表皮生長因子受體在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用*

晉樂飛,吳衛(wèi)東,段麗菊,段書音,胡　鵬,馮斐斐

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001　2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453000　3)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001　4)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室 鄭州 450001

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表皮生長因子受體在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用*

晉樂飛1),吳衛(wèi)東2),段麗菊3),段書音3),胡鵬3),馮斐斐4)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 4500012)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 4530003)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 4500014)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室 鄭州 450001

摘要目的：探討表皮生長因子受體(EGFR)在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用。方法：40只SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組(n=10)，分別暴露于空氣或0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧中，每天暴露3 h，連續(xù)暴露7 d。HE染色觀察小鼠肺部炎癥病理學(xué)改變，并進(jìn)行評分；免疫組化法檢測小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平；雙抗夾心ELISA法測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中趨化因子CXCL1的含量。結(jié)果：0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組小鼠肺組織炎癥評分均高于空氣組(P均<0.05)，小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平和BALF中趨化因子CXCL1的表達(dá)水平亦均高于空氣組(P均<0.05)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與小鼠肺組織炎癥病理學(xué)變化總分(r=0.652, P=0.030)、BALF中趨化因子CXCL1表達(dá)水平(r=0.925, P<0.001)均呈正相關(guān)。結(jié)論：EGFR磷酸化可能與臭氧誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥有關(guān)。

臭氧是一種強(qiáng)氧化性的氣體，主要分布在大氣的同溫層，被稱為“地球生命的保護(hù)傘”。但是，出現(xiàn)在對流層的臭氧主要源于光化學(xué)反應(yīng)，是一種二次污染物。近年來，中國大氣污染特征已經(jīng)從煤煙型污染轉(zhuǎn)變成為煤煙、交通、氧化型等共存的復(fù)合型污染，環(huán)境中的氮氧化物(NOx)排放量日益升高。在溫度適宜的情況下，NOx和空氣中的揮發(fā)性有機(jī)物在日光紫外線的照射下，經(jīng)過一系列的光化學(xué)反應(yīng)生成一種刺激性很強(qiáng)的淺藍(lán)色煙霧，其主要成分就是臭氧[1-2]。越來越多的流行病學(xué)研究[3-4]證實(shí)，長期吸入臭氧可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率升高。肺部炎癥是呼吸系統(tǒng)疾病最重要的特征，動物實(shí)驗(yàn)和人體試驗(yàn)研究[5-6]表明，臭氧能夠引起機(jī)體肺部炎癥。盡管臭氧導(dǎo)致肺部炎癥的機(jī)制還不清楚，但是近年來的體外研究[7]表明，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)可能與臭氧誘導(dǎo)的肺部炎癥有關(guān)。該研究旨在通過動物實(shí)驗(yàn)探究EGFR是否參與了臭氧所致的肺部炎癥，為進(jìn)一步研究臭氧誘導(dǎo)肺部炎癥的作用機(jī)制提供線索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組40只SPF級BALB/c小鼠，體重20～30 g，雌雄各半，均購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2010-0002，常規(guī)飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動物房，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(豫)2012-0007。40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只，分別暴露于空氣或0.5、1.0、2.0 mg/m3的臭氧。

1.1.2試劑和儀器EGFR(Y1068)磷酸化抗體(Cell Signaling公司)；小鼠趨化因子CXCL1 ELISA檢測試劑盒(武漢華美公司)；動式染毒柜(天津合普公司，型號：HOPE-MED 8050)；便攜式臭氧發(fā)生器(廣州創(chuàng)環(huán)公司，型號：CH-KTB2G)；便攜式室內(nèi)Z-1200臭氧檢測儀(Environmental Sensors公司)；EGFR(Y1068)磷酸化免疫組化二抗(武漢博士德公司)；顯微鏡顯影系統(tǒng)(Olympus公司，型號：BH-2)；Image-Pro Plus 6.0圖像采集分析系統(tǒng)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2臭氧暴露采用便攜式臭氧發(fā)生器產(chǎn)生臭氧，通過調(diào)節(jié)臭氧發(fā)生器和流量計(jì)將臭氧濃度分別控制在0.5、1.0、2.0 mg/m3，并連接動式染毒柜將臭氧導(dǎo)入動式染毒柜的暴露室中，染毒組小鼠放入臭氧暴露室，空氣組小鼠放入空氣暴露室，每天暴露3 h，持續(xù)7 d。

1.3支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的收集與趨化因子CXCL1的檢測暴露結(jié)束后第2天，水合氯醛麻醉處死7只小鼠，用剪刀從小鼠的頸部剪開，暴露主氣管，剪一斜口，插入帶有聚乙烯管的肺灌洗針頭，用5 mL一次性注射器緩緩注入1 mL生理鹽水，停留30 s，然后取下注射器，讓BALF回流入1.5 mL的EP管。BALF經(jīng)4 ℃、1 500 r/min離心10 min后，收集上清并置于-20 ℃冰箱保存。采用雙抗夾心ELISA法測定BALF中趨化因子CXCL1的含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4肺組織HE染色病理學(xué)觀察與炎癥評分暴露結(jié)束后第2天，水合氯醛麻醉處死3只小鼠，取右上葉肺置于體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液中充分固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片，置烤箱中65 ℃烤片2 h，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后進(jìn)行HE染色，再經(jīng)脫水、透明后，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。根據(jù)張妍迪等[8]的分級評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺部炎癥評分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間小鼠肺組織炎癥評分、支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平、BALF中趨化因子CXCL1表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與炎癥病理學(xué)改變總分、BALF中趨化因子CXCL1表達(dá)水平的關(guān)系采用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1小鼠一般體征暴露期間各組小鼠正常飲水、進(jìn)食，臭氧組小鼠在暴露期間可見呼吸急促、精神萎靡。

2.2肺組織病理學(xué)觀察與炎癥評分結(jié)果見圖1、表1。由圖1可知，空氣組小鼠支氣管上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊；0.5 mg/m3臭氧組小鼠支氣管上皮可見輕度纖毛脫落；1.0 mg/m3臭氧組小鼠支氣管上皮出現(xiàn)部分增厚或纖毛脫落，周圍有炎性細(xì)胞的浸潤；2.0 mg/m3臭氧組小鼠支氣管腔有少量分泌物，支氣管上皮增厚，纖毛缺損，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤。由表1可知，0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組小鼠的各項(xiàng)評分與總分均高于空氣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:空氣組；B:0.5 mg/m3臭氧組；C:1.0 mg/m3臭氧組；D:2.0 mg/m3臭氧組。圖1　各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(×400)

組別n炎性細(xì)胞浸潤肺氣腫上皮細(xì)胞損傷黏液分泌總分空氣組30.33±0.340.22±0.190.67±0.340.11±0.190.54±0.270.5mg/m3臭氧組31.33±0.34*1.44±0.20*2.00±0.33*1.33±0.34*1.53±0.18*1.0mg/m3臭氧組32.44±0.84*2.11±0.19*#1.67±0.67*1.97±0.34*1.97±0.38*2.0mg/m3臭氧組33.44±0.20*#3.44±0.51*#△2.89±0.19*#2.78±0.39*#△3.14±0.21*#△F22.68158.47514.46535.22748.200P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3臭氧暴露對小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平的影響結(jié)果見圖2、表2。由圖2可知，EGFR(Y1068)的磷酸化集中表現(xiàn)在支氣管上皮組織，肺泡上皮也有少量磷酸化。由表2可知，0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組的AOD值均高于空氣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:空氣組；B:0.5 mg/m3臭氧組；C:1.0 mg/m3臭氧組；D:2.0 mg/m3臭氧組。圖2　各組小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化情況(SP,×400)

組別nAOD值空氣組30.051±0.0070.5mg/m3臭氧組30.146±0.047*1.0mg/m3臭氧組30.208±0.003*2.0mg/m3臭氧組30.162±0.050*

F=11.110,P=0.003;*：與空氣組比較，P<0.05。

2.4臭氧暴露對小鼠BALF中炎癥趨化因子CXCL1表達(dá)的影響結(jié)果見表3。由表3可知，與空氣組相比，0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組小鼠BALF中炎癥趨化因子CXCL1的表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3　各組小鼠BALF中趨化因子CXCL1的表達(dá)水平

F=3.818,P=0.029;*：與空氣組比較，P<0.05。

2.5小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與炎癥病理學(xué)改變總分、BALF中趨化因子CXCL1表達(dá)水平的關(guān)系小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與小鼠肺組織炎癥病理學(xué)改變總分(r=0.652,P=0.030)、BALF中趨化因子CXCL1表達(dá)水平(r=0.925,P<0.001)均呈正相關(guān)。

3討論

臭氧是一種強(qiáng)氧化性的空氣污染物，主要通過呼吸道吸入對機(jī)體的健康產(chǎn)生危害[1]。流行病學(xué)研究[3]表明，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率的升高與環(huán)境中臭氧水平的上升密切相關(guān)；環(huán)境中臭氧的8 h最大平均濃度每升高0.01 mg/m3，呼吸系統(tǒng)疾病的死亡風(fēng)險(xiǎn)將升高0.5%[9]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，短期吸入臭氧能夠?qū)е聶C(jī)體肺部炎癥；并且，課題組前期的研究[7]結(jié)果表明，臭氧暴露可激活胞漿Src激酶，活化的Src激酶進(jìn)而催化上皮細(xì)胞EGFR的磷酸化，而后者可上調(diào)人支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)IL-8(與小鼠CXCL1基因同源)的表達(dá)。該研究的目的在于從生物整體水平探討EGFR在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用。

該研究結(jié)果顯示，臭氧暴露能夠?qū)е滦∈蠓谓M織的炎癥病理學(xué)變化，炎性細(xì)胞浸潤、肺氣腫、上皮細(xì)胞損傷、黏液分泌等各項(xiàng)評分和總分均明顯升高。同時(shí)，臭氧暴露還能上調(diào)BALF中趨化因子CXCL1的表達(dá)。趨化因子CXCL1屬于CXC趨化因子家族，是由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)的小分子細(xì)胞因子，通過對中性粒細(xì)胞的趨化作用參與炎癥反應(yīng)[10-11]。該課題組研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在空氣污染物(鋅離子、臭氧)誘導(dǎo)呼吸道炎癥中發(fā)揮著起始作用，氧化應(yīng)激能夠激活氧化還原相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)，進(jìn)一步介導(dǎo)IL-8、趨化因子CXCL1等促炎性因子的表達(dá)[12,14]，正是氧化應(yīng)激產(chǎn)物和這些促炎性因子最終導(dǎo)致了支氣管上皮的損傷和炎癥反應(yīng)。因此，這說明臭氧可能通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥和損傷，并且臭氧暴露劑量越高，炎癥和損傷的程度越嚴(yán)重。

該研究結(jié)果顯示，臭氧濃度為0.5 mg/m3即可導(dǎo)致小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平和BALF中趨化因子CXCL1的表達(dá)水平升高。并且相關(guān)分析結(jié)果顯示，小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與肺組織炎癥病理學(xué)改變總分、BALF中趨化因子CXCL1的表達(dá)水平均呈正相關(guān)。EGFR在呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展中作用已被廣泛認(rèn)可，并可能起著關(guān)鍵作用[7]。EGFR是一種單鏈跨膜受體，全蛋白主要分為胞外配體結(jié)合域、跨膜域和胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)，其中胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)包含Y1068、Y1148、Y1173等3個(gè)主要的自磷酸化位點(diǎn)[15]。雖然臭氧激活體內(nèi)EGFR的機(jī)制還不清楚，但是可以肯定的是，EGFR的磷酸化能夠進(jìn)一步激活下游的多條信號通路，從而調(diào)控IL-8和趨化因子CXCL1等促炎性因子的表達(dá)[7,14]。因此，該研究結(jié)果提示，EGFR在臭氧誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

綜上所述，EGFR的磷酸化與臭氧誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥有關(guān)，但是EGFR在臭氧誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(2015-10-08收稿責(zé)任編輯姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.004

#通信作者，女，1983年4月生，博士，講師，研究方向：環(huán)境污染物引起的肺部損傷，E-mail:feifeifeng@zzu.edu.cn

中圖分類號R122.2

關(guān)鍵詞小鼠；表皮生長因子受體；臭氧；炎癥；CXCL1

Role of EGF receptor in ozone-induced lung inflammation in mice

JIN Yuefei1), WU Weidong2), DUAN Liju3), DUAN Shuyin3), HU Peng3), FENG Feifei4)

1)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang4530003)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofToxicology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsmouse; epidermal growth factor receptor; ozone; inflammation; CXCL1

AbstractAim: To explore the role of epidermal growth factor receptor(EGFR) in ozone-induced lung inflammation in mice. Methods: Forty BALB/c mice were randomly allocated into four groups(n=10), and then exposed to air or 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone(3 h/d for 7 d), respectively. Inflammatory and pathological alterations were observed by HE staining. Phosphorylation of EGFR(Y1068) in bronchial epithelium was examined using immunohistochemical staining. Level of CXCL1 expression in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of mice was measured using ELISA. Results: Compared with air-exposed mice, scores of inflammatory and pathological alterations were increased after exposure to 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone(P<0.05). 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone exposure elevated levels of phosphorylated EGFR(Y1068) in bronchial epithelium(P<0.05). In addition, level of CXCL1 expression in BALF of 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone-exposed mice was increased(P<0.05). There were positive correlation between level of phosphorylated EGFR(Y1068) and total score of inflammatory and pathological alterations(r=0.652, P=0.030), CXCL1 expression in BALF(r=0.925, P<0.001).Conclusion: Phosphorylation of EGFR(Y1068) in bronchial epithelium is related to ozone-induced lung inflammation in mice.

*國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目81373030，81402712；鄭州大學(xué)優(yōu)秀青年教師發(fā)展基金資助項(xiàng)目1421329082

*：與空氣組比較，P<0.05；#：與0.5 mg/m3臭氧組比較，P<0.05；△：與1.0 mg/m3臭氧組比較，P<0.05。