基于PCR-DGGE方法分析榨菜中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)

燕平梅，喬宏萍，趙文婧，單樹花，王 琪，柴 政，陳燕飛（.太原師范學(xué)院生物系，山西 太原 03069；.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 03003）

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基于PCR-DGGE方法分析榨菜中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)

燕平梅1，喬宏萍1，趙文婧1，單樹花1，王 琪2，柴 政1，陳燕飛1
（1.太原師范學(xué)院生物系，山西 太原 030619；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031）

摘 要：為了深入了解榨菜中的乳酸菌多樣性以及影響因素，以市場(chǎng)銷售含有辣椒和不含辣椒兩種袋裝榨菜為研究對(duì)象，測(cè)定榨菜中的食鹽濃度以及亞硝酸鹽含量；通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）法分離榨菜總微生物混合16S rDNA基因V7～V8片段，采用Quantity One軟件分析乳酸菌物種豐富度、均勻度及物種多樣性指數(shù)。結(jié)果表明：含辣椒的榨菜食鹽濃度和亞硝酸鹽含量均略低于不含有辣椒的榨菜；含有辣椒和不含辣椒的榨菜兩者間物種多樣性指數(shù)、豐富度和均勻度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。通過回收DGGE電泳帶，經(jīng)克隆后測(cè)定堿基序列、與GenBank庫(kù)序列對(duì)比鑒定，不含有辣椒的榨菜5 條回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE泳帶a、b、c、d、e經(jīng)鑒定分別與Pediococcus argentinicus CRL 776、Uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12、Uncultured bacterium clone 11.02-12、Uncultured bacterium clone 11.02-9、Uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03相似度為98%、96%、97%、97%、97%。含有辣椒的榨菜4 條回收PCR-DGGE泳帶1、2、3、4經(jīng)鑒定分別與Uncultured Lactobacillus sp.、 Lactobacillus sakei A156、Lactobacillus sakei YY1、Lactobacillus sakei WJ1相似度為96%、97%、98%、97%。研究結(jié)果表明辣椒對(duì)榨菜中微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。

關(guān)鍵詞：榨菜；亞硝酸鹽；乳酸菌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳

引文格式：

燕平梅， 喬宏萍， 趙文婧， 等.基于PCR-DGGE方法分析榨菜中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 136-139.

YAN Pingmei， QIAO Hongping， ZHAO Wenjing， et al.PCR-DGGE analysis of lactic acid bacterial community structure in pickled mustard tuber［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 136-139.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613024. http://www.spkx.net.cn

榨菜作為深受大眾喜愛的腌菜之一［1-3］，口感獨(dú)特、味道鮮美、食用方便，是中國(guó)人日常飲食中不可缺少的配菜。隨著現(xiàn)代食品生物技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)酵榨菜中的微生物已成為改善榨菜口感和風(fēng)味的一種有效途徑。

目前針對(duì)發(fā)酵蔬菜中微生物多樣性的研究大多使用培養(yǎng)技術(shù)，受培養(yǎng)條件的限制，該方法并不能完全揭示產(chǎn)品中微生物菌群的組成。之前有研究表明，自然界中只有不到1%的微生物可培養(yǎng)［4］，這表明以純培養(yǎng)的方式研究發(fā)酵蔬菜中微生物的組成，結(jié)果可能會(huì)低估產(chǎn)品中微生物的多樣性。伴隨分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多基于非培養(yǎng)的微生物檢測(cè)方法和技術(shù)如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）/溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）技術(shù)［1，5］、克隆文庫(kù)分析法［6-7］、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single stronded conformation poly morphism，SSCP）技術(shù)［2，8］和高通量測(cè)序技術(shù)［9］等被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜微生物檢測(cè)中。這些新技術(shù)的使用使自然界中99%以上不可培養(yǎng)微生物的研究成為可能。其中以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的方法，如DGGE是從遺傳角度通過PCR對(duì)提取出的生物DNA進(jìn)行擴(kuò)增，之后可以通過DGGE將長(zhǎng)度相同但是堿基序列不同的DNA分離，從而達(dá)到研究微生物多樣性、親緣關(guān)系鑒定、基因突變檢測(cè)等目的。PCR-DGGE方法已被用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究［5，10］、泡菜乳酸菌多樣性的研究［11］、發(fā)酵白菜鹵中乳酸菌的多樣性分析［12］等。

隨著對(duì)榨菜的研究越來(lái)越深入，楊王君等［13］通過微生物的培養(yǎng)分離方法對(duì)四川榨菜進(jìn)行研究，分析了榨菜發(fā)酵后熟期間微生物的種類；李正國(guó)等［1］將傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和DGGE法相結(jié)合來(lái)檢測(cè)榨菜腌制過程的細(xì)菌多樣性，得到了7 個(gè)屬的細(xì)菌群落，并且得出優(yōu)勢(shì)菌群是乳桿菌屬的結(jié)論；為了進(jìn)一步了解榨菜的微生物多樣性，本實(shí)驗(yàn)以袋裝榨菜為材料，通過PCR-DGGE方法對(duì)榨菜進(jìn)行研究，探討袋裝榨菜的微生物群落結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢(shì)種群。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榨菜產(chǎn)自杭州富陽(yáng)千禧筍廠，購(gòu)于沃爾瑪超市太原店，一種為無(wú)辣椒成分的榨菜，另一種為有辣椒成分的榨菜。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-96（G）H（b）B Life Touch基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；梯度凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣

取同一批次的兩種榨菜樣品各3 份，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.2 榨菜鹵食鹽濃度及亞硝酸鹽含量的測(cè)定

用硝酸銀滴定法測(cè)定榨菜鹵食鹽濃度，以鉻酸鉀為滴定終點(diǎn)指示劑［14］；按照GB 5009.33—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的方法測(cè)定亞硝酸鹽含量［15］。

1.3.3 榨菜鹵中細(xì)菌總DNA的提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書方法提取出兩種榨菜中細(xì)菌的總DNA，保存于－20 ℃冰箱中備用。

1.3.4 細(xì)菌16S rDNA V7～V8片段的擴(kuò)增

16S rDNA V7～V8片段的引物如下：WBAC1：5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGC CCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCACCGCG-3′；WBAC2：5′-GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA-3′［11］。反應(yīng)體系總體積25 μL：Mix 12.5 μL、引物1 μL、榨菜總DNA 1.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min，30 個(gè)循環(huán)。最后于4 ℃恒溫保存。取PCR產(chǎn)物各5 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.3.5 DGGE分離16S rDNA

將樣品和熒光染色液按5∶1（V/V）比例上樣電泳，DGGE分離（凝膠配方見表1）后于凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收，溶膠后作為模板通過PCR擴(kuò)增16S rDNA V7～V8片段，純化后與pGM-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆送至華大基因公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

表 1 變性梯度凝膠配方Table 1 DGGEgelcomposition試劑 下層膠 上層膠（8%）35% 60% 40%雙丙烯酰胺加入量/mL 20 20 2 50×TAE Buffer加入量/mL 2 2 0.2去離子甲酰胺加入量/mL 14 20尿素加入量/g 14.7 21總體積/mL 100 100 10

1.3.6 DGGE條帶結(jié)構(gòu)多樣性分析

使用Quantity One軟件進(jìn)行DGGE條帶分析，每個(gè)條帶的位置和相對(duì)光密度值由該軟件自動(dòng)分析確定。為了最大程度降低DGGE過程中不同樣品間DNA上樣濃度的差異，將每個(gè)條帶的光密度峰值除以該條帶所在泳道所有條帶光密度峰值的平均值，進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。每條泳道內(nèi)的條帶數(shù)量用以評(píng)價(jià)物種豐富度指數(shù)（R），并通過條帶相對(duì)密度值計(jì)算物種均勻度指數(shù)（E）及物種多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)，H）［16］，計(jì)算公式如下：

式中：ni為單一條帶的峰面積；N為某一泳道所有峰面積；S為某一泳道的總條帶數(shù)。

1.3.7 測(cè)序結(jié)果同源性比較

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去載體及目的片段篩選，將得到的目的片段序列提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得與目的片段相似度高的序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 榨菜中的食鹽濃度和亞硝酸鹽含量

表 2 兩種榨菜中的食鹽濃度及亞硝酸鹽含量Table 2 Salt contents in different pickled mustard tuber samples榨菜種類 不含辣椒 含有辣椒食鹽濃度/（mol/L） 0.45±0.01 0.33±0.12亞硝酸鹽含量/（mg/kg） 2.80±0.08 2.40±0.07

如表2所示，兩種榨菜中，不含有辣椒的榨菜食鹽濃度及亞硝酸鹽含量稍高于含有辣椒的榨菜。兩種榨菜中亞硝酸含量均遠(yuǎn)低于GB 2762—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中規(guī)定的蔬菜及其制品腌漬蔬菜中亞硝酸鹽限量指標(biāo)（20 mg/kg），處于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)安全限量范圍內(nèi)。

2.2 PCR-DGGE結(jié)果

2.2.1 榨菜中16S rDNA基因V7～V8片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

為了研究榨菜中乳酸菌的多樣性，用乳酸菌引物對(duì)提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1A所示，電泳條帶很清晰，沒有多余雜帶，說(shuō)明提取的DNA可以用于DGGE分析。

2.2.2 榨菜16S rDNA基因V7～V8片段的PCR-DGGE圖譜分析

圖1B為榨菜乳酸菌的16S rDNA基因V7～V8片段的PCR-DGGE圖譜，圖中每個(gè)樣品的每個(gè)條帶都代表一個(gè)物種，樣品條帶的明亮程度表示乳酸菌數(shù)量的多少，條帶的多少代表乳酸菌的多樣性。不含有辣椒的樣品有5 條PCR-DGGE泳帶，初步說(shuō)明無(wú)辣椒榨菜中有5 種乳酸菌；含有辣椒的榨菜有4 條PCR-DGGE泳帶，初步說(shuō)明含辣椒榨菜中有4 種乳酸菌。無(wú)辣椒榨菜中乳酸菌數(shù)量要比含辣椒榨菜中多，說(shuō)明添加辣椒可能會(huì)影響榨菜中乳酸菌的種類。

2.2.3 DGGE回收電泳條帶的分析鑒定

兩種榨菜樣品的DGGE圖譜（圖1B）顯示，不同樣品的電泳帶數(shù)量和遷移率均不同。為了研究榨菜中的微生物種類，回收DGGE結(jié)果的每條電泳條帶，通過基因擴(kuò)增反應(yīng)后測(cè)定堿基序列、與GenBank庫(kù)序列進(jìn)行對(duì)比鑒定。不含有辣椒的樣品的5 條PCR-DGGE泳帶a、b、c、d、e分別與Pediococcus argentinicus CRL 776、Uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12、Uncultured bacterium clone 11.02-12、Uncultured bacterium clone 11.02-9、Uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03相似度為98%、96%、97%、97%、97%；含有辣椒的榨菜的4 條PCR-DGGE泳帶1、2、3、4分別與Uncultured Lactobacillus sp.、Lactobacillus sakei A156、Lactobacillus sakei YY1、Lactobacillus sakei WJ1相似度為96%、97%、98%、97%（表3）。不含有辣椒榨菜中的非培養(yǎng)微生物含量比含有辣椒榨菜中多，且有片球菌屬Pediococcus argentinicus存在；含有辣椒的榨菜中出現(xiàn)了乳酸桿菌屬Lactobacillus，且數(shù)量較多。以上結(jié)果說(shuō)明含有辣椒的榨菜與不含辣椒的榨菜乳酸菌系不同。

表 3 發(fā)酵榨菜細(xì)菌群落的DGGE圖譜條帶測(cè)序結(jié)果Table 3 DGGE patterns of bacterial community of pickled mustard tuber榨菜種類 測(cè)序條帶 與GenBank中已發(fā)表文獻(xiàn)同源性比較 相似度/%不含辣椒榨菜a Pediococcus argentinicus CRL 776 98 b Uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12 96 c Uncultured bacterium clone 11.02-12 97 d Uncultured bacterium clone 11.02-9 97 e Uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03 97含辣椒榨菜1 Uncultured Lactobacillus sp. 96 2 Lactobacillus sakei A156 97 3 Lactobacillus sakei YY1 98 4 Lactobacillus sakei WJ1 97

2.2.4 榨菜中乳酸菌群落特征

物種多樣性指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）和豐富度指數(shù)（R）是應(yīng)用數(shù)學(xué)方法來(lái)度量組成群落的種類數(shù)、個(gè)體總數(shù)以及各種群均勻程度的數(shù)量指標(biāo)，從不同角度反映群落結(jié)構(gòu)特征的量度值，表明群落的組織結(jié)構(gòu)及其生態(tài)學(xué)特征，反映群落類型的不同、群落結(jié)構(gòu)的差異、群落演替的動(dòng)態(tài)變化［16］。使用Quantity One軟件進(jìn)行DGGE條帶分析，每條泳道內(nèi)的條帶數(shù)量用以評(píng)價(jià)物種豐富度，并通過條帶相對(duì)密度值計(jì)算物種均勻度及物種多樣性。

注：同列小寫字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

如表4所示，含有辣椒的榨菜和不含辣椒的榨菜兩者間多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明辣椒對(duì)榨菜中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響無(wú)顯著差異。

3 討 論

蔬菜發(fā)酵初期首先是附著在原料表面的雜菌不斷生長(zhǎng)繁殖，主要有非腸道菌屬、酵母菌屬，也有腸道細(xì)菌屬等，同時(shí)乳酸菌也隨之增殖［17］。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，雜菌的種類和數(shù)量減少，乳酸菌數(shù)量迅速增加，占細(xì)菌總數(shù)的比例不斷增加。發(fā)酵后期，發(fā)酵蔬菜中的微生物主要是乳酸菌［18-20］。本實(shí)驗(yàn)以市場(chǎng)成熟的榨菜為材料，通過對(duì)DGGE回收電泳條帶的分析鑒定可知，不含有辣椒的榨菜中有片球菌屬Pediococcus argentinicus存在；含有辣椒的榨菜中有乳酸桿菌屬Lactobacillus，含有辣椒與不含有辣椒的兩種榨菜菌中均含有乳酸菌，這說(shuō)明基于DGGE分析蔬菜發(fā)酵體系微生物群落的結(jié)果與大量研究得出蔬菜發(fā)酵微生物變化的規(guī)律相符，即蔬菜發(fā)酵后期乳酸菌為主要微生物。

本實(shí)驗(yàn)在含有辣椒的榨菜中檢測(cè)到了Lactobacillus sakei的存在。Lee等［21］以PCR結(jié)合DGGE的方法鑒定了韓國(guó)發(fā)酵白菜中主要的微生物為Weissella confusa、Leuconostoc citreum、Lactobacillus sakei和Lactobacillus curvatus，這可能是由于韓國(guó)發(fā)酵白菜與榨菜的原料和加工方法不同所致。

本課題組之前的研究表明泡菜中的乳酸菌能夠降解亞硝酸鹽［22］，Park等［23］也報(bào)道了Kimchi（韓國(guó)泡菜）發(fā)酵過程中乳酸菌可降解大量亞硝酸鹽。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有的辣椒榨菜中亞硝酸鹽含量低于不含辣椒的榨菜，這是否由于含有辣椒的榨菜中乳酸桿菌屬Lactobacillu數(shù)量與不含有辣椒的榨菜乳酸菌數(shù)量不同引起，尚有待進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0136-04

收稿日期：2015-08-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171743）；山西省基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目（2014091003-0107）

作者簡(jiǎn)介：燕平梅（1968—），女，教授，博士，主要從事微生物生態(tài)學(xué)研究。E-mail：yanpingmei1968@163.com

PCR-DGGE Analysis of Lactic Acid Bacterial Community Structure in Pickled Mustard Tuber

YAN Pingmei1， QIAO Hongping1， ZHAO Wenjing1， SHAN Shuhua1， WANG Qi2， CHAI Zheng1， CHEN Yanfei1
（1.Department of Biology， Taiyuan Normal University， Taiyuan 030619， China；2.College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030031， China）

Abstract:In order to understand the diversity of lactic acid bacteria in pickled mustard tuber and its influencing factors， two commercial bagged pickled mustard tubers （with and without hot pepper） were determined for the contents of salt and nitrite，and the V7-V8 region of total bacterial 16S rDNA sequences was separated by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）.Furthermore， the species richness， evenness and diversity of lactic acid bacteria were analyzed by the Quantity One software.Results indicated that the contents of salt and nitrite in the first sample were slightly lower than in the second sample.However， no significant difference in species richness， evenness and diversity was observed between both samples （P > 0.05）.The target DGGE bands were recovered， cloned and sequenced by comparison with the sequences published in the GenBank after PCR amplification.A total of 5 bands from the DGGE gel of the second sample were recovered and identified as Pediococcus argentinicus CRL 776， uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12， uncultured bacterium clone 11.02-12， uncultured bacterium clone 11.02-9， and uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03 with a similarity of 98%， 96%， 97%， 97%， and 97%， respectively.Four bands from the first sample were recovered and identified as uncultured Lactobacillus sp.， Lactobacillus sakei A156， Lactobacillus sakei YY1， and Lactobacillus sakei WJ1 with a similarity of 96%， 97%， 98% and 97%， respectively.These results show that hot pepper has little effect on the microbial community structure of pickled mustard tuber.

Key words:pickled mustard tuber； nitrite； lactic acid bacteria； polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）