人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白表達(dá)與宮頸病變程度相關(guān)性研究

高家良　陳文虎　孫愛華

315040 寧波市鄞州人民醫(yī)院(高家良)；310053 杭州，浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(陳文虎、孫愛華)

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人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白表達(dá)與宮頸病變程度相關(guān)性研究

高家良陳文虎孫愛華

315040 寧波市鄞州人民醫(yī)院(高家良)；310053 杭州，浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(陳文虎、孫愛華)

【摘要】目的探討人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染宮頸上皮細(xì)胞L1殼蛋白表達(dá)對宮頸病變的進(jìn)展及宮頸癌的發(fā)生的臨床意義。方法病例組共259例，根據(jù)液基薄層細(xì)胞檢測(TCT)結(jié)果不同分為未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性細(xì)胞(NILM)103例、非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)91例、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)36例、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)23例和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)6例。同時選擇50例健康體檢者作為對照組。分別用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測HPV 23種亞型和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測L1 殼蛋白表達(dá)。結(jié)果對照組PCR和L1殼蛋白表達(dá)結(jié)果均呈陰性。病例組NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC患者HPV感染率分別為23.3%、69.2%、83.3%、87.0%和100%，HPV-PCR陽性上述患者高危型HPV(HR-HPV)的構(gòu)成比分別為79.2%、92.1%、96.7%、100%和100%。NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC患者HPV L1 殼蛋白表達(dá)陽性率分別為25.2%、31.9%、63.8%、17.4%和0%。結(jié)論隨宮頸病變的進(jìn)展HPV感染率和HR-HPV構(gòu)成比升高，提示本地區(qū)HPV感染率和HR-HPV構(gòu)成比與宮頸上皮內(nèi)瘤變程度密切相關(guān)。L1殼蛋白檢測陽性率隨病變早期表達(dá)呈上升趨勢，晚期呈明顯下降，HPV L1殼蛋白的表達(dá)與宮頸病變程度有關(guān)，可以作為宮頸癌癌前病變的隨訪指標(biāo)。

【主題詞】乳頭狀瘤病毒，人；L1殼蛋白；免疫細(xì)胞化學(xué)；宮頸腫瘤

宮頸癌是臨床最常見的婦科惡性腫瘤之一，其形成前有一段較長時間的癌前病變期[1, 2]。文獻(xiàn)報道絕大多數(shù)宮頸低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)和部分高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)會自然消退，僅少數(shù)進(jìn)展到癌[3-5]。因此早期診斷便于采取針對性治療措施有利于降低宮頸癌的發(fā)生率[6]。人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)特別是高危型HPV(HR-HPV感染是是宮頸上皮癌變的重要危險因子素[2, 7,8]，L1蛋白為HPV感染復(fù)制早期的結(jié)構(gòu)蛋白，HPV不同感染期，宮頸上皮內(nèi)瘤變程度不同，L1蛋白表達(dá)存在差異[4-6]，提示檢測L1蛋白表達(dá)可預(yù)測宮頸病變嚴(yán)重程度。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HPVL1殼蛋白在不同宮頸病變脫落細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)，并對其臨床意義進(jìn)行了探討。

1資料與方法

1.1調(diào)查對象2013 年1月—2015年6月由寧波市鄞州人民醫(yī)院婦科采集的259例宮頸病變病例脫落細(xì)胞標(biāo)本作為病例組，年齡18～74歲，平均36±10歲。259例病例組患者參考國際癌癥協(xié)會推薦的TBS(2001)分類標(biāo)準(zhǔn)按宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)(TCT)檢查結(jié)果分為：未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性細(xì)胞(NILM)103例，非典型鱗狀細(xì)胞(ASC)91例、LSIL36例、HSIL23例和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)6例。對照組50例健康體檢者年齡20～60歲，平均31±7歲。研究通過寧波市鄞州市人民醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2標(biāo)本采集所需宮頸脫落上皮細(xì)胞標(biāo)本由婦科醫(yī)生按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范采集，檢測對象均留取兩份標(biāo)本，其中一份用于PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測HPV23種亞型，另一份用于免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測。如不能及時檢測可低溫保存。

1.3PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測PCR檢測試劑盒(深圳亞能公司生產(chǎn))，按試劑盒說明設(shè)置空白對照、陰性對照、陽性對照并判斷結(jié)果。l8個高危型：HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和MM4型；5個低危型包括HPV6、11、42、43和44型。

1.4HPVL1殼蛋白表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測L1 殼蛋白的表達(dá)，試劑盒(美國Advanced公司生產(chǎn))，按說明書操作。有1個脫落細(xì)胞的細(xì)胞核被染紅(病變細(xì)胞核)存在即為HPVL1殼蛋白陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HPV感染檢測與分型見表1。50例對照組標(biāo)本PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測結(jié)果全部陰性。病例組HPV陽性率為55.2%(143/259)HPV感染率明顯高于正常對照組(P<0.01)。病例組NILM、ASCUS、LSIL、HSIL和SCC患者HPV感染率分別為23.3%、69.2%、83.3%、87.0%和100%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示HPV感染率NILM患者明顯低于病變程度較重的其余各病例組(P<0.01)，ASCUS、LSIL、HSIL和SCC患者宮頸病變的級別提高和瘤變程度加重HPV感染率逐步增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)但。HPV陽性的NILM、ASCUS、LSIL、HSIL和SCC患者存在HR-HPV感染的病例，包括HR-HPV和LR+HR-HPV混合感染，NILM和ASCUS患者HR-HPV感染構(gòu)成比分別為79.2%和93.7%，而所有PCR檢測結(jié)果為陽性的LSIL、HSIL和SCC患者均存在高危型HPV感染。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)NILM患者HR-HPV感染率明顯低于其他病例組(P<0.05)。提示HR-HPV感染率與宮頸病變及宮頸上皮內(nèi)瘤變程度密切相關(guān)，對患者進(jìn)行HPV分型檢測可用來評估其患宮頸癌的風(fēng)險和為臨床提供一定診治依據(jù)。

2.2L1殼蛋白表達(dá)50例對照組標(biāo)本L1殼蛋白表達(dá)結(jié)果均呈陰性。病例組 82例標(biāo)本L1殼蛋白表達(dá)陽性，其中NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC患者L1殼蛋白表達(dá)陽性率分別為25.2%、31.9%、63.8%、17.4%和0.0%。NILM和ASC組患者間L1殼蛋白表達(dá)陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，LSIL組患者L1殼蛋白表達(dá)陽性率明顯高于其余各組(P<0.01)。NILM、ASCUS和LSIL患者L1殼蛋白表達(dá)陽性率提示病變早期陽性率逐步增高，而LSIL、HSIL和SCC患者L1殼蛋白表達(dá)陽性率變化則說明感染晚期L1殼蛋白表達(dá)陽性率呈現(xiàn)逐步降低，病變組特別是病變早期L1殼蛋白表達(dá)陽性率25.2%～63.8%不等，但對照組HPV-PCR和L1殼蛋白表達(dá)全部呈陰性，提示L1殼蛋白表達(dá)檢測能夠判斷HPV的復(fù)制狀態(tài)，還可以作為宮頸早期病變的診斷標(biāo)志。

表1　PCR檢測HPV感染結(jié)果

3討論

宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)生及發(fā)展與HPV感染密切相關(guān)。HPV清除則病變消退[4-6]。隨著熒光PCR檢測HPV技術(shù)的建立和成熟，已經(jīng)有越來越多的研究者利用HPV特別是HR-HPV檢測來輔助診斷宮頸病變[2, 8-9]。本研究50例正常體檢者HPV全部陰性，而NILM到SCC患者HPV感染率23.3%～100%，提示PCR檢測宮頸病變患者HPV感染特異性好。不同病變程度宮頸病變患者HPV感染率都明顯高于正常體檢者，且隨瘤變感染率逐步上升，HPVHR-HPV構(gòu)成比從NILM的79.2%到HSIL和SCC的100%，隨瘤變進(jìn)展HR-HPV構(gòu)成比逐步增高。證實(shí)HPV感染率和HR-HPV構(gòu)成比與宮頸瘤變程度密切相關(guān)。課題組先前的研究也提示熒光PCR檢測HPV不僅有高度特異性也有高度的靈敏度[2, 8]。

熒光PCR能用于檢測HPV感染，但不能檢測潛伏期，也不能區(qū)分HPV是否復(fù)制和整合，特別不能區(qū)別持續(xù)感染、亞臨床感染或者臨床相關(guān)感染，不能直觀比較病變細(xì)胞的形態(tài)變化[2, 4, 9]。文獻(xiàn)報道L1蛋白為HPV感染復(fù)制早期的結(jié)構(gòu)蛋白，L1殼蛋白有利于激發(fā)人體細(xì)胞免疫清除感染的細(xì)胞保護(hù)機(jī)體。宮頸癌時Ll殼蛋白表達(dá)率極低或不表達(dá)，而在宮頸良性病變時表達(dá)率較高[4-6,9]。本研究中，L1殼蛋白表達(dá)照組標(biāo)本全部陰性，而病例組標(biāo)本有25.2%～63.8%不等的陽性率，提示L1殼蛋白表達(dá)確實(shí)與HPV感染有關(guān)；另外分析不同病變期宮頸病變標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，從NILM發(fā)展LSIL，L1殼蛋白表達(dá)從25.2%增高到63.8%，提示L1殼蛋白表達(dá)能區(qū)分病毒潛伏和復(fù)制，病毒感染初期檢測L1蛋白表達(dá)可預(yù)測早期宮頸病非瘤性病變進(jìn)展。研究者認(rèn)為感染后期HPV整合到宿主DNA，隨宿主細(xì)胞分裂，L1殼蛋白表達(dá)下降甚至表達(dá)缺失[4-6, 10]，本研究發(fā)現(xiàn)LSIL、HSIL和SCC患者L1殼蛋白表達(dá)陽性率從63.8%、17.4%和0%，隨著進(jìn)展L1殼蛋白表達(dá)陽性率呈顯著下降，提示L1殼蛋白表達(dá)能區(qū)分病毒復(fù)制和整合，檢測L1蛋白表達(dá)可預(yù)測宮頸瘤變嚴(yán)重程度。

HPV感染后不同時期HPVL1殼蛋白的表達(dá)差異提示，利用L1殼蛋白的表達(dá)差異可預(yù)測宮頸上皮內(nèi)瘤變的生物學(xué)行為。因此L1殼蛋白可以作為診斷宮頸癌前病變的一個良好指標(biāo)。

4參考文獻(xiàn)

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通信作者：孫愛華，Email: sunah123@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.009

基金項(xiàng)目：浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目

(收稿日期：2015-10-18)

RelationshipresearchbetweenexpressionofHPVL1capsidproteinandcervicallesionsdegree

Gao Jialiang, Chen Wenhu, Sun Aihua

Yinzhou People’s Hospital, Ningbo 315040, China(Gao JL); Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China(Chen WH, Sun AH) Corresponding author: Sun Aihua, Email: sunah123@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical significance of the expression of Ll capsid protein in cervical lesion cells infected with human papillomavirus (HPV), for the prevention of cervical cancer and suggestion of progression and probability of potential lesions. Methods259 different levels of cervical lesion patients were patients group, including 103 cases negative for intraepithelial lesion and malignancy (NILM), 91 cases with atypical squamous cells of undetermined significance(ASCUS)，36 cases with low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), 23 cases with high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL), and 6 cases with squamous cell carcinoma (SCC). Cervical cell samples of 50 normal physical examination people were control group. Immunohistochemical staining for Ll capsid protein and PCR-based reverse blot hybridization for 23 HPV DNA were employed．ResultsBoth Ll capsid protein detection and PCR -based reverse blot hybridization detection were negative in the control group．The infection ratio of HPV were 23.3%, 69.2%, 83.3%, 87.0% and 100% in woman with NILM, ASCUS, LSIL, HSIL and SCC, respectively. The constituent ratio of high-risk HPV (HR-HPV)were 79.2%, 92.1%, 96.7%, 100% and 100% in HPV positive patients with NILM, ASCUS, LSIL, HSIL and SCC, respectively. The positive rates of HPV Ll capsid protein in NILM, ASCUS, LSIL, HSIL and SCC were 25.2%, 31.9%, 63.8%, 17.4% and 0.0%, respectively. ConclusionsBoth infection ratio of HPV and constituent ratio of HR-HPV were increased gradually with the aggravation of cervical lesions, and the infection ratio of HPV and constituent ratio of HR-HPV were closely related to the degree of cervical diseases. The detection results of Ll capsid protein were on the rise in the early phase of cervical lesion，however，declining in the late phase of cervical lesion, the expression of HPV Ll capsid protein associates with the degrees of cervical lesion, which may serve as an indicator of cervical precancerous lesions of the follow-up.

【Key words】Papillomavirus, human; Ll capsid protein; Immunohistochemical staining; Cervical cancerFund programs: Zhejiang Provincial Program for the Cultivation of High-level Innovative Health talents