復(fù)3次，在擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s下溶解；分析整理實驗結(jié)果，確保擴(kuò)增曲線標(biāo)注擴(kuò)增完成，擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線為單峰曲線，特異性好，用2-△△Ct法分析待測基因的相對表達(dá)量，△Ct=目的基因Ct值-β-actin Ct值?！鳌鰿t=實驗組目的基因△Ct-對照組目的基因△Ct。

表2　RT-PCR引物序列及大小

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)及組織病理學(xué)觀察當(dāng)開始暴露于缺氧環(huán)境時，大鼠起先暴躁不安，接著雙眼迷離，呼吸急促，自主活動量減少，逐漸脫離缺氧環(huán)境，大鼠開始暴躁活躍、自主活動明顯增多，給予3-MA的大鼠反應(yīng)更加敏感激烈。

肉眼觀察大鼠腸道組織，B～E組的小腸組織可見不同程度的節(jié)段性充血、壞死，且3-MA組比同一時間段的模型組充血更明顯。光鏡下觀察，與A組正常的腸黏膜組織相比，B～E組大鼠的腸黏膜均有不同程度的損傷，包括絨毛脫落、毛細(xì)血管充血、黏膜層跟黏膜下層的局部分離等，Chiu′s評分等級顯著升高(P<0.05)，各用藥組(C組和E組)較模型組(B組和D組)損傷程度加重，局部可見固有層的暴露及炎性細(xì)胞的浸潤(P<0.01)。見圖1、表3。

表3　大鼠腸道病理損傷級別得分比較

注：*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05；#與D組比較，P<0.01

圖1　組織病理學(xué)觀察

2.2免疫組織化學(xué)檢測每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×200)進(jìn)行圖像分析。結(jié)果表明，LC3、Beclin-1在正常腸上皮細(xì)胞中表達(dá)極少(圖2A、圖3A)，而在高原缺氧各個時間點的細(xì)胞中有顯著陽性表達(dá)，胞質(zhì)成棕黃色或褐黃色，偶有細(xì)胞核中表達(dá)(圖2B、D，圖3B、D)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與不同時間點模型組比較，3-MA組LC3、Beclin-1陽性表達(dá)下降(圖2C、E，圖3C、E)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

2.3RT-PCR結(jié)果相對于A組，B組、D組的Beclin-1 mRNA的相對表達(dá)量分別為8.85±0.28、4.29±0.16，表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與B組比較，C組Beclin-1 mRNA相對表達(dá)量為1.76±0.19，明顯降低(P<0.05)。與D組比較，E組Beclin-1 mRNA相對表達(dá)量為2.16±0.13，表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，LC3 mRNA表達(dá)同上(見表5)。

表4　各組LC3及Beclin-1表達(dá)情況

注：*與A比較，P<0.05;△與B組比較，P<0.05;#與D組比較，P<0.05

表5　各組LC3 mRNA及Beclin-1 mRNA表達(dá)情況(2-△△Ct值)

注：*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05；#與D組比較，P<0.05

圖2　各組LC3表達(dá)情況

3　討論

高原缺氧條件下，機(jī)體各器官均表現(xiàn)出不同程度的缺氧應(yīng)激反應(yīng)，腸道作為一個對缺氧比較敏感的器官之一，消化道癥狀亦不少見。李素芝等[3]對我國1 753例急進(jìn)高原地區(qū)的普通人群研究發(fā)現(xiàn)，約62.58%的個體出現(xiàn)消化道反應(yīng)，其癥狀發(fā)生率由高到低依次為腹脹、食欲不振、惡心、嘔吐、腹痛等。張久聰?shù)萚4]對1 137例駐格爾木高原官兵急進(jìn)高原胃腸道應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)駐不同海拔高度高原3 d內(nèi)消化系統(tǒng)癥狀依次表現(xiàn)為納差(54.7%)、惡心(31.1%)、腹脹(25.1%)、腹瀉(23.3%)、便秘(18.3%)。綜合分析高原消化道反應(yīng)發(fā)生的原因可能由于：高原缺氧應(yīng)激引起胃腸道黏膜屏障功能損傷，腔內(nèi)致病菌及內(nèi)毒素移位，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放、活化，嚴(yán)重者可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)；另一方面，缺氧環(huán)境引起機(jī)體氧供不足，大腦缺氧導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)能力減弱，進(jìn)而影響胃腸道消化液的分泌功能[4-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，缺氧應(yīng)激使胃腸功能下降，且組成腸黏膜屏障的上皮細(xì)胞中存在細(xì)胞自噬現(xiàn)象[7]，我們前期的實驗也發(fā)現(xiàn)與之相符的結(jié)果。

細(xì)胞自噬是除凋亡、壞死之外的另一種細(xì)胞程序性死亡，在正常情況下，面對各種外界刺激如缺氧、饑餓、紫外線照射時，細(xì)胞自噬常作為一種保護(hù)機(jī)制而存在，通過利用自身的溶酶體清除大分子物質(zhì)和受損的細(xì)胞器，促進(jìn)機(jī)體對外界不良環(huán)境的適應(yīng)[8]。但是在過度應(yīng)激條件下，細(xì)胞自噬的發(fā)生則導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中，缺氧可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，但是在高原缺氧環(huán)境下，腸上皮細(xì)胞是否有自噬的發(fā)生，且對機(jī)體是何種作用，尚是一個新的研究領(lǐng)域，需要進(jìn)一步研究。

通過我們前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[1,4,6,9]，高原缺氧環(huán)境引起腸黏膜屏障的損傷，且自噬體和自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1表達(dá)增加，提示細(xì)胞自噬現(xiàn)象的發(fā)生明顯增強(qiáng)，且隨著時間的延長，黏膜屏障損傷加重，腸上皮細(xì)胞自噬發(fā)生明顯增多，鑒于之前的研究結(jié)果，推測細(xì)胞自噬可能對高原缺氧引起的腸粘膜屏障損傷起保護(hù)作用。本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，篩選出細(xì)胞自噬現(xiàn)象發(fā)生較明顯的時間點(24、48 h)，在高原缺氧腸應(yīng)激模型中應(yīng)用自噬抑制劑3-MA干預(yù)腸上皮細(xì)胞自噬的發(fā)生，進(jìn)一步探討細(xì)胞自噬發(fā)生的強(qiáng)弱及腸上皮細(xì)胞的損傷程度。自噬抑制劑3-MA是至今應(yīng)用范圍廣泛且比較成熟的藥物之一，且有關(guān)研究表明，面對饑餓等應(yīng)激，3-MA可通過抑制心肌細(xì)胞自噬作用，促進(jìn)凋亡的發(fā)生，引起心肌細(xì)胞的死亡[10]，另外，3-MA也能通過抑制細(xì)胞自噬，增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[11-12]。其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是由于3-MA主要阻滯Ⅲ類磷脂酰肌醇3磷酸激酶(class Ⅲ PI3K)，從而影響自噬相關(guān)蛋白到自噬小體膜聚集啟動自噬的發(fā)生來實現(xiàn)的[13]。我們通過有關(guān)文獻(xiàn)及前期的預(yù)實驗篩選出3-MA發(fā)揮抑制自噬作用的最佳濃度，在不同的海拔條件下證明3-MA對腸黏膜上皮細(xì)胞的作用，進(jìn)而得出結(jié)論。通過肉眼觀察及腸道HE染色結(jié)果表明，應(yīng)用3-MA后，腸上皮細(xì)胞炎性水腫、壞死等損傷加重，初步提示細(xì)胞自噬對高原缺氧上皮細(xì)胞可能是一種保護(hù)作用。

雖然到目前為止，在真核生物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種自噬相關(guān)蛋白及同源物，但LC3、Beclin-1在自噬發(fā)生的不同階段具有各自的作用，常作為自噬體發(fā)生的標(biāo)志蛋白。其中，LC3微管相關(guān)蛋白1-輕鏈3(Microtubule-associated protein 1-light chain 3,LC-3)，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種，在自噬發(fā)生時，LC3-Ⅱ與自噬膜結(jié)合，其含量的高低可反映自噬泡的多少[14]。另外，LC3按亞型可分為3種，即LC3A、LC3B、LC3C，其中LC3B可用于特異性檢測自噬活性，因此，本實驗采用LC3B-Ⅱ抗體，電子顯微鏡下觀察其在腸上皮細(xì)胞中的特異性表達(dá)情況。Beclin-1基因由Liang等[15]在研究大鼠抵抗Sindbis病毒感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制時首次發(fā)現(xiàn)，是首個也是唯一一個可啟動自噬發(fā)生的基因，其發(fā)揮作用的方式主要通過與Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)結(jié)合，啟動PI3K/Akt(PKB)通路，聚集其他自噬相關(guān)蛋白到自噬前體定位，來促進(jìn)自噬的發(fā)生[16]。本實驗通過免疫組織化學(xué)法分別于24、48 h時間點檢測模型組及3-MA組LC3、Beclin-1等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組大鼠腸上皮細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒明顯增多，而3-MA組陽性顆粒明顯減少，提示LC3、Beclin-1等蛋白表達(dá)量下降。另外，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，模型組自噬相關(guān)基因表達(dá)明顯上調(diào)，3-MA組基因表達(dá)則明顯下降，與免疫組織化學(xué)結(jié)果相對應(yīng)。最近有研究表明，自噬對缺氧環(huán)境中腫瘤細(xì)胞既有保護(hù)作用，也有自噬性死亡的殺傷作用[17-18]。推測在高原缺氧應(yīng)激條件下，自噬可能起保護(hù)作用，與最初的猜想結(jié)果是一致的。

綜上所述，高原缺氧條件下，應(yīng)用3-MA后腸上皮細(xì)胞損傷明顯，自噬活性下調(diào)，細(xì)胞自噬對腸上皮細(xì)胞可能是一種保護(hù)作用，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，為高原相關(guān)胃腸道不適的預(yù)防及治療提供了一個新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang F,Deng Z,Li W,et al.Activation of autophagy in rats with plateau stress-induced intestinal failure[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(2):1816-1821.

[2]Burada F,Nicoli ER,Ciurea ME,et al.Autophagy in colorectal cancer:an important switch from physiology to pathology[J].World J Gastrointest Oncol,2015,7(11):271-284.

[3]李素芝，鄭必海，閆春城，等.急進(jìn)高原個體胃腸型高原反應(yīng)發(fā)生情況及其原因[J].職業(yè)與健康,2011,27(4)：427-429.

[4]張久聰，楊永林，馬香芝，等.駐格爾木高原官兵急進(jìn)高原胃腸道應(yīng)激反應(yīng)調(diào)查研究[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2015,36(8)：27-29.

[5]Pastorelli L,De Salvo C,Mercado JR,et al.Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation:lessons learned from animal models and human genetics[J].Front Immunol,2013,4:280.

[6]張久聰，耿聞男，張方信，等.不同海拔高度官兵519例胃鏡臨床分析[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2016,37(1)：38-41.

[7]Henderson PW,Weinstein AL,Sung J,et al.Hydrogen sulfide attenuates ischemia-reperfusion injury in in vitro and in vivo models of intestine free tissue transfer[J].Plast Reconstr Surg,2010,125(6):1670-1678.

[8]Li J,Yang D,Wang W,et al.Inhibition of autophagy by 3-MA enhances IL-24-induced apoptosis in human oral squamous cell carcinoma cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2015,34:97.

[9]Zhang F,Wu W,Deng Z,et al.High altitude increases the expression of hypoxia-inducible factor 1α and inducible nitric oxide synthase with intest-inal mucosal barrier failure in rats[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):5189-5195.

[10]楊翼，李章華，賀磊磊，等.自噬抑制劑3-MA對“饑餓狀態(tài)”下心肌細(xì)胞自噬和凋亡的影響[J].武漢體育學(xué)院學(xué)報,2014,48(11)：61-66.

[11]Liu D,Yang Y,Liu Q,et al.Inhibition of autophagy by 3-MA potentiates cisplatin-induced apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells[J].Med Oncol,2011,28(1):105-111.

[12]Li J,Hou N,Faried A,et al.Inhibition of autophagy by 3-MA enhances the effect of 5-FU-induced apoptosis in colon cancer cells[J].Ann Surg Oncol,2009,16(3):761-771.

[13]Wu YT,Tan HL,Shui G,et al.Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and III phosphoinositide 3-kinase [J].J Biol Chem,2010,285(14):10850-10861.

[14]Hu YF,Lei X,Zhang HY,et al.Expressions and clinical significance of autophagy-related markers Beclin1,LC3,and EGFR in human cervical squamous cell carcinoma[J].Onco Targets Ther,2015,8:2243-2249.

[15]Liang XH,Kleeman LK,Jiang HH,et al.Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin,a novel Bcl-2-interacting protein[J].J Virol,1998,72(11):8586-8596.

[16]Zhao R,Chen M,Jiang Z,et al.Platycodin-D induced autophagy in non-small cell lung cancer cells via PI3K/Akt/mTOR and MAPK signaling pathways[J].J Cancer,2015,6(7):623-631.

[17]Sakitani K,Hirata Y,Hikiba Y,et al.Inhibition of autophagy exerts anti-colon cancer effects via apoptosis induced by p53 activation and ER stress[J].BMC Cancer,2015,15:795.

[18]Qin W,Li C,Zheng W,et al.Inhibition of autophagy promotes metastasis and glycolysis by inducing ROS in gastric cancer cells[J].Oncotarget,2015,6(37):39839-39854.

收稿日期：2016-01-29

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81570481)；甘肅省自然科學(xué)基金(145RJZA049)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607002

Study on the influence of 3-Methyladenine on autophagy in intestinal epithelial cells of hypoxic rats rapidly ascending to high altitude areas

ZHENG Xiao-feng1,2,ZHANG Jiu-cong2,DENG Shang-xin2,WANG Bin-bin2,ZHOU Hui-ru2,YANG Yong-lin2,MA Qiang2,ZHANG Fang-xin2*

(1.Department of Gastroenterology,the Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730030,China;2.Department of Gastroenterology,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command,Lanzhou 730050,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the influence of autophagy inhibitor 3-Methyladenine (3-MA) on the level of autophagy and the injury extent of intestinal epithelial cells caused by hypobaric hypoxia in rats rapidly ascending to high altitude areas.MethodsFifty healthy male Wistar rats were randomly divided into 5 groups (A to E) and intestinal epithelial cell injury in the models of rats with hypobaric hypoxia were established in decompression chamber.Autophagy inhibitor 3-MA was employed for drug intervention.Behavioral change of rats was observed,the intestinal tissue injury was analyzed by HE staining,and the expressions of autophagy-related protein LC-3 and Beclin-1 were detected by immunohistochemistry,and the mRNA expressions of LC-3 and Beclin-1 were quantified by RT-PCR.ResultsThe injury of intestinal tissue was significantly aggravated in 3-MA group,the expressions of autophagy-related protein LC-3 and Beclin-1 and corresponding mRNAs were also significantly lower in 3-MA group.Conclusion3-MA may aggravate the damage to intestinal epithelial cells by inhibiting the autophagy in hypoxic rats rapidly ascending to high altitude areas.Autophagy may play a pivotal role in the protection of intestinal epithelial cell in high altitude areas.

Key words：3-Methyladenine;Intestinal epithelial cells injury;Autophagy;High altitude;Hypoxia