油菜種子種皮的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁成分研究

文婷婷，利 站，林 程，黃玉韜，關(guān)亞靜，胡 晉*

（1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)中心，浙江 杭州 310058；2.山東省種子管理總站，山東濟(jì)南 250100）

油菜種子種皮的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁成分研究

文婷婷1，2，利 站1，林 程1，黃玉韜1，關(guān)亞靜1，胡 晉1*

（1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)中心，浙江 杭州 310058；2.山東省種子管理總站，山東濟(jì)南 250100）

為探索油菜種皮的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁成分，借助掃描電鏡和倒置生物顯微鏡對(duì)種皮表面和橫斷面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并采用顯微化學(xué)鑒別法和紅外光譜分析法鑒定種皮細(xì)胞壁成分。結(jié)果表明，油菜種皮表面紋飾為網(wǎng)-穴型，網(wǎng)眼由不規(guī)則的管狀多邊形組成；種皮橫斷面結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次為表皮層、柵欄層和糊粉層；靠近種臍處種皮內(nèi)有白色薄膜，柵欄層和糊粉層結(jié)構(gòu)均逐漸變窄直至消失，種臍處種皮由兩層致密結(jié)構(gòu)組成。油菜品種浙雙3號(hào)的種皮細(xì)胞壁中含有纖維素、木質(zhì)素、色素、角質(zhì)、蛋白質(zhì)、果膠和脂類等成分。

油菜；種皮結(jié)構(gòu)；細(xì)胞壁成分

文獻(xiàn)著錄格式：文婷婷，利站，林程，等.油菜種子種皮的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁成分研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（1）：22-25.

油菜是世界四大油料作物之一，在世界油料作物中占有重要地位，也是我國(guó)重要的食用油來源和植物蛋白質(zhì)飼料資源［1］。種皮是種子胚胎與外界環(huán)境間的重要生物屏障，在保護(hù)胚胎免受各種生物和非生物逆境危害方面具有重要的意義［2］。此外，種皮在調(diào)控胚胎發(fā)育、種子休眠和萌發(fā)、種子品質(zhì)等方面也起著重要的作用。油菜種皮占全籽的12%～19%，種皮中含有粗蛋白質(zhì) 18% ～20%，粗脂肪16%，粗纖維31%～34%，菜籽中大部分色素、芥子堿和單寧等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)也主要存在于種皮中，因此，種皮是影響油菜籽餅粕蛋白質(zhì)利用價(jià)值的重要因素［3］。研究油菜種皮的結(jié)構(gòu)和成分，對(duì)種子吸水萌發(fā)、貯藏以及種子處理等具有重要的作用。然而當(dāng)前對(duì)油菜種皮結(jié)構(gòu)和成分的研究尚未見報(bào)道，本文應(yīng)用掃描電鏡和冷凍切片觀察種皮結(jié)構(gòu)，顯微化學(xué)鑒別法和紅外光譜分析法鑒定種皮細(xì)胞壁成分，以期為油菜種子的萌發(fā)、休眠特性的研究，油菜種質(zhì)資源貯藏以及油菜籽的綜合利用等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用油菜種子（浙雙3號(hào)）為材料，于4℃冰箱貯藏備用。

1.2 方法

1.2.1 掃描電鏡觀察種皮結(jié)構(gòu)

掃描電鏡觀察種皮結(jié)構(gòu)前的種子預(yù)處理參考劉強(qiáng)等［4］的方法，種子用0.1 m o 1·L-1pH值6.9的磷酸緩沖液（PBS）浸泡12 h，接著在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜，倒掉固定液，用0.1 m o 1·L-1P B S漂洗樣品3次，每次15 min。將種皮剝離，橫切種臍，用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h，倒掉固定液，用0.1 m o 1·L-1P B S漂洗樣品3次，每次 15 min。用 50%，70%，80%，90%，95%的乙醇溶液對(duì)樣品依次進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100%的乙醇處理兩次，每次20 min，接著用乙醇與醋酸異戊酯的混合液（V∶V為1∶1）處理樣品30 min后，用純醋酸異戊酯處理樣品過夜。將樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，離子濺射鍍膜，掃描式電子顯微鏡（X L 30-E SE M，荷蘭飛利浦公司）觀察，拍照。

1.2.2 冷凍切片觀察種皮色素分布

將油菜干燥種子的種皮剝離下來，利用冰凍切片機(jī)（Shandon FE+Shandon Finnesse32，美國(guó) Thermo公司）在-25℃下冰凍切片，厚度7μ m。切片不經(jīng)染色，直接制成水裝片，于倒置生物顯微鏡（Leica DMIRB，德國(guó)Leica公司）下觀察，并用附帶的成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 顯微化學(xué)鑒別法鑒定種皮細(xì)胞壁成分

顯微化學(xué)鑒別法鑒定種皮細(xì)胞壁成分參考劉軍等［5］的方法，取種子種皮分別在碘-氯化鋅溶液、鹽酸間苯三酚試劑和蘇丹Ⅳ酒精飽和溶液中染色，觀察種皮橫斷面染色結(jié)果。

1.2.4 紅外光譜分析法鑒定種皮細(xì)胞壁成分

取種子種皮，液氮研磨成粉末狀，用于紅外光譜掃描觀察。紅外光譜儀（AVATAR370型，美國(guó)Thermo Nico1et公司），光譜分辨率4 cm-1，掃描信號(hào)累加32次。參照謝晶曦［6］、徐榮等［7］和張曉斌等［8］的分析方法對(duì)細(xì)胞壁成分進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜種皮表面和橫斷面結(jié)構(gòu)

在掃描電鏡下觀察到，油菜種皮表面紋飾為網(wǎng)-穴型，網(wǎng)眼由不規(guī)則的管狀多邊形組成，網(wǎng)眼的大小和深淺各不相同（圖1中a）。種臍部表面與非種臍部表面紋飾不同，種臍部表面紋理粗糙、不規(guī)整（圖1中b）。種子遇水后，表皮層細(xì)胞中的黏質(zhì)分泌出來，在種皮表面形成透明的黏質(zhì)層（圖1中c）。

油菜種皮橫斷面可分為三層結(jié)構(gòu)（圖1中d）：最外覆蓋的一薄層為表皮層。表皮層下面是柵欄層，為U形-a（U-shaped-a）狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)較致密，但有縫隙，該層厚度為25.9～38.5 μ m。第三層為糊粉層，厚度為22.7～27.8 μ m。柵欄層、糊粉層厚度分別約占種皮總厚度的56%和44%。

靠近種臍處，種皮內(nèi)有白色薄膜（圖1中e）。柵欄層和糊粉層結(jié)構(gòu)均逐漸變窄，直至消失。種臍處由兩層致密結(jié)構(gòu)組成，厚度分別為 37.1～47.5 μ m和 7.6～15.2 μ m，各占種皮總厚度的79%和21%，兩層結(jié)構(gòu)間有一條縫隙。

圖1 油菜種子種皮表面及橫斷面掃描的電鏡照片

2.2 油菜種皮色素分布

不經(jīng)染色，直接在顯微鏡下觀察冰凍切片，可以清晰地看到油菜種皮的三層橫斷面結(jié)構(gòu)，分別為表皮層、柵欄層以及糊粉層（圖2）。其中，種皮色素即為圖中的棕色帶，主要分布在柵欄層。

2.3 顯微化學(xué)鑒別法鑒定種皮細(xì)胞壁成分

油菜種皮橫斷面結(jié)構(gòu)經(jīng)碘-氯化鋅溶液染色呈棕色，鹽酸和間苯三酚反應(yīng)染成桃紅色，蘇丹Ⅳ酒精飽和溶液染色呈紫紅色。由此可推測(cè)油菜種皮細(xì)胞壁中含有較多的纖維素、木質(zhì)素和角質(zhì)。

2.4 紅外光譜分析法鑒定種皮細(xì)胞壁成分

傅立葉變換紅外光譜（FTIR）圖中2 925.33 和2 853.78 cm-1附近是飽和C—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收，主要來自細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)、纖維素和果膠等組織成分（圖3）。1 746.19 cm-1為脂類中飽和羧酸酯鍵中羧基C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰。1 651.36 cm-1附近為細(xì)胞壁蛋白質(zhì)上的C=O（酰胺Ⅰ帶）。1 538.61 cm-1附近為蛋白質(zhì)上N—H特征吸收峰（酰胺Ⅱ帶）。1 056.10 cm-1附近主要為纖維素糖鏈中 C—C和 C—O鍵的吸收峰，1 455.33和1 384.29 cm-1附近為纖維素中甲基的伸縮振動(dòng)吸收峰。由此可知，油菜種皮中主要含有纖維素、果膠、蛋白質(zhì)和脂類等成分。

圖2 油菜種子種皮的色素分布

圖3 油菜種皮的紅外光譜

3 小結(jié)與討論

3.1 油菜種皮結(jié)構(gòu)

種皮是由珠被發(fā)育而來的套被狀結(jié)構(gòu)，包圍在胚和胚乳之外，是種子的重要組成部分之一，具有保護(hù)種胚和促進(jìn)萌發(fā)時(shí)吸收水分的作用［9］。種皮是植物體保守性較強(qiáng)的器官，其形態(tài)性狀和解剖構(gòu)造在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過程中形成，是受基因控制的穩(wěn)定性狀，受環(huán)境影響較小，因此可以作為分類的重要依據(jù)［10］。

不同物種植物的種皮紋飾亞微結(jié)構(gòu)特征存在種的特異性［11］，表明種皮紋飾特征是穩(wěn)定可遺傳的，可用作物種鑒定指標(biāo)，為分析不同物種的進(jìn)化及親緣關(guān)系提供了可行的方法［12］。有學(xué)者認(rèn)為種皮紋飾由柵欄層高度不平衡或柵欄層外壁突出而引起。本研究發(fā)現(xiàn)，油菜種皮表面紋飾呈現(xiàn)出中央下陷的網(wǎng)-穴狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)眼由不規(guī)則的管狀多邊形組成，可能有利于種子吸水。種子遇水后，表皮層細(xì)胞中的黏液分泌出來，迅速擴(kuò)大、破裂，包圍整個(gè)種子表皮細(xì)胞的外層細(xì)胞壁，有助于種子水化和種子傳播，促進(jìn)種子在缺水條件下萌發(fā)和形成幼苗。

掃描電鏡和顯微鏡下觀察到油菜種皮結(jié)構(gòu)由表皮層、柵欄層和糊粉層組成，且色素主要分布在柵欄層。柵欄層由外珠被的最內(nèi)層細(xì)胞發(fā)育而來［13］，其致密的結(jié)構(gòu)阻礙種子對(duì)水分的吸收。陳玉萍等［14］認(rèn)為種皮顏色主要由柵欄層決定，并認(rèn)為柵欄層斑點(diǎn)上的色素可能是由糊粉層上的色素轉(zhuǎn)移而來。

靠近種臍處，種皮內(nèi)有白色薄膜，柵欄層和糊粉層結(jié)構(gòu)均逐漸變窄，直至消失。種臍處由兩層致密結(jié)構(gòu)組成，厚度分別為37.1～47.5 μ m和7.6～15.2 μ m，各占種皮總厚度的79%和21%，兩層結(jié)構(gòu)間有一條縫隙。油菜種臍處的特殊結(jié)構(gòu)可能與種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和種子萌發(fā)時(shí)的水分運(yùn)輸有關(guān)。

3.2 油菜種皮細(xì)胞壁成分

種皮合成一系列化合物，在種子抗病蟲害、發(fā)育調(diào)控方面起重要作用，也可作為工業(yè)產(chǎn)品的原料，食品與飼料的營(yíng)養(yǎng)成分。此外，種皮成分對(duì)植物的整體質(zhì)量、價(jià)值和產(chǎn)量也產(chǎn)生影響。油菜種皮成分復(fù)雜，含有水、蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素、色素等［15］。

由顯微化學(xué)鑒別法和紅外光譜分析法鑒定表明，本研究油菜品種的種皮細(xì)胞壁中含有纖維素、木質(zhì)素、色素、角質(zhì)、蛋白質(zhì)、果膠和脂類等。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，牢固的纖維素結(jié)構(gòu)使細(xì)胞壁具有高強(qiáng)度和抗化學(xué)降解的能力［16］。孫群等［17］通過測(cè)定硬實(shí)種子和非硬實(shí)種子種皮粉末中粗纖維含量的差異，認(rèn)為粗纖維的大量積累增加了種皮的機(jī)械強(qiáng)度和不透水性。相關(guān)性分析表明：種皮厚度與種皮纖維素含量呈極顯著正相關(guān)，與千粒重呈極顯著負(fù)相關(guān)，即種皮厚，種皮纖維素含量高，千粒重小［18］。木質(zhì)素使細(xì)胞相連，可增加細(xì)胞壁的抗壓強(qiáng)度，強(qiáng)化植物組織，其含量可能與皮殼率成正相關(guān)關(guān)系，影響著種皮的厚度及堅(jiān)硬度［19］。此外，木質(zhì)素可能也是產(chǎn)生油菜種皮顏色的物質(zhì)之一，具有天然的多酚類結(jié)構(gòu)，是由苯丙烷單元組成的聚合物，含有發(fā)色基及助色基，可與多種物質(zhì)結(jié)合而生成有色物質(zhì)，也可經(jīng)氧化生成醌類物質(zhì)而顯色［20］。有研究表明，種皮木質(zhì)素含量與油菜的含油量、蛋白質(zhì)含量等性狀也相關(guān)。種皮色素決定油菜籽顏色，同時(shí)色素物質(zhì)也作為信號(hào)分子和植物抗菌素參與逆境脅迫、種子休眠等生理過程［21］。Mar1es等［22］研究認(rèn)為，油菜種皮中的色素組成主要是原花色素，原花色素是一種類黃酮物質(zhì)，也稱為縮合單寧。角質(zhì)存在于種皮表皮層，是妨礙水分滲入種內(nèi)，造成種子硬實(shí)的重要原因之一［23］。油菜種子內(nèi)含有比較豐富的蛋白質(zhì)，具有負(fù)襯質(zhì)勢(shì)，對(duì)水分的吸引力很強(qiáng)，因此種子一遇水就會(huì)依靠其強(qiáng)大的吸脹作用而迅速吸水［24］。果膠是形成膠質(zhì)的主要物質(zhì)，其主要成分是鼠李半乳糖醛酸。果膠作為細(xì)胞間的中層起黏合作用，使相鄰的細(xì)胞黏合在一起，具有水溶性。

油菜種皮結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁成分的研究可為油菜種子萌發(fā)特性的分析和油菜種質(zhì)資源貯藏提供有利依據(jù)，但是各結(jié)構(gòu)及成分對(duì)種子吸水萌發(fā)和種子品質(zhì)產(chǎn)生的不同影響還需進(jìn)一步研究。

［1］曲存民，付福友，盧坤，等.不同環(huán)境中甘藍(lán)型油菜種皮木質(zhì)素含量的QTL定位［J］.作物學(xué)報(bào)，2011，37（8）：1398-1405.

［2］伍曉明，曾長(zhǎng)立，胡瓊，等.甘藍(lán)型油菜與野芥屬間體細(xì)胞融合雜種后代種皮紋飾亞微結(jié)構(gòu)研究［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2009，31（2）：122-126.

［3］羅晨曦，周建平，周春靈.油菜籽種皮混合發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27（11）：1363-1366.

［4］劉強(qiáng)，王平平，苗福，等.瀕危植物鄂爾多斯半日花種皮結(jié)構(gòu)的研究［J］.天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，23（3）：20-23.

［5］劉軍，盧萍.紅豆草和扁蓿豆種子種皮結(jié)構(gòu)的比較研究［J］.內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)漢文版），2005，34（3）：369-371.

［6］謝晶曦.紅外光譜在有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)中的應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，1987.

［7］徐榮，孫素琴，陳君，等.肉蓯蓉種子成分及活力的紅外光譜分析［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29（1）：97-101.

［8］張曉斌，劉鵬，李丹婷，等.鉻誘導(dǎo)植物根細(xì)胞壁化學(xué)成分變化的FTIR表征［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（5）：1067-1070.

［9］李正理，張新英.植物解剖學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，1983.

［10］孟秋峰，王毓洪，周煥興，等.園藝植物保守器官分類研究進(jìn)展［J］.長(zhǎng)江蔬菜，2008（10）：1-3.

［11］BUTH G M，ARA R，NARAYAN A.Seed and seed coat anstomy of some members of tribe Arabideae（ Brassicaceae）［J］.Phytomorpho1ogy，1987，37：341-348.

［12］韋存虛，李愛民，張永泰，等.白芥和甘藍(lán)型油菜屬間雜種后代種子結(jié)構(gòu)比較［J］.作物學(xué)報(bào)，2009，35（6）：1139-1145.

［13］陳寶元，孟金陵.甘藍(lán)型油菜種皮發(fā)育的初步觀察［J］.華中農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1984，3（2）：5-8.

［14］陳玉萍，劉后利.甘藍(lán)型油菜種子發(fā)育進(jìn)程中種皮顏色變化［J］.中國(guó)油料，1995，17（2）：1-3.

［15］唐志東，魯軍雄，袁玉輝.油菜種皮色素的研究進(jìn)展［J］.作物研究，2013，27（2）：197-202.

［16］王忠.植物生理學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：16-18.

［17］孫群.烏拉爾甘草種子硬實(shí)程度的無損鑒定與硬實(shí)形成機(jī)理研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［18］TANG Z L，LI J N，ZHANG X K.Genetic variation of ye11ow-seeded rapeseed 1ines（ Brassica naPus L.） from different genetic sources［J］.P1ant Breeding，1997，115：471-474.

［19］梁艷麗，梁穎，李加納，等.甘藍(lán)型黃、黑籽油菜種皮特性比較研究［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2002，24（4）：14-18.

［20］葛明裕.木材加工化學(xué)［M］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，1985：67-84.

［21］LOZOVAYA V V，LYGIN A V，ULANOV A V，et a1.Effect of temperature and soi1 moisture status during seed deve1opment on soybean seed isof1avone concentration and composition［J］.Crop Science，2005，45（5）：1934-1940.

［22］MARLES M A，RAY H，GMBER M Y.New perspectives on proanthocyanidin biochemistry and mo1ecu1ar regu1ation［J］.Phytochemistry，2003，64：367-383.

［23］杜寶紅，石鳳翎，錫林塔娜，等.扁蓿豆種子發(fā)育形態(tài)解剖學(xué)研究［J］.種子，2007，26（6）：7-11.

［24］李合生.油菜種子萌發(fā)生理的研究［J］.植物生理學(xué)通訊，1981（4）：21-25.

（責(zé)任編輯：張 韻）

S634.3

A

0528-9017（2016）01-0022-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160109

2015-11-01

浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（Z 3100150）；浙江省科技廳旱糧農(nóng)業(yè)新品種選育專題（2012C 12902-6-5）

文婷婷（1989-），女，碩士，助理農(nóng)藝師，主要從事種子科學(xué)研究工作，E-mai1：wtt 250100@163.com。

胡 晉，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事種子科學(xué)研究工作，E-mai1：jhu@zju.edu.cn。