舞毒蛾LdGSTe1基因的克隆及表達(dá)

問(wèn)榮榮，王步勇，馬玲

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

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舞毒蛾LdGSTe1基因的克隆及表達(dá)

問(wèn)榮榮，王步勇，馬玲*

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

從舞毒蛾（Lymantria dispar）3齡幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中鑒定獲得舞毒蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng)cDNA，命名為 LdGSTe1。該基因全長(zhǎng) 651 bp，編碼 216個(gè)氨基酸。序列分析顯示，LdGSTe1蛋白氨基酸序列含有GST_C_Delta_Epsilon與GST_N_Delta_Epsilon 2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，屬于類(lèi)硫氧還蛋白和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2個(gè)超家族。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，舞毒蛾LdGST蛋白屬于GST Epsilon家族。蛋白結(jié)構(gòu)顯示，LdGSTe1蛋白包含一個(gè)N端和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)，α-螺旋與β-折疊為主要結(jié)構(gòu)元件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在4.0、10.0 mg/L魚(yú)藤酮藥劑處理下，舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)LdGSTe1基因表達(dá)先下降后上升，推測(cè)該基因參與舞毒蛾解毒應(yīng)答。

舞毒蛾；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因；克??；基因表達(dá)

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谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）是由多個(gè)基因編碼的具有轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)、解毒功能的超家族酶系，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)［1-2］。依據(jù)細(xì)胞定位，GSTs可分為微粒體型、線粒體型和胞質(zhì)型?；诜植紡V泛和功能重要的特點(diǎn)，胞質(zhì)GSTs成為研究最為廣泛和深入的類(lèi)型。昆蟲(chóng)胞質(zhì)GSTs 的主要功能是催化谷胱甘肽的巰基和一些毒親電子類(lèi)物質(zhì)（如殺蟲(chóng)劑、醌類(lèi)化合物、α，β-不飽和羰基化合物及過(guò)氧化物等）進(jìn)行軛合反應(yīng)，以及作為配體結(jié)合蛋白以俘獲有毒物質(zhì)，行使解毒功能，參與殺蟲(chóng)劑抗藥性的形成［3］。Chelvanayagam 等［4］將昆蟲(chóng)胞質(zhì) GSTs 分為3類(lèi)：第Ⅰ類(lèi)為 Delta 亞族；第Ⅱ類(lèi)分別為 Sigma、Omega、Theta 和 Zeta 4 個(gè)亞族；第Ⅲ類(lèi)為 Epsilon亞族，其中Delta和Epsilon為昆蟲(chóng)所特有，且 Delta亞族存在于所有昆蟲(chóng)中，而 Epsilon 亞族僅在雙翅目、鞘翅目、鱗翅目昆蟲(chóng)中出現(xiàn)。Robert［5］認(rèn)為Epsilon 亞族是從 Delta 亞族進(jìn)化來(lái)的，而不是由于基因丟失造成的。已有研究表明，Delta和Epsilon 類(lèi)GSTs能夠催化谷胱甘肽化合物與外源的多種有害物質(zhì)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，從而保護(hù)蛋白質(zhì)和核酸免受損傷［6］，參與昆蟲(chóng)抗藥性形成過(guò)程［7］。該兩類(lèi)GSTs在殺蟲(chóng)劑抗性中起到的重要作用得到廣泛關(guān)注［8-10］。

舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）是分布范圍較廣、周期性發(fā)生的農(nóng)林食葉害蟲(chóng)，可取食數(shù)百種植物［11］，嚴(yán)重危害農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。對(duì)舞毒蛾的防治以化學(xué)防治為主。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)防治農(nóng)林害蟲(chóng)成為研究的熱點(diǎn)。通過(guò)調(diào)節(jié)參與機(jī)體至關(guān)重要功能的基因表達(dá)來(lái)干擾害蟲(chóng)正常的生理功能已成為防治害蟲(chóng)的新策略［12］，因此，對(duì)昆蟲(chóng)抗藥性形成相關(guān)的 GST基因進(jìn)行研究具有重要意義。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因已在黑腹果蠅［13］、大劣按蚊［14］、小菜蛾［15］、紅火蟻［16］中被報(bào)道。筆者對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄本文庫(kù)進(jìn)行分析，獲得舞毒蛾谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 Epsilon類(lèi)基因（LdGSTe1）cDNA全長(zhǎng)，并通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆驗(yàn)證。通過(guò)生物信息學(xué)分析，初步了解其結(jié)構(gòu)與功能。進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因?qū)χ参镌礆⑾x(chóng)劑魚(yú)藤酮的脅迫響應(yīng)模式，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1供試?yán)ハx(chóng)

于小興安嶺涼水自然保護(hù)區(qū)（黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)境內(nèi)，地理坐標(biāo)為128°53′20″E，47°10′50″N）采集舞毒蛾卵塊。卵塊于（25±1） ℃、相對(duì)濕度75%、每天光照14 h、黑暗10 h條件下進(jìn)行孵化。幼蟲(chóng)以相同條件進(jìn)行培養(yǎng)。人工飼料由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所提供。收集長(zhǎng)勢(shì)健康一致的舞毒蛾 3齡幼蟲(chóng)，經(jīng) 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液沖洗后，-80 ℃冰箱存儲(chǔ)，備用。

1.2方法

1.2.1舞毒蛾LdGSTe1基因的克隆

采用Invitrogen Trizol Reagent RNA提取試劑盒，提取舞毒蛾 3齡幼蟲(chóng)總 RNA。經(jīng) DNase I（Promega）消化去除DNA，紫外分光光度計(jì)和1.0%凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。取10 μg 總RNA用于合成第一鏈cDNA（TaKara反轉(zhuǎn)錄試劑盒），-20 ℃冰箱存儲(chǔ)，用于PCR擴(kuò)增模板。從轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中獲得編號(hào)為Unigene 27032的序列，對(duì)其進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)功能注釋結(jié)果查找獲得LdGSTe1基因。

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物L(fēng)dGSTe1-F （5'-CGGT GTATAAATTGAATGCTAGTC-3'）和LdGSTe1-R（5'-ATAGAGAAACGAATGAACCAGG-3'），以舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)總RNA合成的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行基因RT-PCR擴(kuò)增，測(cè)序驗(yàn)證LdGSTe1基因序列。25 μL RT-PCR擴(kuò)增體系：cDNA 0.5 μL、dNTP Mix 2 μL、10×Buffer 2.5 μL、LdGSTe1-F 1 μL、LdGSTe1-R 1 μL、rTaq 0.5 μL、ddH2O 17.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.0%凝膠檢測(cè)后，采用切膠回收試劑盒（Omega公司產(chǎn)品）回收目的片段，經(jīng)pMD18-T連接、DH5α轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性單克隆菌落測(cè)序。

1.2.2舞毒蛾LdGSTe1基因的生物信息學(xué)分析

利用 NCBI ORF-Finder翻譯編碼蛋白氨基酸序列，并對(duì)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行分析。利用 ExPASy ProtParam對(duì)編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)進(jìn)行分析［17］。采用SignalP 4.1分析編碼蛋白信號(hào)肽。用在線工具NetPhos 2.0 Server對(duì)蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析［18］。用Conserved Domains在線工具對(duì)蛋白保守區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。用 Bioedit進(jìn)行多序列比對(duì)分析，用MEGA 6.0進(jìn)行發(fā)育樹(shù)構(gòu)建分析。利用 SWISS-MODEL自動(dòng)建模方式構(gòu)建三維模型［19-21］。

1.2.3舞毒蛾LdGSTe1基因的表達(dá)

采用點(diǎn)滴觸殺法對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)進(jìn)行致毒處理：用DMSO溶液將魚(yú)藤酮母液分別配制成4、10 mg/L的藥液，用微量點(diǎn)滴儀將稀釋液滴于舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)的前胸背板，每頭試蟲(chóng)點(diǎn)滴3 μL藥液，每組處理30頭試蟲(chóng)，對(duì)照組點(diǎn)滴DMSO溶液，分別于處理后12、24、36、48、60 h隨機(jī)收集5頭活潑試蟲(chóng)，提取總RNA，DNase I消去DNA，采用TaKara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃冰箱保存。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒為 KOD SYBR qPCR Mix （TOYOBO）。根據(jù)LdGSTe1基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物L(fēng)dGSTe1-qF（5'-TTGGGACAGTCACGCA ATAG-3'）和 LdGSTe1-qR（5'-CCAGCCATGGAGAT GTGAATAA-3'）；以舞毒蛾Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物為Action-qF（ATGTTAGTATGATCGAGCGTAT CG）和Action-qR（GCATGATCTGAGGAGCATCTT））。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，40循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，95 ℃變性15 s，進(jìn)行溶解曲線反應(yīng)。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用文獻(xiàn)［22］的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果與分析

2.1舞毒蛾LdGSTe1基因的克隆結(jié)果

對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得了 1個(gè)舞毒蛾 GST基因（轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中編號(hào)為Unigene 27032）的全長(zhǎng)cDNA序列。以舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)的cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)為單一條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，所得序列與預(yù)期基因的全長(zhǎng)cDNA序列大小一致。BLAST分析顯示其屬于GST家族Epsilon類(lèi)基因，故命名為L(zhǎng)dGSTe1。LdGSTe1基因開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)為651 bp，編碼216個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2舞毒蛾LdGSTe1基因的生物信息學(xué)

圖2　舞毒蛾LdGSTe1蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)Fig.2 Conserved domains of LdGSTe1 protein in L. dispar

ProtParam預(yù)測(cè)編碼蛋白基本理化特性，推測(cè)LdGSTe1分子式為C1101H1735N285O318S9，相對(duì)分子質(zhì)量為24 340，理論等電點(diǎn)為6.90，不穩(wěn)定系數(shù)（II）為28.10，為穩(wěn)定性蛋白，總平均疏水指數(shù)為-0.156，為親水性蛋白。TMpred和SignalP 4.1預(yù)測(cè)顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。PSORT Prediction預(yù)測(cè)該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。NetPhos 2.0 Server顯示，LdGSTe1蛋白含有4個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)及 4個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)。NCBI 的CDD對(duì)LdGSTe1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，LdGSTe1蛋白屬于GST家族蛋白（圖2），在第3～77位為保守的N端結(jié)構(gòu)域GST_N_Delta_Epsilon，在第91～207位為C端結(jié)構(gòu)域GST_C_Delta_Epsilon。

通過(guò)NCBI BLASTP對(duì)舞毒蛾LdGSTe1蛋白進(jìn)行在線比對(duì)，選出與其同源性較高（52%～58%）的其他昆蟲(chóng)的14種GST蛋白，并利用Bioedit進(jìn)行多序列比對(duì)分析。結(jié)果（圖3）顯示，LdGSTe1蛋白在進(jìn)化上高度保守，屬于GST家族 Epsilon蛋白，預(yù)測(cè)這些物種間存在共同起源。

圖3　舞毒蛾LdGSTe1蛋白與其他昆蟲(chóng)GST Epsilon蛋白的多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of LdGSTe1 with GST Epsilon proteins in other inserts

應(yīng)用SWISS-MODEL軟件，于PBD庫(kù)中尋找LdGSTe1蛋白的同源蛋白，構(gòu)建三維模型（圖4）。結(jié)果顯示，舞毒蛾LdGSTe1蛋白包含1個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域?yàn)楣入赘孰牡慕Y(jié)合區(qū)域，含有7個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊；C端為識(shí)別并結(jié)合底物區(qū)域，含有9個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊。α-螺旋和β-折疊是其主要結(jié)構(gòu)元件。

圖4　舞毒蛾LdGSTe1蛋白的三維結(jié)構(gòu)模擬Fig.4 Protein three-dimensional structure of LdGSTe1

利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，來(lái)研究昆蟲(chóng)間GST蛋白的進(jìn)化關(guān)系。圖5結(jié)果表明，Delta和Epsilon家族處于同一分支，再與Theta家族聚為一族；Omega和Zeta家族聚類(lèi)在一起，再與Delta、Epsilon及Theta家族聚為一族。Sigma家族與其他5個(gè)家族距離較遠(yuǎn)，獨(dú)立成族，這與張學(xué)堯等［23］對(duì)飛蝗 LmGST的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致。LdGSTe1與家蠶、稻縱卷葉螟中Epsilon家族GST聚為一族，因此推測(cè)該基因?qū)儆谖瓒径闓ST Epsilon家族。

圖5　舞毒蛾LdGSTe1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree analysis of LdGSTe1 protein in L. dispar

2.3魚(yú)藤酮脅迫對(duì)舞毒蛾LdGSTe1基因表達(dá)的影響

為研究植物源殺蟲(chóng)劑魚(yú)藤酮對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)LdGSTe1基因表達(dá)的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，分析LdGSTe1基因在質(zhì)量濃度分別為4.0、10.0 mg/L的魚(yú)藤酮處理不同時(shí)間后的表達(dá)差異，結(jié)果表明，在4.0 mg/L和10.0 mg/L的魚(yú)藤酮處理下，舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)LdGSTe1基因表達(dá)均先下降后上升。4.0 mg/L魚(yú)藤酮處理12、24、36、48 h，LdGSTe1基因表達(dá)量均下降，處理12 h基因表達(dá)量最低，為對(duì)照的11%；處理60 h，LdGSTe1基因表達(dá)量上升，為對(duì)照的3.81倍。10.0 mg/L的魚(yú)藤酮處理12、24、36 h，LdGSTe1基因表達(dá)量均下降，處理24 h時(shí)基因表達(dá)量最低，為對(duì)照的 9%；處理 48、60 h，LdGSTe1基因表達(dá)量上升，處理 60 h時(shí)LdGSTe1基因表達(dá)量最大，為對(duì)照的3.6倍。

圖6　魚(yú)藤酮處理的舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)LdGSTe1基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 LdGSTe1 gene expression in 3rdinstar larvae of L. dispar under rotenone stress

3　討論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析和RT-PCR擴(kuò)增，獲得1個(gè)舞毒蛾GST Epsilon家族基因，命名為L(zhǎng)dGSTe1，該基因編碼一個(gè)由216個(gè)氨基酸組成的多肽，這與已報(bào)道的鱗翅目昆蟲(chóng)煙夜蛾（Helicoverpa assulta）HaGSTe1編碼區(qū)推導(dǎo)表達(dá)217個(gè)氨基酸殘基［24］較為一致。煙夜蛾 HaGST 與其他物種 Epsilon 家族GSTs 結(jié)構(gòu)一樣，在 N端由 β-α-β-α-β-β-α的結(jié)構(gòu)基序組成，C端主要有5個(gè)α螺旋構(gòu)成，而舞毒蛾LdGSTe1蛋白N端結(jié)構(gòu)域含有4個(gè)β-折疊和7 個(gè)α-螺旋，C端含有9個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊，推測(cè)其結(jié)合的底物存在特異性。NCBI對(duì)LdGST蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，第3～77位為保守的N端結(jié)構(gòu)域GST_N_Delta_Epsilon，在第91～207位為C端結(jié)構(gòu)域GST_C_Delta_ Epsilon，同源氨基酸比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，舞毒蛾GST屬于Epsilon家族，這可能是由于Epsilon 亞族是從Delta 亞族進(jìn)化而來(lái)的緣故［5］。

昆蟲(chóng)GST家族中Delta和Epsilon家族已被證實(shí)參與昆蟲(chóng)抗藥性形成［7］。已有研究發(fā)現(xiàn)，雙翅目昆蟲(chóng)中埃及伊蚊 AaGSTe2和岡比亞按蚊 AgGSTe2 對(duì)DDT、有機(jī)磷農(nóng)藥和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥均具有代謝作用［25］；黑腹果蠅DmGSTe6和DmGSTe7基因?qū)谆鶎?duì)硫磷具有代謝作用［26］；鱗翅目昆蟲(chóng)中家蠶GST Epsilon家族具有過(guò)氧化酶活性和抗氧化壓力的功能［27-28］。研究［29］表明，GSTs 參與抗藥性的機(jī)制是由于其表達(dá)量的提高。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)經(jīng)魚(yú)藤酮觸殺后，LdGSTe1基因相對(duì)表達(dá)量在后期出現(xiàn)上升，推測(cè)其過(guò)量表達(dá)參與了解毒反應(yīng)。

［1］ Qin G H，Jia M，Liu T，et al．Heterologous expression and characterization of a sigma glutathione S-transferase involved in carbaryl detoxification from oriental migratory locust，Losusta migratoria manilensis（Meyen）［J］. J Insect Physiol，2012，58（2）：220-227．

［2］ Sheehan D，Meade G，F(xiàn)oley V M，et al．Structure，function and evolution of glutathione transferases：implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily［J］．Biochem J，2001，360：1-16．

［3］ Li X，Schuler M A，Berenbaum M R．Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics［J］．Annu Rev Entomol， 2007，52：231-253．

［4］ Chelvanayagam G，Parker M W，Board P G．Fly fishing for GSTs：a unified nomenelature for mammalian and insect glutathione transferases［J］．Chem Biol Interact，2001，133：256 - 260．

［5］ Robert F．Genomic organization of the glutathione S-transferase family in insects［J］．Mol Phylogen Evol，2011，61（3）：924 - 932．

［6］ Enayati A A，Ranson H，Hemingway J．Insert glutathione transferases and insecticide resisirance［J］．Insect Mol Biol，2005，14（1）：3-8．

［7］ Yang M L，Zhang J Z，Zhu K Y，et al. Mechanisms of organophosphate resistance in a field population of oriental migratory locust，Locusta manilensis （Meyen） ［J］. Arch Insect Biochem Physiol，2009，71（1）：3-15．

［8］ Ranson H，Rossiter L，Ortelli F，et al．Identification of a novel class of insert glutathione S-transferases involved in resistance to DTT in the malaria vector Anopheles gambiae［J］．Biochem J，2001，359（Pt 2）：295-304．

［9］ Syvanen M，Zhou Z H，Wang J Y．Glutathione transferase gene family from the housefly Musca domestica［J］．Mol Gen Genet，1994，245（1）：25-31．

［10］ Rauch N，Nauen R．Characterization and molecule cloning of a glutathione S-transferase from the whitefly Bemisia tabaci（Hemiptera：Aleyrodidae）［J］．Insect Biochem Mol Biol，2004，34（4）：321-329．

［11］ Lazarevic J，Peric V，Ivanovic J，et al．Host plant effects on the genetic variation and correlations in the individual performance of the gypsy moth ［J］．Funct Ecol，1998，12（1）：141-148．

［12］ 曹傳旺，孫麗麗，問(wèn)榮榮，等．舞毒蛾LdOA1基因克隆分析及對(duì)3種殺蟲(chóng)劑脅迫的響應(yīng)［J］．林業(yè)科學(xué)，2014，50（8）：102-106．

［13］ Toung Y P，Hsieh T S，Tu C P．The glutsthione S-transferase D genes．A divergently organized，intronless gene family in Drosophila melanogaster［J］．J Biol Chem，1993，268（13）：9737-9746．

［14］ Prapanthadara L，Ranson H，Somboon P，et al．Cloning，expression and characterization of an insert class I glutathione S-transferase from Anopheles dirus spscies B［J］．Insect Biochem Mol Biol，1988，28（5/6）：321-329．

［15］ Sonoda S，Ashfaq M，Tsumuki H．Genomic organization and developmental expression of glutathione S-transferase genes of the diamondback moth，Plutella xylostella［J］．J Insect Sci，2006，6：1-9．

［16］ Valles S M，Perera O P，Strong C A．Purification，biochemical characterization，and cDNA cloning of a glutathione S-transferase from the red imported fire ant，Solenopsis invicta［J］．Insect Biochem Mol Biol，2003，33（10）：981-988．

［17］ Walker J M．The proteomic protocols handbook［M］．New York：Humana Press，2005．

［18］ Blom N，Gammeltoft S，Brunak S．Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites［J］．J Mol Biol，1999，294（5）：1351-1362．

［19］ Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al．The SWISS-MODEL Workspace：a web-based environment for protein structure homology modelling［J］．J Bioinformatics，2006，22（2）：195-201．

［20］ Bordoli L，Schwede T．The SWISS-MODEL Repository and associated resources［J］．J Nucleic Acids Research，2009，37：387-392．

［21］ Peitsch M C．Protein modeling by E-mail［J］．J Bio/ Technology，1995，13：658-660．

［22］ Pfaffl M W，Horgan G W，Dempfle．Relative expression software tool（REST） for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR［J］．Nucleic Acids Research，2002，30（9）：e36．

［23］ 張學(xué)堯，王建新，郭艷瓊，等．飛蝗谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因克隆、序列分析及表達(dá)特征［J］．昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2012，55（5）：520-526．

［24］ 楊新影，李亮，安世恒，等．煙夜蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、序列分析與表達(dá)［J］．昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，54（6）：648-656．

［25］ Ortelli F，Rossiter L C，Vontas J，et al．Heterologous expression of four glutathione transferase genes genetically linked to a major insecticide-resistance locus from the malaria vector A–nopheles gambiae ［J］. Biochemical Journal，2003，373：957-963．

［26］ Alias Z，Clark A G．Adult Drosophila melanogaster glutathione S-transferases：effects of acute treatment with methyl parathion［J］． Pesticide Biochemistry and Physiology，2010，98：94-98．

［27］ Yamamoto K，Aso Y，Yamada N C．Catalytic function of an Epsilon-class glutathion S-transferase of the silkworm［J］. Insect Molecular Biology，2013，22（5）：523-531．

［28］ Ma B，Chang F N．Purification and cloning of a delta class glutathione transferase displaying high peroxidase activity isolated from the German cockroach Blattella germanica［J］．FEBS Journal，2007，274：1793-1803．

［29］ Grant D F．Evolution of glutathione S-transferase subunits in culicidae and related nematocera：electrophoretic and immunological evidence for conservedenzyme structure and expression［J］. Insect Biochem，1991，21（4）：435-445．

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Cloning and functional analysis of GSTe1 gene from Lymantria dispar

Wen Rongrong， Wang Buyong， Ma Ling*
（School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Accroding to the transcriptome of the 3rdinstar larva of Lymantria dispar（L. dispar）， a Glutathione S-transferase gene was determined and obtained， which named LdGSTe1. The open reading frame （ORF） of LdGSTe1 was 651 bp encoding a protein of 216 amino acid residues. Sequence analysis showed that the amino acid sequences of LdGSTe1 protein contained two conserved domains， namely GST_C_Delta_Epsilon and GST_N_Delta_Epsilon，belonging to the thioredoxin-like superfamily and glutathione S-transferase superfamily. Phylogenetic tree analysis indicated that the LdGST belonged to GST Epsilon family. Protein structure showed LdGSTe1 contains an N-terminal and C-terminal， and organized mainly into α-helix and β-sheet. The expression of LdGSTe1 in 3rdinstar larvae L. Dispar under 4.0， 10.0 mg/L rotenone treatment was investigated using real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the expression of LdGSTe1 in L. dispar was first down-regulated and then up-regulated. Therefore， LdGSTe1 gene was speculated to participate in the detoxification response of L. dispar.

Lymantria dispar； Glutathione S-transferase gene； cloning； gene expression analysis

問(wèn)榮榮（1987—），女，山西大同人，博士研究生，主要從事森林害蟲(chóng)防治研究，wenrongrong87@163.com；*通信作者，馬玲，博士，教授，主要從事昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)研究，maling63@163.com

S763.42；Q785

A

1007-1032（2016）04-0386-07

2015-12-13 修回日期：2016-04-05

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102701）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZD201404）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)（2572016AA09）