單純皰疹病毒性角膜炎兔角膜表面溫度的改變與角膜損傷關(guān)系的研究

俞瑩　繆晚虹　趙芳　李菲菲

201203 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院

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單純皰疹病毒性角膜炎兔角膜表面溫度的改變與角膜損傷關(guān)系的研究

俞瑩繆晚虹趙芳李菲菲

201203 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院

【摘要】目的研究單純皰疹病毒性角膜炎兔角膜表面溫度的變化及其與角膜損傷的關(guān)系。方法采用HSV-1 KOS病毒株感染兔角膜建立單純皰疹病毒性角膜炎模型12只，對(duì)照組10只行單純角膜上皮劃開，不接種病毒。紅外線測溫儀檢測角膜溫度。造模后第1天、第3天、第7天、第14天觀察角膜上皮病變面積、角膜基質(zhì)混濁程度、新生血管生長情況并評(píng)分。結(jié)果測得單純皰疹病毒性角膜炎兔角膜溫度為31.14±1.12℃。造模后第1天、第3天、第7天、第14天角膜溫度皆高于對(duì)照組(P<0.01,P<0.05)。第3天、第7天、第14天角膜基質(zhì)明顯混濁，且第3天、第7天混濁程度與角膜表面溫度具有相關(guān)性(P<0.05)。第14天角膜新生血管明顯增多，與角膜表面溫度具有相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論單純皰疹病毒性角膜炎角膜表面溫度增高，且與角膜混濁程度、新生血管等角膜損傷表現(xiàn)有相關(guān)性。

【主題詞】單純皰疹病毒性角膜炎；角膜溫度；角膜損傷；實(shí)驗(yàn)研究

Fund programs: Shanghai Natural Science Foundation For Young Scholars(12ZR1450600); Three-year Plan of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (ZY3-JSFC-1-1019)

單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是常見的角膜感染性疾病，主要由于感染單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex viru-1，HSV-1)引起。病變的開始常由于病毒本身造成的組織損傷，但隨著疾病的進(jìn)展，免疫反應(yīng)為組織破壞的重要因素，臨床表現(xiàn)為角膜水腫及新生血管生成。角膜表面溫度在很多研究中被發(fā)現(xiàn)與眼表疾病甚至眼底疾病存在一定的相關(guān)性，且檢測手段方便可行，因而被越來越多應(yīng)用于臨床輔助診斷。作者在研究中發(fā)現(xiàn)病毒性角膜炎角膜表面溫度亦發(fā)生改變，并與角膜損傷程度有一定相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物和分組健康新西蘭大耳白兔25只[上海市松江區(qū)車墩養(yǎng)殖場，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0008]，經(jīng)裂隙燈檢查，排除眼部疾患。所有實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為病毒接種組15只，對(duì)照組10只。所有實(shí)驗(yàn)兔以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。

表1　HSK造模前后角膜溫度比較(℃)

1.2主要儀器佳信CA380 紅外線測溫儀(深圳市優(yōu)儀高電子科技有限公司)：測溫范圍：-32℃～380℃；精確度±1.5℃；響應(yīng)時(shí)間：500 ms。裂隙燈顯微鏡：蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號(hào)：YZ-5T。

1.3細(xì)胞與病毒HSV-1KOS病毒株及VERO細(xì)胞由上海中醫(yī)藥大學(xué)病毒免疫實(shí)驗(yàn)室提供。VERO細(xì)胞孵箱的工作條件：溫度37℃，空氣濃度95%，CO2濃度5%。

1.4實(shí)驗(yàn)兔的處理病毒接種組采用愛爾卡因滴眼液(美國愛爾康公司)行表面麻醉后，開瞼器撐開眼瞼，用刀片對(duì)兔角膜行以瞳孔緣為內(nèi)徑的放射狀向外切開，共8處，深度以劃開角膜上皮為標(biāo)準(zhǔn)。采用含病毒濃度為4×107pfu/ml的DMEM7 μl滴于放射狀劃開角膜上皮的角膜表面，使角膜暴露10 s后放開開瞼器，閉合眼瞼輕輕按摩5 s。對(duì)照組采用同樣的方法行角膜上皮放射狀切開，不接種病毒。

1.5病毒性角膜炎模型建立的判定標(biāo)準(zhǔn)參照夏麗坤[1]等HSK的檢測方法,在 HSV-Ⅰ角膜接種后的第2～7天，每天用蘸有MEM的濕棉片擦拭右眼角膜表面的淚液膜，然后將其放入盛有1 000 μl MEM的試管中吹打6次，取200 μl角膜擦拭液移入上述VERO細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)1周，每天在相差倒置的顯微鏡下觀察VERO細(xì)胞是否出現(xiàn)細(xì)胞病理學(xué)改變。在HSV-Ⅰ角膜接種后每天用裂隙燈顯微鏡檢查角膜病變，凡是角膜呈現(xiàn)點(diǎn)狀、樹枝狀、地圖狀且角膜擦拭液中有病毒復(fù)制的兔眼被判定為患HSK。所有確定為HSK的兔被納入角膜炎組，角膜溫度及評(píng)分記錄被納入統(tǒng)計(jì)。

1.6角膜溫度測定方法控制環(huán)境溫度為(25±2)℃。距離兔角膜10 cm處將瞄準(zhǔn)光對(duì)準(zhǔn)角膜中央，測定角膜溫度，1s讀數(shù)，重復(fù)三次，取平均值。

1.7觀察指標(biāo)造模前，模型建立后第1天、3天、7天、14天測定角膜中央溫度。角膜觀察評(píng)分：角膜上皮及基質(zhì)損害的嚴(yán)重程度用0～4分評(píng)分[2-3]。角膜新生血管的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無新生血管長人角膜；1分：新生血管向心性生長，但未達(dá)到瞳孔中央或未超過角膜半徑；2分：新生血管達(dá)到瞳孔中央或超過角膜半徑。

2結(jié)果

2.1HSK模型建立結(jié)果15只實(shí)驗(yàn)兔中12只在病毒接種后2～3 d出現(xiàn)角膜點(diǎn)狀或樹枝狀改變，同時(shí)伴有CPE，VERO細(xì)胞表現(xiàn)為球形變、漂浮、集攏等，原本貼壁生長的細(xì)胞部分脫落、漂浮在培養(yǎng)液中，標(biāo)志模型建立。 對(duì)照組10只兔角膜2～3 d后上皮皆愈合。

2.2兔角膜中央溫度基礎(chǔ)值31.14±1.12℃。

2.3HSK模型建立前后角膜溫度比較(表1)：組內(nèi)比較：HSK角膜炎組造模前后自身配對(duì)t檢驗(yàn)，造模后1 d與造模前比較P=0.019(*代表P<0.05)，造模后3 d與造模前比較P=0.001(**代表P<0.01)，造模后7 d與造模前比較P=0.005(**代表P<0.01)，造模后14 d與造模前比較P=0.026(*代表P<0.05)。組間比較：HSK角膜炎組與對(duì)照組比較：造模后1 d，3 d，7 d，14 d兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(△代表P<0.05)。

表2　HSK兔角膜評(píng)分與眼表溫度

2.4HSK角膜炎組角膜評(píng)分及眼表溫度造模后3 d、7 d、14 d與造模后1 d角膜基質(zhì)病變?cè)u(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0006，P=0.000，P=0.000)。造模后14 d角膜新生血管與造模后1 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)，其余時(shí)間點(diǎn)無差異。造模后各觀察點(diǎn)角膜上皮病變面積評(píng)分無差異(P>0.05)，見表2。

2.5兔角膜溫度與各評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)性分析角膜表面溫度與角膜上皮病變面積評(píng)分在各時(shí)間點(diǎn)皆無統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系(P>0.05)。角膜表面溫度與角膜基質(zhì)混濁程度在第3天時(shí)相關(guān)系數(shù)r=0.629，顯著性水平為P=0.028；第7天時(shí)相關(guān)系數(shù)r=0.616，顯著性水平P=0.033；14 d時(shí)無顯著相關(guān)(P>0.05)。角膜新生血管在14 d時(shí)與角膜表面溫度的相關(guān)系數(shù)r=0.714，顯著性水平為P=0.009。

3討論

角膜位于眼球的前部，占眼表1/6的面積，具有屈光、透射、保護(hù)內(nèi)眼的作用。紅外線溫度檢測儀因?yàn)槠錈o創(chuàng)和便捷的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床與生活。采用紅外線測得人體角膜的溫度為(32.06±1.24)℃[4]。對(duì)于兔角膜溫度的測定研究較少，F(xiàn)reeman曾報(bào)道兔角膜生理溫度為33～34℃[5]。本次研究中我們測得兔角膜平均溫度為31.14±1.12℃，接近但略低于其報(bào)道值?？赡芘c采用的儀器及檢測方法有關(guān)。鑒于紅外線測量結(jié)果易受儀器自身因素(發(fā)射率、測量距離及光斑的位置、大小) 和環(huán)境因素的影響，本研究選擇非接觸式紅外線測溫儀的發(fā)射率為0.95，接近角膜發(fā)射率(0.97～1.00)[6]。根據(jù)儀器特性，固定測定距離為距離角膜10 cm，以保證測得的范圍聚焦于角膜，讀數(shù)為角膜面積內(nèi)的平均溫度，提高檢測準(zhǔn)確性，盡量避免儀器自身誤差。為減少環(huán)境誤差，根據(jù)儀器要求，控制室溫為(25±2)℃，盡量使實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

雖然角膜組織無血管，處于免疫赦免狀態(tài)，但角膜的各種疾病，甚至內(nèi)眼疾病、眼底疾病，都可引起角膜溫度的改變。沈慧研等[7]報(bào)道蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼者角膜溫度高于非干眼者。但Versura等[8]報(bào)道干眼患者的角膜溫度低于正常人。Fernando Galassi等[9]報(bào)道開角型青光眼患者眼表溫度顯著低于正常人。 Gonnermann等[10]報(bào)道翼狀胬肉患者角膜表面溫度低。對(duì)于眼表感染性疾病，有報(bào)道在細(xì)菌性角膜潰瘍時(shí)，角膜的溫度明顯上升[11]。對(duì)于病毒性角膜炎的眼表溫度尚未見報(bào)道。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接種HSV-1建立病毒性角膜炎模型后，角膜溫度明顯升高(表1)，至造模后14 d，溫度仍高于正常。

單純皰疹病毒感染在臨床較為常見，常表現(xiàn)為眼部及粘膜感染，亦可有病毒性腦炎，治療以抗病毒為主，適時(shí)聯(lián)合應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可減輕炎癥反應(yīng)[12]。HSV-1通過直接感染粘膜組織致病，而角膜上皮是病毒感染與復(fù)制的重要場所。如病毒沒有被迅速清除，則可使免疫因子聚集而引起角膜的免疫病理反應(yīng)[13]。由中性粒細(xì)胞參與的炎性反應(yīng)及T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫可導(dǎo)致角膜上皮壞死、基質(zhì)水腫、新生血管及角膜潰瘍形成。在感染性角膜炎中，角膜基質(zhì)混濁水腫常因單核細(xì)胞、CD4、CD8+T細(xì)胞、趨化因子等的共同作用，因而基質(zhì)混濁程度也反映了免疫炎癥反應(yīng)的程度。表2中可見，從造模后3 d起，角膜基質(zhì)出現(xiàn)明顯混濁，持續(xù)至造模后14 d。溫度變化是局部組織炎癥反應(yīng)的有力表現(xiàn)，與炎癥引起的血流加快，組織代謝增強(qiáng)有關(guān)[14]。我們發(fā)現(xiàn)在造模后3 d、7 d角膜溫度的改變與病變?cè)斐傻幕|(zhì)混濁有一定的相關(guān)性(P<0.05)。這也證明了角膜溫度與炎癥的程度相關(guān)。角膜新生血管是角膜疾病的常見并發(fā)癥，降低了角膜的透明性，角膜新生血管的生長可改變角膜的“免疫赦免”功能。新生血管的發(fā)生與炎癥、感染、外傷等多種因素有關(guān)[15,16]。造模后14 d，新生血管對(duì)比第1天明顯增多(P<0.01)。而角膜溫度與新生血管表現(xiàn)出一定的相關(guān)性(P<0.05)，考慮一方面與炎癥反應(yīng)相關(guān)，另一方面與新生血管引起的代謝增強(qiáng)有關(guān)。

測量角膜溫度是一種實(shí)用便捷的了解眼部疾病的方法，我們的研究表明此方法同樣適用于病毒性角膜炎的研究，且角膜溫度與角膜基質(zhì)混濁及新生血管具有相關(guān)性。進(jìn)一步的臨床研究仍有待進(jìn)行，以證實(shí)其在臨床的應(yīng)用價(jià)值。

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通信作者：繆晚虹，Email: miaowanh@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.005

基金項(xiàng)目：上海市科委自然基金青年基金(12ZR1450600)；上海市衛(wèi)計(jì)委三年行動(dòng)計(jì)劃(ZY3-JSFC-1-1019)

(收稿日期：2015-12-22)

The experimental research of cornea superficial temperature in herpes simplex keratitis and its relationship with cornea lesion

YuYing,MiaoWanhong,ZhaoFang,LiFeifeiShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiTraditionalChineseMedicineUniversity,Shanghai201203,ChinaCorrespondingauthor:MiaoWanhong,Email:miaowanh@126.com

【Abstract】Objective To study the change of cornea superficial temperature of herpes simplex keratitis(HSK) rabbits and the relationship between corneal temperature with cornea lesion. MethodsThe right eyes of the 12 rabbits that were diagnosed as HSK by being inoculated HSV-1KOS virus to the cornea were brought into the experiment group. The 12 right eyes of the control group were dealt with incision on the cornea epithelial layer without virus. The corneal temperature was measured with the infrared thermometer. The scale of epithelia damage, lesion of stroma and neovascular were observed before and at the 1stday, 3rdday, 7thday, 14thday after establishment of the HSK model. ResultsThe cornea superficial temperature of herpes simplex keratitis was 31.14±1.12℃. The temperatures at the 3rdday, 7thday, 14thday were all higher than those of the control group (P<0.01, P<0.05). The stroma opacity were rather serious at the 3rdday, 7thday, 14thday, and the temperatures of the 3rdday and 7thday were relevant to the degrees of stroma opacity(P<0.05). The neovascular was significantly increased at the 14thday, which was relevant to the cornea temperature (P<0.05).ConclusionThe cornea superficial temperature was increased in the case of herpes simplex keratitis, and the temperature was relevant to the degree of stroma opacity and neovascular.

【Key words】Herpes simplex keratitis; Cornea temperature; Cornea lesion; Experiment research