SIRT6在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)變化與抑瘤機(jī)制分析△

劉妙娜劉琢冰鄭　娟謝　星吳偉剛（.深圳市第三人民醫(yī)院　深圳　582；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳第三人民醫(yī)院　深圳　582；3.贛南醫(yī)學(xué)院　贛州　34000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

SIRT6在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)變化與抑瘤機(jī)制分析△

劉妙娜1劉琢冰2鄭娟2謝星3吳偉剛（11.深圳市第三人民醫(yī)院深圳518112；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳第三人民醫(yī)院深圳518112；3.贛南醫(yī)學(xué)院贛州341000）

SIRT6是Sirtuin家族的組成部分，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的組蛋白去乙?；?。SIRT6是肝臟葡萄穩(wěn)態(tài)主調(diào)節(jié)者，通過對(duì)胰島素/IGF1樣信號(hào)（IIS）途徑的影響，基于多個(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖代謝的影響，對(duì)人體生命維系和控制腫瘤產(chǎn)生作用。本文筆者以SIRT6為出發(fā)點(diǎn)，分析其在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)變化與抑瘤機(jī)制。

SIRT6原發(fā)性肝癌 表達(dá)變化 抑瘤機(jī)制

1材料與方法

1.1材料與試劑：TUNEL（試劑盒）、蛋白酶/磷酸酶抑制劑、活化型半胱天冬酶-3抗體、ERK1/2抗體、總ERK1/2抗體、U0126、ECL試劑盒、二氯氫化熒光素（DCF）、4%多聚甲醛、0.3%過氧化氫液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、總蛋白提取試劑盒等。

1.2細(xì)胞株和質(zhì)粒載體：一方面，通過已構(gòu)建好的Ad-SIRT6真核質(zhì)粒載體和Ad-SIRT6-shRNA質(zhì)粒載體進(jìn)行試驗(yàn)。另一方面，HepG2細(xì)胞為細(xì)胞株，在聯(lián)合Ad-SIRT6-HepG2與Ad-GFP-HepG2細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。

2 SIRT6發(fā)揮肝癌抑瘤作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究

2.1分析TUNEL：（1）將無菌平板片放置于96孔板中，清洗干凈，利用多聚賴氨酸覆蓋浸潤后倒除，達(dá)到固定細(xì)胞的效果。（2）待平板片干后，馬上用離子水清洗，采取自然通風(fēng)干燥方式。（3）在96孔板的無菌平玻上接種HepG2細(xì)胞。（4）培養(yǎng)約至細(xì)胞鋪滿70%，利用Ad-SIRT6質(zhì)粒和Ad-GFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，于6h后繼續(xù)培養(yǎng)。（5）待孵育生長24h后，利用PBS將平板內(nèi)細(xì)胞洗2次，每次以3min為標(biāo)準(zhǔn)，放置于通風(fēng)位置2～3min，待其干燥。（6）通過4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，基于室溫條件，固定25min。（7）以室溫條件為基礎(chǔ)，利用PBS液沖洗玻片5min，以2次為標(biāo)準(zhǔn)。（8）在室溫條件下，將玻片細(xì)胞浸入透化劑0.2%TritonX-100中，通透5min。（9）在常溫條件下，利用PBS液沖洗5min，以2次為標(biāo)準(zhǔn)，放置于干燥狀態(tài)。（10）利用平衡液將細(xì)胞覆蓋，在室溫條件下，平衡5min，基于冰上預(yù)置前提，續(xù)各酶。將100μL對(duì)照平衡液添加至陰性對(duì)照組，將100μLrTdT反應(yīng)混合物添加至實(shí)驗(yàn)組?；?7℃以內(nèi)，孵育60min，且允許末端標(biāo)記反應(yīng)發(fā)生。利用PBS液沖洗4次，基于常溫條件，在0.3%過氧化氫中浸泡5min，促使內(nèi)源性過氧化物酶得以消除，再用PBS清洗2次。（11）在玻片中添加新鮮配制的DAB100μL.于37℃避光條件下，孵育1h，直到玻片顯示為棕色為止，用離子水進(jìn)行2次沖洗，每次以30min為標(biāo)準(zhǔn)。（12）通過熒光顯微鏡，對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行觀察，TUNEL陽性細(xì)胞（綠色）則為凋亡細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。

2.2 Western blot法檢測HepG2細(xì)胞中的Caspase-3蛋白：轉(zhuǎn)染成功的Ad-SIRT6-HepG2細(xì)胞與Ad-GFP-HepG2細(xì)胞為受檢樣本，分別1×107取用于試驗(yàn)。大致步驟涉及以下幾點(diǎn)：提取細(xì)胞總蛋白、利用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測定、SDS-PAGE電泳、免疫檢測以及化學(xué)發(fā)光等。其中，Caspase-3抗體和相關(guān)二抗為所有抗體。

2.3測量細(xì)胞內(nèi)活性氧：第一，接種已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，基于經(jīng)消毒的96孔板，利用移液槍，緩慢接種Ad-SIRT6-HepG2細(xì)胞與Ad-GFP-HepG2細(xì)胞。5×104個(gè)細(xì)胞/孔為標(biāo)準(zhǔn)。第二，在孵育過夜條件下，離心96孔板，用PBS清洗2次，切勿洗掉細(xì)胞。第三，DCFH孵育，以100μMDCFH為依據(jù)，在37℃避光條件下，孵育1h。第四，處理，孵育結(jié)束后，利用PBS清洗2次。第五，檢測，利用熒光酶標(biāo)儀對(duì)熒光進(jìn)行檢測。

2.4 U0126對(duì)Ad-SIRT6-HepG2細(xì)胞增殖的影響：將Ad-GFP 與Ad-SIRT6轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞接種至48孔板上，在孵育過夜基礎(chǔ)上，運(yùn)行連接。第二日，待細(xì)胞血清饑餓8h后，在培養(yǎng)基中添加FBS，再添加U0126，共同培育。以12h、24h、36h以及48h為基點(diǎn)，分別添加10μL的CCK-8溶液于細(xì)胞內(nèi)，共同孵育2h，并基于3450nm光密度條件，進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS20.0軟件對(duì)本次研究所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用（±s）表示計(jì)量資料，t檢驗(yàn)，X2檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料的比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用P＜0.05表示。

4結(jié)　果

4.1 SIRT6過表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡：基于Ad-SIRT6轉(zhuǎn)染條件，HepG2細(xì)胞組凋亡細(xì)胞明顯，相較Ad-GFP，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如表1所示。在Ad-SIRT6轉(zhuǎn)染作用下，HepG2細(xì)胞檢測到了凋亡細(xì)胞（TUNEL陽性細(xì)胞，呈綠色，如圖1A所示），提示SIRT6過度表達(dá)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，差異顯著，見柱狀圖（圖1B）。

表1 Ad-SIRT6與Ad-GFP TUNEL分析結(jié)果對(duì)比

4.2 SIRT6過表達(dá)肝細(xì)胞降低氧化應(yīng)激：對(duì)比Ad-GFP與Ad-SIRT6 DCF法測ROS，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如表2所示?；贒CF檢測結(jié)果表明，過度表達(dá)SIRT6能降低HepG2細(xì)胞中的ROS水平，如圖2所示。

表2 Ad-GFP與Ad-SIRT6 DCF法測ROS結(jié)果對(duì)比

4.3 U0126抑制ERK1/2結(jié)果：對(duì)比U0126抑制ERK1/2結(jié)果，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如表3所示。如圖3所示，U0126顯著減弱SIRT6對(duì)干細(xì)胞生長的抑制效果，可見，SIRT6在抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)上，對(duì)肝癌細(xì)胞生長具有抑制效果。

表3 U0126抑制ERK1/2結(jié)果對(duì)比

5討論

本次實(shí)驗(yàn)采用TUNEL試驗(yàn)方式，在檢測SIRT6對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡影響作用的基礎(chǔ)上，探究caspase3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，SIRT6過表達(dá)具有激活活化型caspase3蛋白表達(dá)的作用，能夠促使癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在測量細(xì)胞內(nèi)活性氧的基礎(chǔ)上，探究U0126對(duì)Ad-SIRT6-HepG2細(xì)胞增殖的影響。

細(xì)胞凋亡，最早見于1972年，由英國Kerr提出［1］，指活體細(xì)胞基于某種生理因素或病理因素條件，通過機(jī)體信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控，體現(xiàn)的主動(dòng)型細(xì)胞死亡現(xiàn)象，亦被稱為細(xì)胞程序性死亡［2］。其中，針對(duì)細(xì)胞凋亡，主要設(shè)計(jì)兩個(gè)途徑：一是死亡因子受體配體通路，F(xiàn)as與Fasl相結(jié)合，并募集FADD，形成三聯(lián)復(fù)合體，即Fasl-Fas-FADD，促使caspase8、caspase3等被激活，迫使細(xì)胞凋亡［3］。二是TNER死亡通路，基于TNER1和TNER2介導(dǎo)作用，發(fā)揮TNF的生物活性，通過結(jié)合，募集細(xì)胞內(nèi)TNER相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白，促使caspase8、caspase3等被激活，達(dá)到細(xì)胞凋亡目的［4］。

本次研究，初步證實(shí)了SIRT6在HepG2肝癌細(xì)胞株過度表達(dá)具有較為明顯的抗腫瘤作用，該作用在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，抑制ERK1/2信號(hào)通路。同時(shí)，SIRT6過度表達(dá)能夠降低HepG2肝癌細(xì)胞ROS水平，證明SIRT6抗氧化作用較強(qiáng)?？傊?，SIRT6對(duì)肝癌細(xì)胞生長的調(diào)控，有助于加深對(duì)感染的理解，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的有效干預(yù)，促使肝癌控制進(jìn)入新的發(fā)展階段。

［1］喻明慧，陳帆，魏清.腹腔鏡下膽囊切除術(shù)患者麻醉蘇醒期的護(hù)理探討［J］.中國傷殘醫(yī)學(xué)，2013，9：326-327.

［2］張智高.SIRT6在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)變化及其抑瘤機(jī)制的研究［D］.山東大學(xué)，2014.

［3］劉毅.SIRT3在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其抑瘤作用的研究［D］.中南大學(xué)，2012.

［4］張弓.EphA7在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其體外抑制研究［D］.鄭州大學(xué)，2010.

△深圳市科技創(chuàng)新委基礎(chǔ)研究知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃JCYJ20130329171031740。

Analysis of SIRT6 in primary hepatocellular carcinoma and the expression of tumor suppressor mechanism

Liu Miaona1Liu Zhuobing2Zheng Juan2Xie Xing3Wu Weigang1（1.Department of Pharmacy，the Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518112；2.Shenzhen Third People’s Hospital Affiliated To Guangdong Medical College，Guangdong Shenzhen 518112；3.Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi Province，341000）

SIRT6 is part of the sirtuin family，nicotinamide adenine dinucleotide（NAD+）-dependent histone to acetylase.SIRT6 is grape homeostasis in liver as the main controller，through the effect of insulin-like/IGF1 signal（IIS）pathway，based on multiple network regulation mechanism to achieve effects on glucose metabolism，to human life and maintain and control tumor effect.In this paper，the author will SIRT6 as a starting point，analysis the in primary hepatocellular carcinoma and the expression changes of and mechanism of inhibiting tumor.

SIRT6 Primary liver cancer Expression change Mechanism of inhibiting tumor

R735.7

B

1672-8351（2016）08-0108-02