IgA缺乏癥獻血者酶聯(lián)免疫試驗篩查方法的建立*

袁文聲，易　峰

(廣東省中山市中心血站　528400)

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IgA缺乏癥獻血者酶聯(lián)免疫試驗篩查方法的建立*

袁文聲，易峰

(廣東省中山市中心血站528400)

摘要:目的建立適合用于大規(guī)模IgA缺乏癥獻血者篩選的ELISA檢測方法。方法采用間接酶聯(lián)免疫法，在微孔板中包被羊抗人IgA、用辣根過氧化物酶標記羊抗人IgA抗體作為酶標二抗。結(jié)果建立的ELISA測定法靈敏度為0.1 μg/mL，IgA濃度為0.1、100 μg/mL的批間變異系數(shù)(CV)是1.74%、3.49%，批間CV中位數(shù)為3.48%(范圍：1.83%～6.96%)。檢測過程約80 min。結(jié)論成功建立了IgA缺乏癥篩查的ELISA測定法，其靈敏度高、特異度強、省時、操作簡易，可用于大規(guī)模篩選IgA缺乏癥獻血者及建立IgA缺乏獻血者庫。

關鍵詞:IgA；酶聯(lián)免疫試驗；IgA缺乏；獻血者

選擇性IgA缺乏癥是指血清IgA低于0.05 g/L或缺失，而IgG和IgM血清濃度正常，是免疫缺陷中最常見的類型[1]。IgA缺乏癥患者接觸外來抗原免疫刺激后，體內(nèi)會產(chǎn)生抗IgA抗體，當輸注含IgA的血液或血制品時可引起嚴重過敏性休克反應，因此可選擇性輸注IgA缺乏獻血者的血液制品。迄今為止中國人群健康獻血者中IgA缺乏癥患者的大規(guī)模篩查鮮有報道，在血站日常的獻血樣本篩選中，并無IgA缺乏癥的專項檢測，所以中國人群IgA缺乏癥患者的輸血存在潛在隱患。本研究擬建立靈敏度高、特異度強，尤其是高通量的ELISA法，用于大規(guī)模的獻血者篩查，建立IgA缺乏癥獻血者庫。

1材料與方法

1.1儀器與試劑96孔平底微板(Grerner，德國)，水浴箱(德國JULABO,SW22)，酶標儀(安圖Phomo)，微量加樣器(安圖Lisa)，鼠抗人IgA單克隆抗體(SBA，美國)，人標準血清(Athens Research & Technology，美國)，辣根過氧化酶羊抗人IgA抗體(SBA，美國)，濃縮包被緩沖液(Thermo Scientific，美國)，封閉液(Thermo Scientific，美國)，底物顯色液TMB(Thermo Scientific，美國)，終止液(上海迪申生物)，20×PBS緩沖液(上海迪申生物)，吐溫Tween-20(上海思吉)。

1.2方法

1.2.1包被微板用包被緩沖液(pH9.6，0.05 mmol/L碳酸鹽緩沖液)將鼠抗人IgA抗體以1∶1 000稀釋，每孔加入100 μL，用封口膜封板，輕輕震蕩混勻，置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日每孔加入0.05%T-PBS(由20×PBS和吐溫Tween-20配制而成，吐溫質(zhì)量分數(shù)為0.05%)300 μL/孔，洗滌3次，扣干后加入200 μL/孔封閉液；將微孔板置于37 ℃水浴箱孵育，30 min后取出，重復洗板3次。待板扣干后密封存于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2加標準品和樣品血清先將人標準血清稀釋成1、10、102、103、104共4個濃度梯度，最終濃度從高至低分別為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL。加入到96孔板中縱向相應位置,每孔100 μL； 將血清樣本作1∶100稀釋后加100 μL到96孔板中縱向相應位置，(37±1)℃培養(yǎng)30 min。6次洗板后，向每個微孔中添加在1/4 000洗滌液稀釋的100 μL辣根過氧化酶偶聯(lián)二抗，并在37 ℃下培養(yǎng)30 min。洗板6次后，加100 μL/孔底物顯色液TMB，并在22 ℃下的黑暗中孵育20 min。加入50 μL的4N硫酸終止反應，測定每孔在492 nm下的吸光度(OD)，設定參考波長為620 nm。吸光度值均按照樣品空白校正，其中包括人類IgA缺乏血漿。為了實現(xiàn)檢測的標準化，通過稀釋IgA缺乏人類血漿制備的參考IgA獲得已知濃度的IgA。每個IgA稀釋液都按照上述描述經(jīng)過了6次處理，并且計算了平均，標準偏差(s)，關于平均值的99%可信區(qū)間(CI)，OD的變異系數(shù)(CV)。

2結(jié)果

2.1ELISA標準曲線及評測評估使用對照IgA制備物的稀釋液，制作了與OD到IgA濃度有關的標準化和檢測靈敏度A標準曲線。IgA濃度的OD為0.01 μg/mL，與IgA缺乏血漿的OD重疊。相比之下，IgA濃度為0.1 μg/mL的平均OD周圍的99%CI的下限，是IgA缺乏血漿平均值99%CI上限的3.1倍。因此，檢測靈敏度為0.1 μg/mL，因為這是能與空白明顯區(qū)分的最低IgA濃度。

2.2ELISA精確性、靈敏度和重復性IgA濃度在0.1 μg/mL和100 μg/mL范圍內(nèi)的批內(nèi)檢測CV從1.74%到3.49%變化，見表1。通過分析6次檢測中正常獻血者的20個樣品，評估了批間檢測CV。OD的批間檢測CV中位數(shù)為3.48%(范圍：1.83%～6.96%)，見表2。

表1　　不同濃度的IgA標準人血清在波長450 nm處對應的OD和CV值

注：OD為450 nm波長處重復3孔的平均值。

表2　　20例正常獻血者IgA檢測的OD和CV值

注：OD為450 nm波長處重復3孔的平均值。

2.3ELISA高劑量鉤狀效應為了測試因獻血者血漿的高IgA水平導致假陰性結(jié)果的可能性(高劑量鉤狀效應)，本研究對人體單克隆IgA倍比稀釋，最終IgA濃度范圍是6.8～96.7 μg/mL。在所有情況下，OD值仍很高，證明該檢測不具有高劑量鉤狀效應傾向。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)IgA缺乏的患者血漿中含有IgA抗體，這類個體在接受含有IgA血液成分時，可能會發(fā)生嚴重的過敏性反應，雖然該過敏性反應的頻率僅為1∶20 000～1∶47 000名受血者之間，但也成了最常見的非溶血性輸血相關病死率原因之一[2-4]。故此血漿中含抗IgA的患者應接受低IgA的血液成分，最理想的是含有IgA<0.5 μg/mL的血液成分。

對于這類含IgA抗體的IgA缺乏患者輸血治療一般有3種方法[5]：自體血液輸注；采用經(jīng)多次洗滌后的紅細胞或血小板；輸注IgA缺乏獻血者的血液成分。自體血液輸注對于失血過多的患者不可行，而通過反復洗滌細胞可以獲得低IgA紅細胞和血小板，然而操作繁瑣、耗時費力，且對于高度致敏受血者是不夠的，同時不適合那些需要輸注血漿或冷沉淀的患者，故此輸注IgA缺乏獻血者的血液成分似乎是更好的選擇。

已報道的對IgA缺乏的檢測方法有放射免疫擴散法、免疫比濁法、放射免疫、被動凝集抑制試驗等[6-8]。放射免疫擴散、免疫比濁法和放射免疫的靈敏度很低，檢測時間長，無法輕易實現(xiàn)自動化，或者需要昂貴的儀器。被動凝集抑制試驗用于某些血站篩選IgA缺乏的獻血者。這個試驗的一個優(yōu)勢，是可以適應自動化設備，靈敏度在0.5 μg/mL左右，并且檢測時間較短，然而該試驗需要繁復的紅細胞包覆步驟，以及相對專業(yè)的技能，才能得到滿意的效果。此外，若獻血者血清中存在抗紅細胞抗體，容易發(fā)生假陽性反應[9]。因此，上述方法應用于大規(guī)模人群篩查IgA缺乏癥時有局限性，而ELISA法由于其靈敏度高、特異度強尤其是高通量的優(yōu)點適用于大規(guī)模的人群篩選，但是相關報道中仍存在需要改進的地方。本研究擬建立靈敏度高、特異性強尤其是高通量的ELISA檢測法，用于大規(guī)模的獻血者篩選，建立IgA缺乏癥獻血者庫。

本研究建立的ELISA靈敏度水平，與那些報道的類似測定法相比，也毫不遜色，其范圍為0.5～5 μg/mL，低于IgA缺乏血液成分提出的0.5 μg/mL閾值的5倍[7-8,10]，精度也令人滿意，因為在測定法靈敏度極限中IgA濃度CV僅為3.49%，而對于批間重復性評估，CV都低于6.96%。對IgA缺乏獻血者進行了明確區(qū)分，因為正常和IgA缺乏樣品之間OD的差異約為105倍。理論上，因為鄰孔污染，可能導致一些IgA缺乏癥獻血者未被發(fā)現(xiàn)。然而，不同微孔板中反復測定IgA缺乏癥患者血清標本，沒有發(fā)現(xiàn)污染；另外，因“高劑量鉤狀效應(抗原抗體比例不合適而導致假陰性的現(xiàn)象)”造成的檢測錯誤也是不可忽視的，即把IgA血清水平異常高當成IgA缺乏，這一作用在一步夾心法中發(fā)生，原因為過量的被測物與固相蛋白及標記蛋白爭相結(jié)合，難以或不能有效地形成夾心結(jié)合物，使強陽性標本誤測為弱陽性甚至假陰性結(jié)果[11]。高劑量鉤狀效應在兩步法檢測中是非常罕見的，本研究測試了IgA濃度非常高的樣品后，發(fā)現(xiàn)OD值仍很高，證明該檢測不具有高劑量鉤狀效應傾向。

本研究中的96孔測試板可以通過使用自動樣品處理儀來制備，用于分配包被抗體，洗滌和封閉試劑。此外，微孔板可以冷凍存儲，性能上沒有任何損失，至少可存貯存3個月。因此，在處理便利性，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性方面，它可以與一個商用的試劑盒媲美。本研究建立的ELISA法在試劑成分、實驗條件、實驗時間、靈敏度上都作了優(yōu)化和改進，并做了質(zhì)控陰性對照和空白對照使實驗更符合標準操作規(guī)范，與文獻報道采用的其他方法相比，解決了檢測時間長、對實驗人員有危害等不足之處。

綜上所述，本研究建立的方法與已有技術相對照,其效果是積極和明顯的。由于快速、經(jīng)濟、簡便、檢測數(shù)量大，本方法可以應用于臨床醫(yī)療單位及血站的常規(guī)血液檢測，為IgA缺乏癥患者減少輸血風險，提高了輸血的安全性，接下來利用已建立的這種可靠的方法進行中國漢族健康獻血者的缺乏篩查。

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* 基金項目：廣東省中山市科技計劃項目(2015B1251)。

作者簡介：袁文聲，女，副主任醫(yī)師，主要從事臨床輸血與檢驗研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.020

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1951-03

(收稿日期：2016-01-11修回日期：2016-03-22)

Establishment of ELISA screening method in blood donors with IgA deficiency*

YUANWensheng,YIFeng

(ZhongshanMunicipalBloodCenter，Zhongshan,Guangdong528400,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA) method for a large-scale screening of IgA deficiency in blood donors.MethodsThe indirect ELISA was adopted.The goat anti-human IgA antibody was coated in microwell plates and labeled by horse radish peroxidase (HRP) as enzyme-labelled secondary antibody.ResultsThe sensitivity of established ELISA detection method was 0.1 μg/mL.The intraassay coefficients of variation (CV) for IgA concentrations of 0.1,100 μg/mL were 1.74% to 3.49%.The median interassay CV was 3.48%(range:1.83%-6.96%).The assay process was 80 min.ConclusionThe ELISA detection method is successfully established with high sensitivity,strong specificity,timesaving and easy operating and can be used for a large scale screening of Ig A deficiency and establishment of blood donors bank of Ig A deficiency.

Key words:IgA；enzyme immunoassay；IgA deficiency；blood donor