磷脂酰膽堿及膽汁酸鹽體外溶脂的實驗研究*

西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科 (西安710003)　郝　劍　劉　賓　李　菲　韓　悅　陶　諫

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磷脂酰膽堿及膽汁酸鹽體外溶脂的實驗研究*

西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科 (西安710003)郝劍劉賓▲李菲△韓悅陶諫

摘要目的: 通過對保脂妥(Lipostabil)、磷脂酰膽堿(PC)以及脫氧膽酸鹽(DC)的體外對照觀察試驗，對其溶脂效果進行初步觀察及探討。方法:分別將Lipostabil組、5%PC組、不同濃度DC組分別與分化成熟的脂肪細胞共培養(yǎng)，觀察脂肪細胞的形態(tài)、細胞活性以及脂溶度。結果： PC由于必須溶解于溶劑中，故其獨立于DC以及其它溶劑對脂肪組織的破解作用在本實驗中無法得到證實；DC對于脂肪細胞具有明顯的破壞作用且與其一定范圍的濃度無明顯正相關性；Lipostabil具明顯的脂肪細胞破壞作用。結論：DC及Lipostabil組均具有明確的脂肪細胞破壞作用。

主題詞磷脂酰膽堿類膽酸鹽(酯)類@注射溶脂

本實驗通過對目前最常用的注射溶脂藥物Lipostabil以及其有效成分磷脂酰膽堿和及脫氧膽酸鹽的體外對照觀察試驗，對其溶脂效果作用進行初步的觀察及探討。

材料與方法

1材料3T3-Ll前體脂肪細胞(ATCC細胞株來源于美國標準菌庫由中國科學院上海生命科學院細胞資源中心提供。) Lipostabil[主要成分5%磷脂酰膽堿(PC)、4.75%脫氧膽酸鹽(DC)，法國 Aventis 公司產]；5%PC及4.5%DC、膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國 Sigma 公司)；噻唑蘭(美國 Amresco 公司)；1-甲基 3-異丁基黃嘌呤、地塞米松、胰島素及油紅O等(北京知麟堂生物科技發(fā)展有限公司)。TDL-40C 臺式離心機(上海安亭科學儀器廠), 全自動生化分析儀 7180(日本日立公司),全自動酶聯(lián)免疫分析儀(瑞士 HAMILTON公司)。

2方法

2.1體外培養(yǎng)3T3-Ll前體脂肪細胞：用含100U/ml青、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當細胞融合至約70%時，傳代至六孔板中；待細胞生長至完全融合后48h，加入0.5mmol/L 1-甲基3-異丁基黃嘌呤(IBMX)、1μ mol/L 地塞米松(DEX)、10 μg/ml 胰島素(INS)； 48h后撤去IBMX和DEX；培養(yǎng)至第8～9天時觀察分化成熟的前體脂肪細胞。

2.2分化成熟的3T3-Ll前體脂肪細胞油紅O染色：光鏡下觀察細胞內脂滴的聚集并拍照。

2.3分組培養(yǎng)：于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)分化成熟的脂肪細胞，培養(yǎng)密度5000 cells/cm2，分6組進行培養(yǎng)，分別為空白對照組、Lipostabil組、5%磷脂酰膽堿組、4.5%脫氧膽酸鹽組。

2.4不同濃度(1%、2%、3%、4%、5%、6%、)脫氧膽酸鹽與分化成熟的脂肪細胞共培養(yǎng)。

3觀察項目

3.1光鏡下觀察細胞形態(tài)及狀態(tài)。

3.2MTT法鑒定細胞活性:收集各組細胞于96孔板中，每孔加MTT溶液20μl；繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150μl DMSO，脫色搖床振蕩10min，選擇490nm(570nm)波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

3.3用 5% PC、4. 5% DC、Lipostabil 分別作用于分化的脂肪細胞 72 h，采用酶法檢測培養(yǎng)液內中的 TC 含量，評價其脂肪細胞的溶解程度。

結果

1光鏡下脂肪細胞形態(tài)及狀態(tài)3T3-Ll前體脂肪細胞(圖1)；分化成熟的3T3-Ll脂肪細胞(圖2)； 油紅染色的3T3-Ll脂肪細胞(圖3)； 成熟的脂肪細胞與各實驗組藥物共培養(yǎng)后均出現(xiàn)明顯的溶解與破壞(圖4)。

圖1　3T3-Ll前體脂肪細胞(10×10)

圖2　分化成熟的3T3-Ll脂肪細胞(10×10)

2MTT法鑒定細胞活性

2.1選擇第2天培養(yǎng)的快速增殖脂肪細胞開始給藥，各組細胞分別于接種后0～4d采用MTT法測細胞A值。與對照組比較，三組細胞的增殖活性顯著降低(P<0.05)，其中DC組作用更明顯，但三組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

圖3　油紅染色的3T3-Ll脂肪細胞(10×10)

圖4　溶解破壞的3T3-Ll脂肪細胞(10×10)

2.2不同濃度的DC對脂肪細胞活性的影響：選擇第2天培養(yǎng)的快速增殖脂肪細胞分別給于給予1%-6%濃度的DC，各組細胞分別于接種后0～4d采用MTT法測細胞A值。與對照組(DMEM)比較，各濃度組細胞的增殖活性均顯著降低(P<0.05)，濃度越高作用相對更明顯，但各濃度組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

3脂解程度測定測定培養(yǎng)基中甘油含量作為評價脂肪分解的指標。脂肪分解數(shù)據(jù)表示為每升脂肪細胞壓積的毫摩爾甘油釋放量(mmol/L packed cell volume, mmol/LPCV)。PC 組 TC(4.09±0.78mmol/L)、DC(4.28±0.81mmol/L)、Lipostabil(4.19±0.79mmol/L)顯著高于對照組 TC(P<0.05)；結果顯示DC組溶脂作用較好，但三組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表1　不同溶脂成份對脂肪細胞增殖活性不同時間作用效果

注：與對照組(DMEM)比較，*P<0.05；各實驗組間比較，P>0.05

表2　不同濃度DC對脂肪細胞增殖活性不同時間作用效果±s)

注：與對照組(DMEM)比較，*P<0.05；各實驗組間比較，P>0.05

討論

目前的身體塑形技術包括兩個發(fā)展方向：一方面，腹壁整形和吸脂等傳統(tǒng)手術仍將是最有效和流行的美容手術；另一方面，以消減局部皮下脂肪為目的的新型能源類和注射類技術正在迅速得到開展和部分認同。

Lipostabil由法國Sanofi-Aventis公司生產，在部分歐洲國家被許可用于靜脈注射治療脂肪栓塞、血脂障礙和酒精性肝硬化。其為含大豆提取卵磷脂(Phosphatidylcholine，PC)5%、去氧膽酸(Deoxycholate，DC)4.5%及維生素E、氫氧化鈉、乙醇和苯甲醇的無菌水溶劑。Lipostabil注射消脂的療法受到國際業(yè)界關注始于巴西皮膚科醫(yī)生Patricia Rittes發(fā)表的一篇關于眶下注射Lipostabil消脂的報告[1]。之后，關于局部注射磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)及脫氧膽酸鹽(Deoxycholate,DC)消脂的研究報告大量涌現(xiàn)[2-7]。而隨著大量的相關雙盲臨床試驗而獲得了一些重要的發(fā)現(xiàn)[8]，在認同注射溶脂的脂肪溶解作用的同時，對其臨床安全性也提出了質疑。為此我們通過對目前最常用的注射溶脂藥物的有效成分，磷脂酰膽堿以及脫氧膽酸鹽的體外對照觀察試驗，對其溶脂效果作用進行初步的觀察及探討。

從體外實驗結果來看，5%PC組與Lipostabil一樣同樣具有明顯的脂肪細胞破壞作用。但是由于PC不可溶解于水，而實驗中PC的溶劑DC或者其他膽汁鹽以及乙醇等也會產生類似的脂肪溶解作用。因此PC獨立于DC以及其它溶劑對脂肪組織的破解作用在本實驗中無法得到證實，目前國內的相關試驗和臨床研究報道也很少。至于PC在Lipostabil中的真正作用，有研究推測： PC可能具有對DC溶解脂肪組織進行乳化和消除的作用，可以減輕注射溶脂后常見副反應，但具體機制不清楚。這一點我們將在后期的動物實驗進一步進行驗證。

DC是在肝臟分泌初級膽汁酸(膽酸)后由腸道細菌生成的次級膽汁酸，存儲于膽囊內，分泌進入十二指腸，其中包含可溶解攝入油脂的游離結合膽汁酸。之后，大部分(90%～95%)DC被再次吸收，但被排出DC由從肝臟膽固醇合成物取代。因為膽酸是膽固醇的最終產品，因此不再降解為其他降解物。 DC被用于試驗清潔劑已有數(shù)十年歷史，是藥廠普用于生產靜脈注射制劑的常規(guī)生理兼容溶劑成分之一。動物和人體組織與DC或PC/DC復合物接觸后可發(fā)生內出血、炎癥和組織壞死。作為一種非離子清潔劑，DC還可引發(fā)細胞膜穿孔、細胞質滲漏、胞膜不穩(wěn)，從而導致溶解。本實驗中DC組對于脂肪細胞的溶解作用更加明顯、持久，且其對脂肪細胞的破壞作用與實驗組中的濃度相關性不大。因此DC在Lipostabil中不僅充當著PC溶劑的角色，其對脂肪細胞的溶解和破壞也起著非常重要的作用，另外我們也將在后續(xù)實驗中驗證是否可以在溶脂藥物的配方中適當降低DC的濃度以減少其對機體的不良反應。

Lipostabil組在體外試驗中，與其它兩組一樣均對脂肪細胞有著明顯的脂肪細胞破壞作用。那么PC或DC溶解脂肪細胞與Lipostabil的區(qū)別在于哪里？ 有研究推測： PC和DC復合溶液可導致混合膠束聚合物形成，從而(因游離DC減少)減弱DC的溶脂活性。另外 PC可能具有對DC溶解脂肪組織進行乳化和消除的作用；可能有減輕注射溶脂后常見副反應的作用，但其具體機制仍待進一步研究。

目前，由于注射溶脂藥物劑量和配方的非標準化引發(fā)了許多并發(fā)癥。其中最常見者包括：即時水腫、紅斑、瘙癢、甚至壞死和炎癥組織結節(jié)等。在這些注射部位出現(xiàn)的副反應，多數(shù)可能與注射技術或注射藥物濃度過高有關。對于注射溶脂藥物中PC、DC各自的比例、濃度以及注射時的層次把握，我們將在接下來的動物實驗進行進一步探討和驗證。

總之，DC及Lipostabil均具有明確的脂肪細胞破壞作用，且DC的脂肪細胞破壞作用在一定范圍內與其濃度無明顯正相關性。

參考文獻

[1]Rittes PG. The use of phosphatidylcholine for correction of lower lid bulging due to prominent fat pads[J]. Dermatol Surg, 2001,27:391-2.

[2]Rotunda AM, Kolodney MS. Mesotherapy and phosphatidylcholine injections clarification and review[J]. Dermatol Surg, 2006,32:465-480.

[3]Ablon G, Rotunda AM. Treatment of lower eyelid fat pads using phosphatidylcholine: Clinical trial and review[J]. Dermatol Surg, 2004,30:422-427.

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[5]Treacy PJ, Goldberg DJ. Use of phosphatidylcholine for the correction of lower lid bulging due to prominent fat pads[J]. Cosmet Laser Ther, 2006,8:129-132.

[6]Bechara FG, Mannherz HG. Induction of fat cell necrosis in human fat tissue after treatment with phosphatidylcholine and deoxycholate[J].Eur Acad Dermatol Venereol, 2012 ,26(2):180-5.

[7]Duncan D, Rotunda AM.Injectable therapies for localized fat loss: State of the art.Clin Plast Surg, 2011, 38(3):489-501.

(收稿：2016-03-07)

【中圖分類號】R33

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.003

Experimental study of phospholipids and deoxycholate in vitro lipolysis

Department of Bum and plastic surgery, Xi’an Central Hospital(Xi'an 710003)

Hao JianLiu BinLi Feiet al

ABSTRACTObjective By fat injection lipolysis medication properly (Lipostabil), phosphatidylcholine (PC) and deoxycholate (DC) in vitro controlled observation experiment, observing and discussing its preliminary lipolysis effect. Methods: The Lipostabil group, 5% PC group, various concentration DC group were co-cultured with fat cells ， cell morphology、 activity and lipid solubility was observed. Results: PC-independent DC and other solvents cracks on the role of adipose tissue in this experiment could not be confirmed; DC for adipocytes has obvious destructive effects. Conclusion: DC and Lipostabil has a clear role in the destruction of fat cells.

KEY WORDSPhosphatidylcholinesCholates@Injectionsolution

*陜西省科技攻關項目(SFα-06)

△西安醫(yī)學院護理學院

▲通迅作者