有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠再生相關(guān)因子的影響①

孫竹梅，李建民，王國(guó)立，趙雅寧，陳長(zhǎng)香，趙旭，王靜

·基礎(chǔ)研究·

有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠再生相關(guān)因子的影響①

孫竹梅1，李建民1，王國(guó)立1，趙雅寧1，陳長(zhǎng)香1，趙旭1，王靜2

目的探討有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)腦缺血大鼠腦組織海馬區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（GAP-43）、Nogo-A的影響。方法120只Sprague-Dawley大鼠平均分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組和有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組。改良Pulsinelli四血管阻斷（4-VO）法制備腦缺血再灌注模型。分別在缺血后6 h、1 d、3 d、7 d各取5只大鼠，HE染色觀察大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化，免疫組化法檢測(cè)海馬組織GAP-43、Nogo-A表達(dá)；另5只大鼠RT-PCR法檢測(cè)GAP-43、Nogo-A水平。結(jié)果與腦缺血再灌注組相比，有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組的神經(jīng)元密度、GAP-43蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），Nogo-A蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可促進(jìn)腦缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞存活和軸突再生，與上調(diào)腦組織海馬區(qū)GAP-43表達(dá)并下調(diào)Nogo-A表達(dá)有關(guān)。

腦缺血再灌注；有氧運(yùn)動(dòng)；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43；Nogo-A；大鼠

［本文著錄格式］孫竹梅，李建民，王國(guó)立，等.有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠再生相關(guān)因子的影響［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:759-764.

CITED AS:Sun ZM，Li JM，Wang GL，et al.Effect of aerobic exercise preconditioning on growth-associated protein-43 and Nogo-A in rats after cerebral ischemia/reperfusion［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:759-764.

缺血性腦血管病是我國(guó)常見病，嚴(yán)重威脅人類健康［1-4］。腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷是誘發(fā)神經(jīng)功能缺失的關(guān)鍵所在。有研究表明，腦缺血發(fā)生前進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能使腦組織對(duì)后續(xù)發(fā)生的嚴(yán)重?fù)p傷產(chǎn)生耐受，對(duì)大腦神經(jīng)功能有保護(hù)作用［5-6］。

軸突的形成、生長(zhǎng)和準(zhǔn)確投射對(duì)神經(jīng)再生有重要作用［7］。內(nèi)源性再生相關(guān)因子，如生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 （growth-associated protein-43，GAP-43），是調(diào)節(jié)軸突形成新聯(lián)系和引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的一種快速轉(zhuǎn)運(yùn)胞膜磷酸蛋白［8-9］。在髓鞘相關(guān)蛋白神經(jīng)突起生長(zhǎng)抑制分子中，Nogo-A對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用［7，10］。本研究觀察有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的腦缺血模型大鼠海馬區(qū)GAP-43、Nogo-A的表達(dá)變化及神經(jīng)細(xì)胞丟失，初步探討有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理在全腦缺血大鼠神經(jīng)元損傷中的作用。

1材料和方法

1.1試劑和儀器

多克隆GAP-43抗體、多克隆Nogo-A抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔二步法檢測(cè)試劑盒：北京中杉金橋生物科技有限公司。One Step SYBR?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit，RNAiso Plus：大連寶生物工程有限公司。引物：上海生工生物工程股份有限公司。ZH-PT型計(jì)算機(jī)控制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。5417R冷凍離心機(jī)：德國(guó)EPPENDORF公司。旋渦混勻器：江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理

120只3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠，北京維通利華公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2003-003，體質(zhì)量230～310 g。平均分成假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組，每組40只。腦缺血再灌注組應(yīng)用改良Pulsinelli四血管阻斷（4-VO）法［5］制備全腦缺血模型。動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉。頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在其下置線備用。大鼠翻正并用立體定位儀固定頭頸部，枕后部正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫凸翼孔，直視下電凝其下通過的椎動(dòng)脈2～4 s，使其永久閉塞。大鼠縫皮回籠。24 h后以無創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，10 min后松開動(dòng)脈夾。腦電圖檢測(cè)缺血后呈直線、大鼠缺血30～60 s內(nèi)昏迷，翻正反射消失、雙側(cè)瞳孔放大為造模成功。

假手術(shù)組分離暴露血管，不電凝椎動(dòng)脈，不夾閉頸總動(dòng)脈。

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組于每日9:00開始跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑臺(tái)坡度0°，先以10 m/min、15 m/min、20 m/min持續(xù)10 min適應(yīng)性訓(xùn)練7 d，而后以20 m/min持續(xù)30 min訓(xùn)練14 d［11］。訓(xùn)練后同腦缺血再灌注組法造模。

每組平均分為6 h、1 d、3 d和7 d亞組，每亞組10只。

1.3組織標(biāo)本制備

各時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠，10%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌流固定，冠狀切取背側(cè)海馬切片，約厚2 mm，4%多聚甲醛4℃固定24 h。常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片厚4 μm，45℃恒溫箱中烤干。同一層面相同切片行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

切片常規(guī)脫蠟、脫水，HE染色，中性樹膠加蓋玻片封固，在光學(xué)顯微鏡（40×10）下觀察。

1.4免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至去離子水，滴加復(fù)合消化液后37℃溫箱孵育20 min，PBS洗滌，加3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，PBS洗滌。滴加兔抗大鼠GAP-43和Nogo-A多克隆抗體（1∶300），4℃過夜；PBS洗滌，滴加生物素化二抗（兔二步法檢測(cè)試劑盒pv6001）37℃40 min，PBS洗滌；DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水透明，封片。用0.01 mol/L PBS代替一抗孵育作為陰性對(duì)照。應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)，在相同光鏡倍數(shù)（40×10）下每只大鼠選5張腦組織切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)不重疊視野，計(jì)算每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)及棕黃色顆粒細(xì)胞，取均數(shù)。

1.5PCR

另5只大鼠于造模后各時(shí)間點(diǎn)活剪斷頭處死。冰上取出海馬組織，加入RNAiso Plus液1 ml勻漿，室溫靜置5 min，12，000 r/min 4℃離心5 min，取上清移至1.5 ml離心管內(nèi)。加入RNAiso Plus溶液容積20%的氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min，12，000 r/min 4℃離心15 min，取上清液，加入RNAiso Plus溶液體積0.5～1倍的異丙醇；室溫靜置10 min，12，000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，干燥（不可加熱），溶解于DEPC處理水30 μl中，測(cè)量OD 260/280值，根據(jù)OD 260計(jì)算RNA濃度。-80℃保存。

參照CenBank公布的GAP-43、Nogo-A和GAPDH序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物。

GAPDH：上游3'-CTC CCA TTC CRC CAC CTT TG-5'；下游3'-CCACCACCC TGT TGC TGAG-5'

GAP-43：上游3'-CCC AAG CTT CCA TGC TGT GCT GTA TGA G-5'；下游3'-GGG TAC CCT CAG GCATGT TCT TGG TC-5'

Nogo-A：上游3'-GGG AAG GAT AGT GAA GGC AGA-5'；下游3'-AGG GAAAGT GTT TGC TGT GG-5'

應(yīng)用 ABI PRISM?7000和 Applied Biosystems7500 Fast Real-Time PCR System，配置反應(yīng)體系為20 μl的反應(yīng)液。42℃ 5 min，95℃ 10 s；40℃、95℃各5 s，60℃ 31 s。將GAPDH cDNA模板10倍梯度稀釋，以相同反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，形成以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光值為縱坐標(biāo)的擴(kuò)增曲線，設(shè)定循環(huán)閾值，擴(kuò)增曲線與循環(huán)閾值的交點(diǎn)稱為臨界循環(huán)數(shù)（Ct）。采用2-△△Ct計(jì)算基因表達(dá)相對(duì)濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1HE染色

假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核規(guī)則，核仁清晰。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組神經(jīng)元細(xì)胞胞體呈三角形，核皺縮深染，包漿嗜伊紅，存活神經(jīng)元數(shù)量隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而減少，3 d時(shí)壞死情況最為顯著。有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組存活神經(jīng)元數(shù)量明顯高于腦缺血再灌注組，細(xì)胞核固縮深染及水腫情況減輕。見圖1、表1。

圖1　　各組海馬區(qū)神經(jīng)元（HE染色，400×）

2.2免疫組化染色

GAP-43、Nogo-A陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，胞質(zhì)可見細(xì)小棕黃色顆粒。假手術(shù)組GAP-43、Nogo-A弱表達(dá)。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組GAP-43、Nogo-A表達(dá)增加（P＜0.05）。有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組GAP-43蛋白表達(dá)水平更高（P＜0.05），并隨時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)。有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組Nogo-A在6 h時(shí)水平最低，1 d時(shí)水平最高，然后呈下降趨勢(shì)，但各時(shí)間點(diǎn)均低于腦缺血再灌注組（P＜0.05）。見圖2、表2，圖3、表3。

圖2　各組海馬區(qū)GAP-43表達(dá)（免疫組化染色，400×）

表2　　各組大鼠海馬區(qū)GAP-43免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較

圖3　各組海馬區(qū)Nogo-A表達(dá)（免疫組化染色，400×）

表3　　各組大鼠海馬區(qū)Nogo-A免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較

2.3PCR

與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43、Nogo-A mRNA表達(dá)水平明顯增加（P＜0.01）。有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組GAP-43 mRNA表達(dá)水平明顯更高（P＜0.01），Nogo-A mRNA表達(dá)在6 h時(shí)明顯減少，并在1 d時(shí)達(dá)低值，3 d時(shí)有所上升，7 d時(shí)達(dá)高值，但仍明顯低于腦缺血再灌注組（P＜0.01）。見表4、表5。

表4　　各組大鼠海馬區(qū)GAP-43 mRNA表達(dá)比較（2-△△Ct）

表5　各組大鼠海馬區(qū)Nogo-AmRNA表達(dá)比較（2-△△Ct）

3討論

本研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練預(yù)處理能對(duì)缺血再灌

注腦組織起保護(hù)作用。為探究其機(jī)制，我們觀察大鼠海馬區(qū)GAP-43與Nogo-A的表達(dá)變化。

GAP-43是神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白質(zhì)，是神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)生長(zhǎng)、再生標(biāo)志蛋白［7，12-13］。神經(jīng)突起生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A是一種神經(jīng)軸突生長(zhǎng)相關(guān)蛋白，是抑制中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)重塑與再生的主要物質(zhì)［14-18］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，針康法、淫羊藿苷以及低氧療法等上調(diào)腦缺血區(qū)皮層GAP-43表達(dá)，促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)再生和功能恢復(fù)［14，17-18］；電針、康復(fù)訓(xùn)練、中藥、Nogo-A受體拮抗劑等抑制Nogo-A的表達(dá)，可增強(qiáng)存活腦區(qū)神經(jīng)元的修復(fù)再生，部分重建喪失的神經(jīng)功能［19-22］。

本研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理能上調(diào)腦缺血再灌注大鼠腦組織GAP-43表達(dá)，抑制Nogo-A表達(dá)，使其在更短時(shí)間內(nèi)降至較低水平。李超等證實(shí)，跑籠訓(xùn)練可促使腦梗死大鼠抓握力恢復(fù)，梗死灶周圍神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，Nogo-A蛋白水平表達(dá)下降，改善軸突生長(zhǎng)的微環(huán)境［23］。與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可保護(hù)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元，其機(jī)制可能與上調(diào)GAP-43并抑制Nogo-A的表達(dá)以促進(jìn)軸突生長(zhǎng)有關(guān)。

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Effect of Aerobic Exercise Preconditioning on Growth-associated Protein-43 and Nogo-A in Rats after Cerebral Ischemia/Reperfusion

SUN Zhu-mei1，LI Jian-min1，WANG Guo-li1，ZHAO Ya-ning1，CHEN Chang-xiang1，ZHAO Xu1，WANG Jing2
1.North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；2.Kailuan General Hospital，Tangshan，Hebei 063000，China
Correspondence to ZHAO Ya-ning.E-mail:zyning789@126.com

Objective To observe the effect of aerobic exercise preconditioning on growth-associated protein-43（GAP-43）and Nogo-A in rats after cerebral ischemia/reperfusion.Methods Sprague-Dawley rats were equally divided into sham group（n=40），cerebral ischemia/ reperfusion group（n=40）and aerobic exercise preconditioning group（n=40），and global cerebral ischemia model was formed with modified four-vessel occlusion.The rats was sacrificed six hours，one day，three days and seven days after ischemia，respectively.The hippocampus neural cells were observed in five rats with HE staining and immunohistochemistry of GAP-43 and Nogo-A，and the other five rats were tested with RT-PCR of GAP-43 and Nogo-A.Results Compared with those in the cerebral ischemia/reperfusion group，the apoptotic neurons and expression of GAP-43 significantly increased all the time points in the aerobic exercise preconditioning group（P＜0.01），while the expression of Nogo-A decreased（P＜0.01）.Conclusion Aerobic exercise preconditioning can promote the regeneration of neuronal cells and axon after cerebral ischemia/reperfusion injury，which is related to the regulation of GAP-43 and Nogo-A.

cerebral ischemia/reperfusion；aerobic exercise；growth-associated protein-43；Nogo-A；rats

R743.32

A

1006-9771（2016）07-0759-06

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.004

1.河北省衛(wèi)生廳課題（No.ZD2010106）；2.唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.14130220B）。

1.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北唐山市063000；2.唐山市開灤總醫(yī)院，河北唐山市063000。作者簡(jiǎn)介：孫竹梅（1988-），女，河北唐山市人，碩士，護(hù)師，主要研究方向：神經(jīng)修復(fù)。通訊作者：趙雅寧。E-mail:zyning789@126.com。

2016-02-22

2016-04-14）