青梗菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究

方 輝，胡錦彬，薄永明

（寧波微萌種業(yè)有限公司，浙江 寧波 31500）

青梗菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究

方 輝，胡錦彬，薄永明*

（寧波微萌種業(yè)有限公司，浙江 寧波 31500）

以15份不同基因型的青梗菜雜交種為試材進行游離小孢子培養(yǎng)，探討花蕾長度和供體植株基因型對青梗菜小孢子培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，青梗菜小孢子培養(yǎng)的適宜花蕾長度為2.0～3.0 mm，基因型是影響青梗菜小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。共獲得138株小孢子植株，經(jīng)流式細胞儀鑒定，其中64.7%為二倍體植株，基本建立了利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)制青梗菜D H系的技術(shù)體系。

青梗菜；小孢子培養(yǎng)；基因型

文獻著錄格式：方輝，胡錦彬，薄永明.青梗菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（1）：76-79.

青梗菜是小白菜（Brassica raPa L.ssp. chinensis L.Kitamur）中一類束腰、葉色亮綠、品質(zhì)優(yōu)良的品種，屬異花授粉作物，雜種優(yōu)勢明顯。近年來，隨著游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用該技術(shù)輔助傳統(tǒng)育種可提高育種效率，縮短育種周期［1］，已有研究在小白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)上取得較大進展［2-5］。但游離小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生頻率及基因型的反應范圍存在很大差異，限制了該技術(shù)在遺傳育種和基礎(chǔ)研究上的進一步應用。本研究以15份不同基因型的青梗菜為試材進行游離小孢子培養(yǎng)，對培養(yǎng)過程中影響胚狀體產(chǎn)生頻率的幾個關(guān)鍵因素進行探討，為進一步完善青梗菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為15份不同基因型的青梗菜雜種1 代（表1），均為市場主流品種，由寧波微萌種業(yè)有限公司引進。2014年9月播種，10月定植于大田，常規(guī)管理并調(diào)查其農(nóng)藝性狀。12月底，每個品種各選10棵健壯植株移栽于單棟大棚越冬。2月底至4月中旬取適宜花蕾進行游離小孢子培養(yǎng)。

表1 供試青梗菜材料的名稱及來源

1.2 游離小孢子的分離和培養(yǎng)

供試植株抽薹開花后，于晴天上午8：00—9：00取材，選擇適宜花蕾用于游離小孢子培養(yǎng)。用75%酒精消毒花蕾30 s，再用2%N a C 1 O振蕩消毒15 min，滅菌水清洗3次，每次1 min。將無菌花蕾置于50mL離心管，加5mL洗滌培養(yǎng)基（13% B 5液體），用玻璃棒輕搗釋放小孢子。懸浮液經(jīng)孔徑40 μ m的細胞過濾器過濾，收集濾液于50mL離心管中，800 r·min-1離心5 min；棄上清，沉淀物用5mL洗滌培養(yǎng)基重懸，800 r·min-1離心3 min；棄上清，純化后小孢子加入胚狀體誘導培養(yǎng)基（13%N L N液體），用血球計數(shù)板在顯微鏡下鏡檢，并調(diào)節(jié)小孢子密度至1萬個·m L-1，每皿5mL分裝到直徑6 cm的無菌培養(yǎng)皿中，封口膜封口。

將分裝好的小孢子懸浮液置于恒溫培養(yǎng)箱中進行32℃熱激誘導1 d后，轉(zhuǎn)入25℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)暗培養(yǎng)，直至肉眼可見胚狀體出現(xiàn)。出胚培養(yǎng)皿移至恒溫搖床，50 r·min-1，25℃暗培養(yǎng)。游離小孢子培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計出胚數(shù)目。待胚狀體長至3 mm大小時轉(zhuǎn)入胚狀體再生培養(yǎng)基（3%MS固體，2mg·L-16-B A，0.1mg·L-1I A A），再生苗誘導培養(yǎng)條件為溫度25℃，晝夜光周期16 h/8 h，光照強度1 500 1 x。期間將形成的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（3%MS固體，0.1mg·L-1I A A）中培養(yǎng)。將室外煉苗2 d的再生苗洗去培養(yǎng)基后移植到32穴穴盤，2周后定植于大棚，成活后取植株幼嫩葉片，利用流式細胞儀（B D A c c ur iC 6）檢測其倍性。

1.3 適宜小孢子培養(yǎng)的花蕾長度

以G P-1，G P-13，G P-15為試材，在生長健康的植株花序上選取不同長度的花蕾進行D P A I染色。選取2～3個花蕾置于1.5mL離心管中，加入100 μ L水，用塑料棒輕搗釋放小孢子，取上清滴加1～2滴DAPI染液，室溫暗處理染色15 min后制片，用熒光顯微鏡觀察、照相，并記錄處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子外部形態(tài)。培養(yǎng)中的小孢子于倒置顯微鏡下進行形態(tài)學觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子不同發(fā)育時期的DAPI染色觀察

青梗菜小孢子發(fā)育過程可分為四分體時期、單核期、雙核期、三核期。經(jīng)DAPI染色觀察，單核靠邊期的青梗菜小孢子細胞核位于細胞邊緣，靠近細胞壁，細胞近圓形，可看到3條萌發(fā)溝。雙核早期小孢子經(jīng)第1次有絲分裂在細胞內(nèi)形成1個營養(yǎng)核和1個生殖核。此時細胞的外部形態(tài)為圓形，萌發(fā)溝變淺。由DAPI染色結(jié)果可知，隨著小孢子不斷生長發(fā)育，其細胞體積不斷增大，由最先的三棱形細胞轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形細胞，最后變成橢圓形成熟小孢子。處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子可觀察到萌發(fā)溝，細胞近圓形或橢圓形，可作為單核靠邊期至雙核早期的細胞形態(tài)指標。

2.2 小孢子處于單核靠邊期至雙核早期所對應的花蕾長度

對于青梗菜，適于培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時期一般是單核靠邊期至雙核早期。而花蕾長度與小孢子的發(fā)育時期有明顯的對應關(guān)系。本研究將采集的G P-1，G P-13和G P-15花蕾混合，按照長度分類，可分為3個等級：（1）2.0～3.0 mm，（2）3.0～3.5 mm，（3）3.5～4.0 mm。鏡檢和DAPI染色觀察，依據(jù)單核靠邊期至雙核早期的小孢子細胞學特征，找出大部分小孢子處于該時期所對應的花蕾長度，即為適宜游離小孢子培養(yǎng)的花蕾長度。從DAPI染色結(jié)果可知，不同基因型青梗菜材料單核靠邊期所對應的花蕾長度均在2.0～3.0 mm。在實際應用中，可依據(jù)試驗結(jié)果，直接選取長度為2.0～3.0 mm的花蕾用于游離小孢子培養(yǎng)。

2.3 青梗菜小孢子培養(yǎng)過程中的細胞學觀

在小孢子培養(yǎng)過程中，用倒置顯微鏡觀察小孢子培養(yǎng)過程中各個發(fā)育時期的形態(tài)。經(jīng)24 h熱激處理后，部分小孢子明顯膨大成圓球形，直徑為原細胞的2～3倍（圖1中a）；3 d后，膨大的小孢子發(fā)生第1次分裂，除個別為不均等分裂外（圖1 中b），其余大部分為均等分裂（圖1中c）；7 d后可觀察到分裂多次的細胞團（圖1中d）；10～11 d后可觀察到球形胚和心形胚（圖1中 e，f）；第12～15天時可觀察到魚雷形胚和子葉形胚（圖1中g(shù)，h）。此外還發(fā)現(xiàn)不同基因型青梗菜的小孢子胚胎發(fā)生均具有不同步性，在同一個皿中可以觀察到不同形態(tài)胚狀體并存的現(xiàn)象（圖1中 i），因此在實際操作過程中，同一個培養(yǎng)皿中的胚狀體需要根據(jù)胚狀體發(fā)育情況分批次進行轉(zhuǎn)胚。

圖1 青梗菜小孢子離體發(fā)育過程

2.4 供體植株基因型對青梗菜小孢子胚發(fā)生能力的影響

由表2可見，供試的15份青梗菜中有10份誘導出胚，其中G P-2，G P-4，G P-15出胚率相對較高，達1.04，0.87和0.89胚·蕾-1，其余7份出胚材料的出胚率較低，在0.5胚·蕾-1上下。由此可見，不同基因型的青梗菜小孢子胚胎發(fā)生能力有很大差異，在相同培養(yǎng)條件下，基因型是影響青梗菜小孢子培養(yǎng)成功與否的重要因素。

表2 不同基因型青梗菜誘導形成胚狀體結(jié)果

2.5 青梗菜小孢子胚狀體的繼代培養(yǎng)

將培養(yǎng)25 d后的胚狀體轉(zhuǎn)接到胚狀體再生培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待胚狀體萌發(fā)分化后，將再生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，大部分的子葉形胚均能正常發(fā)育、分化，最后形成健全植株（圖2），而球形、心形和魚雷形胚狀體分化困難甚至褐化死亡。這表明幼期胚狀體不易誘導成苗，子葉形胚易進行繼代培養(yǎng)，還需要進一步探索繼代培養(yǎng)中各條件對胚狀體發(fā)育及分化的影響，以優(yōu)化青梗菜胚狀體繼代培養(yǎng)條件，進而提高青梗菜游離小孢子培養(yǎng)效率。

2.6 再生植株倍性檢測

通過流式細胞儀對獲得的再生植株進行倍性測定，以正常二倍體青梗菜植株為對照。測定的138份材料中，單倍體材料占17.6%，四倍體材料占11.8，嵌合體占5.9%，二倍體材料占64.7%，這說明青梗菜小孢子培養(yǎng)過程中發(fā)生了自然加倍現(xiàn)象，且加倍頻率較高，另外本研究中嵌合體的出現(xiàn)頻率相對較高，這可能與部分材料多次繼代培養(yǎng)有一定的關(guān)系。

圖2 青梗菜小孢子胚狀體的萌發(fā)與植株再生

3 小結(jié)與討論

在游離小孢子培養(yǎng)中，小孢子發(fā)育時期與胚誘導成功率密切相關(guān)，因此選擇合適發(fā)育時期的小孢子尤為重要。前期研究表明，青梗菜小孢子適宜取材時期為單核靠邊期至雙核早期。本研究采用D P A I染色方法，確定了單核靠邊期至雙核早期的細胞形態(tài)；對不同長度花蕾小孢子進行顯微觀察，明確了處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子所對應的花蕾長度。3條萌發(fā)溝是該時期小孢子最為明顯的細胞形態(tài)學特征，可作為此發(fā)育時期的形態(tài)學標志。本研究表明，青梗菜用于小孢子培養(yǎng)的適宜花蕾長度一般為2.0～3.0 mm，但在實際應用中，受供體植株生長環(huán)境及植株狀態(tài)影響，還需根據(jù)情況確定適宜長度的花蕾進行游離小孢子培養(yǎng)。

目前，小孢子培養(yǎng)技術(shù)在不同作物育種中已經(jīng)廣泛應用。在探討大白菜［6］、甘藍［7］、花椰菜［8］、蘿卜［9］等小孢子培養(yǎng)因素的研究中，基因型是決定游離小孢子培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素。在本研究中，基因型仍是影響青梗菜小孢子培養(yǎng)的重要因素，且不同基因型青梗菜的小孢子胚發(fā)生能力有很大差異，能否通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來克服基因型對青梗菜小孢子培養(yǎng)的限制，還需進一步的試驗驗證。本研究對再生植株的倍性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)自然加倍率達到64.7%，其余為單倍體、嵌合體及四倍體材料，這與C he n等［10］研究結(jié)果大體一致。自然加倍省去了復雜繁瑣的人工加倍，為純合二倍體植株的創(chuàng)制與利用提供了便利，但如何利用同時獲得的單倍體及四倍體材料，還需進一步試驗探究。

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（責任編輯：張瑞麟）

S634

A

0528-9017（2016）01-0076-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160129

2015-11-05

寧波市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目（2014C 10007）

方 輝（1988-），男，浙江寧波人，碩士，從事蔬菜育種工作，E-mai1：fangwurs@126.com。

薄永明，E-mai1：boyongming2@vip.sina.com。