酒精對幼鼠海馬神經(jīng)組織發(fā)育及Kainate受體的影響☆

趙娟熊峰鮑美華張玉茜周少鴻曾杰李廣意李建明

論著

酒精對幼鼠海馬神經(jīng)組織發(fā)育及Kainate受體的影響☆

趙娟*熊峰*鮑美華*張玉茜*周少鴻*曾杰*李廣意*李建明*

目的探討酒精對幼鼠神經(jīng)組織發(fā)育及紅藻氨酸（kainate，KA）受體表達的影響。方法從小鼠P7齡開始，用20%酒精皮下注射法建立胎兒酒精系列紊亂（fetal alcohol spectrum disorder，F(xiàn)ASD）模型并以生理鹽水注射的幼鼠為對照組（酒精實驗組80只，對照組40只），兩組各每天測量體重，并觀察一般生物學(xué)特性，建模完成后進行Morrirs水迷宮行為學(xué)檢測。另取P7小鼠30只（酒精實驗組15只，對照組15只），皮下注射酒精和生理鹽水24h后取腦組織進行FJB染色。免疫熒光法檢測KA受體亞型KA1、KA2、GluR-6及GFAP的表達情況。結(jié)果注射3周后，與對照組相比，實驗組小鼠體重增長速度明顯降低（對照組21.13g±1.72g，實驗組13.96g±2.98g，P＜0.05）；Morrirs水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組較對照組逃避潛伏期時間明顯延長（對照組21.05s±5.31s，實驗組34.15s±3.26s，P＜0.05），穿越平臺次數(shù)也明顯減少（對照組2.70次±1.25次，實驗組0.93次±0.80次，F(xiàn)=2.505，P＜0.05）；GFAP熒光結(jié)果顯示實驗組小鼠從酒精注射7 d開始星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育發(fā)生異常；FJB結(jié)果顯示實驗組皮質(zhì)、海馬、丘腦都有神經(jīng)元細(xì)胞大量死亡；實驗組小鼠P14齡GluR-6和KA2亞型在海馬CA區(qū)表達有上調(diào)。結(jié)論海馬CA區(qū)KA受體GluR-6和KA2亞型可能與酒精影響的幼鼠海馬神經(jīng)組織發(fā)育有關(guān)。

酒精神經(jīng)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞KA受體

ZHAO Juan，XIONG Feng，BAO Meihua，ZHANG Yuqian，ZHOU Shaohong，ZENG Jie，LI Guangyi，LI Jianming.De?partment of Anatomy，Histology and Embryology，ChangshaMedical University，Changsha 410219.Tel：0731-88498021.

【Abstract】Objectives To investigate the effects of ethanol on neural development and kainate receptor expression in young mice.Methods Fetal alcohol spectrum disorder model was established by administration of 20%ethanol solu?tion to 7-day-old Kunming mice and control animals received physiological saline（The number of treatment and control were 80 and 40，respectively）.Body weight and general biological features were observed every day.Morris water maze was used to test learning and memory ability.Fluoro-Jade B was used to examine neural cells 24 hours after treatment in additional thirty 7-day-old Kunming mice which were further divided into two groups：a treatment group receiving 20% ethanol solution（n=15）and a control group receiving physiological saline（n=15）.The development of neural cells and expression levels of kainite receptors were examined by using immunofluorescence staining.Results The body weight was significantly lighter in treatment group than in control group（control：21.13±1.72g，treatment：13.96±2.98g，P＜0.05）.Morris test showed that model group had longer latency than control group to find hidden platform（control：21.05± 5.31s，treatment：34.15±3.26s，P＜0.05）.Spatial probe test revealed that the number of passing through the platform were significantly smaller in model group than in control group（control：2.70±1.25 times，treatment：0.93±0.80 times，P＜0.05）.Astrocyte development anomaly was evident after ethanol treatment for 7 days.The expression levels of kainite re?ceptor GluR-6 and KA2 were up-regulated in the CA region of the hippocampus after ethanol treatment for 7 days.Conclusion Kainite receptor GluR-6 and KA2 in CA region of the hippocampus may contribute to ethanol-induced hippo?campal neural development anomaly.

【Key Words】Ethanol Nerve cells Astroglia cells Kainate receptor

胎兒酒精系列紊亂（fetal alcohol spectrum dis?order，F(xiàn)ASD）是指酒精相關(guān)性胎兒發(fā)育障礙，如酒精相關(guān)性疾病、酒精相關(guān)性生理缺陷、酒精相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙等，包含胎兒和嬰幼兒酒精暴露所致的發(fā)育、生理、心理、行為和學(xué)習(xí)等方面的問題［1，2］。紅藻氨酸（kainate，KA）受體家族由5種不同亞基組成，分別是GluR5、GluR6、GluR7及親和力更高的KA1和KA2，這5種亞基分別由Grik1-5基因表達形成［3］。KA受體家族在神經(jīng)系統(tǒng)中有著廣泛分布，GluR5主要存在于背根節(jié)細(xì)胞、大腦扣帶皮質(zhì)及小腦的Purkinje細(xì)胞中；GluR6主要分布在海馬的齒狀回以及CA1區(qū)、CA3區(qū)、小腦顆粒細(xì)胞、紋狀體中，在大腦腦回神經(jīng)元的樹突等位置也有分布；GluR7在全腦都呈低水平表達；KA1幾乎只分布在海馬的CA3區(qū)；KA2則廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中［4］。KA受體是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，參與突觸傳遞過程［5］。另外，KA受體在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中也有著重要的作用［6］。有報道表明，KA受體在動物發(fā)育時期對樹突的生長有調(diào)節(jié)作用［7］。目前KA受體在神經(jīng)細(xì)胞興奮性中毒機制、神經(jīng)退行性疾病及精神疾病中有所研究［8］，但KA受體是否參與酒精影響的神經(jīng)發(fā)育中目前尚不明確。本文意在建立小鼠FASD模型，研究KA受體在小鼠神經(jīng)發(fā)育過程中的變化，并初步研究酒精對幼鼠神經(jīng)發(fā)育的影響及機制。

1材料與方法

1.1研究對象清潔級昆明小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供）置于12 h晝夜循環(huán)的恒溫（24℃）濕度（50%±5%）動物房內(nèi)喂養(yǎng)，按雌、雄鼠3：1合籠，每日8時檢查雌鼠是否有陰道栓確定受孕日期，定為妊娠開始，妊娠5d小鼠20只隨機平均分為對照組和實驗組。小鼠出生第1天稱為P0 （P=days postnatal，P0=the first 24hours after birth），在小鼠P7齡時，參照Ikonomidou C的方法建模［9］。

1.2動物模型制備先將56°紅星二鍋頭用生理鹽水稀釋成含20%酒精的溶液［10］，輕取P7齡小鼠稱量體重，用75%的酒精溶液擦拭小鼠背部，實驗組用二鍋頭稀釋成的含20%酒精的溶液按2.5g/kg傾斜15°在幼鼠背處皮下注射，分兩次進行，兩次間隔2h；對照組則用生理鹽水代替按相同的方法處理［9］。

1.3一般情況檢查［11］每天測量小鼠體重變化情況，觀察其毛發(fā)、進食量、排尿量、排便量等一般營養(yǎng)狀態(tài)，并觀察是夠合并有腦血管意外等神經(jīng)系統(tǒng)損傷的表現(xiàn)，如：偏側(cè)肢體癱瘓、抽搐發(fā)作等。

1.4 Morris水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力酒精皮下注射21 d，即小鼠P28齡后，參照賴紅［12］的方法進行水迷宮實驗，經(jīng)過連續(xù)4d的訓(xùn)練后，撤掉隱藏的平臺，通過檢測記錄并分析小鼠的定位航行能力與空間探索能力（定位航行實驗的考察指標(biāo)為逃避潛伏期所用的時間，空間探索實驗檢測檢測指標(biāo)為小鼠60s內(nèi)穿越有效區(qū)域次數(shù)），用來判斷小鼠的學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力［13］。

1.5取材取兩組小鼠，2.5%三溴乙醇（16mL/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室灌注生理鹽水再灌注濃度為4%甲醛，取全腦放入4%多聚甲醛中后固定，置于4℃的冰箱固定過夜，次日置于30%蔗糖PBS溶液48 h，至腦沉底。將全腦在-30℃冷凍切片機切片，厚度為15μm。將切片保存在用多聚賴氨酸處理過的玻片上，為后續(xù)的熒光染色備用。

1.6 FJB染色檢測小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞死亡情況

另取P7齡小鼠30只，背部酒精皮下注射24h后，取腦冷凍切片，常規(guī)Fluoro-Jade B（FJB）染色［14］先用含1% NaOH的80%乙醇溶液浸泡2min，再放入0.06%高錳酸鉀溶液，恒溫?fù)u床20 min，最后使用0.000 4%FJB染色20 min。通過熒光顯微鏡進行觀察。

1.7免疫熒光檢測KA受體的表達和星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育將含KA1、KA2、GluR-5、GluR-6、GluR-7和GFAP的體積分?jǐn)?shù)為5%的小牛血清和0.3%Tri?ton-100的PBS溶液滴加在切片上，置于4℃中反應(yīng)過夜，次日經(jīng)PBS浸洗后，切片在相應(yīng)的熒光二抗里孵育2 h，然后在熒光顯微鏡下觀察檢測［15］。

2結(jié)果

2.1一般情況兩組共110只小鼠，經(jīng)過3周造模后共死亡28只.其中，實驗組幼鼠80只死亡25只（31.25%），無操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡；對照組小鼠40只死亡3只（7.5%），無操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡。實驗組由于酒精刺激作用，一直存在著注射困難，并于P21齡后出現(xiàn)毛發(fā)雜亂、無光澤、干枯等情況。P28齡后實驗組出現(xiàn)脫毛、倦怠、消瘦、精神萎靡不振（造模小鼠55只中有50只出現(xiàn)這類情況，占總數(shù)的91%）。經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析，不同處理時相之間小鼠體重存在差別（F= 391.628，P＜0.01）；不同處理的小鼠體重之間也存在差別（F=21.490，P＜0.01）；處理時相和不同處理之間也存在交互作用（F=24.204，P＜0.01）。與對照組相比，實驗組P14、P21、P28齡小鼠的體重明顯較輕（對照組：7.61g±1.29g，12.20g±2.14g，21.13g±1.72g；實驗組：6.21g±0.93g，8.41g±1.22g，13.96g±2.98g），兩組有顯著差異（P＜0.05），見表1。

2.2Morris水迷宮檢測記憶及學(xué)習(xí)能力在定位航行試驗中，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析，不同處理時相之間小鼠尋找平臺所需潛伏期存在差別（F=13.734，P＜0.01）；不同處理的小鼠尋找平臺所需潛伏期之間也存在差別（F=11.726，P＜0.01）；但處理時相和不同處理之間不存在交互作用（F= 1.708，P＞0.05）。兩組小鼠尋找平臺所需潛伏期均有隨著訓(xùn)練進程而下降的趨勢，但除了Day1（訓(xùn)練第一天）外，實驗組的潛伏期都要長于對照組，實驗組與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05）（Day2、Day3、Day4對照組的逃避潛伏期為：34.68s±8.89s、28.40s±4.54s、21.05s±5.31s；實驗組為49.15s±9.81s、42.75s±10.08s、34.15±3.26s），見表2。在空間探索實驗中，對照組小鼠的運動軌跡大多集中在有效區(qū)域象限，并停留搜索時間較長，跨越有效區(qū)域象限位置次數(shù)較多。而實驗組多沿池壁運動，運動軌跡隨機分布。實驗組小鼠穿越平臺的次數(shù)少于對照組小鼠（對照組：2.70次±1.25次；實驗組：0.93次± 0.80次），兩者有顯著差異（F=2.505，P＜0.05）。

2.3 FJB檢測細(xì)胞死亡FJB可與變性死亡的神經(jīng)元結(jié)合而產(chǎn)生綠色熒光。實驗組小鼠皮下注射酒精24h后，進行FJB染色，結(jié)果顯示在小鼠的整個腦區(qū)有大面積的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，以皮質(zhì)、海馬和丘腦下部尤為顯著，而對照組中僅有個別細(xì)胞發(fā)生死亡，應(yīng)為自然死亡（見圖1）。

2.4免疫熒光檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物膠原纖維酸性蛋白（gli?al fibral acidic protein，GFAP）免疫熒光結(jié)果顯示實驗組小鼠酒精皮下注射7 d后開始出現(xiàn)胞體瘦小，突起變細(xì)變短的現(xiàn)象，到皮下注射21 d后，實驗組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組，且細(xì)胞體積較小，突觸數(shù)量遠遠少于對照組（見圖2）。

表1　兩組小鼠體重（g）的變化比較

表2　Morris水迷宮測試各組小鼠逃避潛伏期（s）

2.5免疫熒光KA受體的表達差異KA受體幾種亞型KA1、KA2、GluR-6的免疫熒光（紅色）分析結(jié)果顯示：在連續(xù)注射生理鹽水7 d后的小鼠中，KA2的表達海馬在CA2和CA3區(qū)都有微量的表達（見圖3，N），GluR-6主要在CA3區(qū)有低表達（見圖3，V）。實驗組小鼠連續(xù)酒精注射7 d后，KA2 在CA2、CA3的表達明顯上升，而GluR-6在CA1、CA2、CA3區(qū)域都有明顯的表達增加。而KA1亞型則在實驗驗組和對照組都幾乎沒有表達。當(dāng)鼠齡至21 d后，對照組和實驗組在海馬區(qū)域，KA1、KA2、GluR-6均無表達。

3討論

圖1　皮下注射24h后，細(xì)胞凋亡情況。實驗組小鼠的皮質(zhì)、海馬和丘腦下部都出現(xiàn)了神經(jīng)元死亡的現(xiàn)象

圖2　星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。與對照組小鼠相比，實驗組小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量、突觸數(shù)量明顯較少

嬰幼兒時期酒精暴露會引起FASD，導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)育異常。酒精對發(fā)育中的神經(jīng)損傷表現(xiàn)的尤為突出，而在大腦中，以海馬、皮質(zhì)區(qū)域?qū)凭拿舾行宰罡撸?6］，在本實驗中，P7小鼠皮下酒精注射24 h后，其海馬、皮質(zhì)及丘腦下部都出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)元死亡，這說明海馬、皮質(zhì)及丘腦下部對酒精具有很高的敏感性。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之一，對神經(jīng)元具有營養(yǎng)支持作用，并能引導(dǎo)神經(jīng)元的定向遷移和分化成熟，既可以通過自興奮性及突觸傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)釋放化學(xué)遞質(zhì)與神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，也可以增加成熟突觸的數(shù)目和功能［17］。在本實驗中，對照組小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育正常，胞體大小正常，數(shù)量隨生長而大量增加，突觸也正常發(fā)育；而實驗組中從皮下注射7d后開始，GFAP表達降低，胞體瘦小、突起變細(xì)變短，這與于海艷［18］的結(jié)果相似。星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和突觸減少，會導(dǎo)致其連接支持神經(jīng)元功能降低，干擾神經(jīng)元分化成熟，導(dǎo)致神經(jīng)元功能發(fā)育異常。在水迷宮實驗中，模型組小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力明顯差于對照組，這可能是與酒精引發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常，間接影響海馬神經(jīng)元異常有關(guān)。因此，F(xiàn)ASD產(chǎn)生的原因之一可能是酒精導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常。

圖3　連續(xù)注射7d、14d、21d后KA受體表達變化。實驗組小鼠在注射酒精7d后KA受體KA2亞型在海馬CA2、CA3表達上調(diào)，GluR-6亞型在海馬CA1、CA2、CA3區(qū)域表達明顯上調(diào)。KA1亞型在實驗組和對照組均無表達

在本實驗中，新生小鼠在注射酒精的過程中出現(xiàn)了KA2、GluR6表達的上調(diào)的現(xiàn)象，這說明酒精對KA受體有調(diào)節(jié)作用。實驗證明GluR6是神經(jīng)系統(tǒng)中不可缺少的受體，它參與神經(jīng)元的可塑性，對學(xué)習(xí)和記憶有著重要的作用，同時還有調(diào)節(jié)突觸活動的功能［19-20］。酒精影響的神經(jīng)發(fā)育的其中一個機制是真核細(xì)胞翻譯起始因子-2α（eukary?otic initiation factor-2α，eIF2α）被磷酸化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成停止［21］，本實驗室早前的研究發(fā)現(xiàn)，KA受體表達上調(diào)與P-eIF2α（磷酸化的eIF2α）上調(diào)有顯著相關(guān)性［22］。本實驗的結(jié)果顯示，在連續(xù)皮下注射酒精7 d后，KA受體亞型KA2、GluR-6的表達明顯上升，同時海馬區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體開始變小，突觸變細(xì)變小，這提示我們KA受體的表達短時間增高，同時激發(fā)了下游信號通路，從而影響了突觸的形成，抑制了神經(jīng)元的發(fā)育。KA受體在酒精處理過程中出現(xiàn)增高表達的現(xiàn)象也可能是KA受體參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，使得從而使小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育也受到影響?？傊?，海馬CA3區(qū)KA受體GluR-6和KA2亞型在酒精影響小鼠神經(jīng)組織發(fā)育中發(fā)揮了一定的作用，但是具體的作用機制，還需要進一步的研究才能揭示。

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（責(zé)任編輯：甘章平）

The effects of ethanol on the hippocampal neural tissue development and kainite receptor expression in young

R651

Amouse.

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.05.001

☆湖南省高等學(xué)?！笆濉敝攸c建設(shè)學(xué)科專項建設(shè)項目（編號：湘教發(fā)［2011］76號）；湖南省自然科學(xué)基金（編號：2013JJ6010）；湖南省教育廳科研項目（編號：15C0152、15C0146）

*長沙醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎教研室（長沙410219）

（E-mail：ljming0901@sina.com）

2015-04-21）