腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素的敏感性分析

孫　麗， 郭　燕， 楊　洋， 徐曉剛， 楊　帆， 胡付品

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腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素的敏感性分析

孫麗， 郭燕， 楊洋， 徐曉剛， 楊帆， 胡付品

摘要：目的 了解上海華山醫(yī)院2014年臨床分離腸桿菌科細(xì)菌構(gòu)成及其對(duì)多黏菌素的藥物敏感性。方法 收集該院2014 年1－8月臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌，藥敏試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法，PCR擴(kuò)增blaKPC基因并行DNA測(cè)序分析，用WHONET 5.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 719株腸桿菌科細(xì)菌中，主要為克雷伯菌屬（315/719，43.8%）和大腸埃希菌（219/719，30.4%）?？死撞鷮?、大腸埃希菌和枸櫞酸桿菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率均較低（＜3%）；腸桿菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率分別為10.9%和11.1%；沙雷菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率分別為47.5%和44.7%；摩根菌屬和變形桿菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率均超過(guò)90%。碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株主要見(jiàn)于克雷伯菌屬，其對(duì)美羅培南、厄他培南耐藥率均高于40%，但對(duì)多黏菌素B、E耐藥率分別為2.9%、2.6%；枸櫞酸桿菌屬和沙雷菌屬細(xì)菌對(duì)厄他培南的耐藥率分別為27.8%和17.9%；其他腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥率小于10%。20.7%（149/719）的菌株blaKPC基因呈陽(yáng)性，主要見(jiàn)于克雷伯菌屬（129/315，41.0%）；7株黏質(zhì)沙雷菌和2株肺炎克雷伯菌同時(shí)對(duì)碳青霉烯類(lèi)和多黏菌素耐藥。結(jié)論 克雷伯菌屬、大腸埃希菌、腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬等對(duì)多黏菌素仍保持著較高的敏感性。

關(guān)鍵詞：腸桿菌科細(xì)菌； 碳青霉烯類(lèi)耐藥； 多黏菌素； blaKPC

隨著碳青霉烯類(lèi)藥物在臨床的廣泛使用，碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）的檢出率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，尤其是產(chǎn)碳青霉烯酶CRE菌株在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)引起暴發(fā)流行，其所致感染的臨床治療可選方案非常有限，常伴隨著高病死率［1］。鑒于此，發(fā)現(xiàn)于1947年，后因其腎毒性和神經(jīng)毒性在臨床上少用的多黏菌素重新得到關(guān)注，成為臨床治療CRE所致感染的重要選擇［2］。然而，已有報(bào)道顯示多黏菌素耐藥CRE菌株在匈牙利［3］、韓國(guó)［4］等多個(gè)國(guó)家引起暴發(fā)流行，美國(guó)CRE菌株對(duì)多黏菌素敏感性正在下降［5］，我國(guó)臺(tái)灣CRE菌株對(duì)多黏菌素耐藥率可達(dá)17%［6］。我國(guó)大陸地區(qū)多黏菌素目前雖未在臨床上使用，但我院2009—2010年分離的82株CRE菌株中已有4株對(duì)多黏菌素耐藥［7］。為了解我院臨床分離腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素的藥物敏感性，對(duì)2014年臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)、阿米卡星和多黏菌素等抗菌藥物的敏感性及碳青霉烯酶基因blaKPC的檢出率進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株來(lái)源 連續(xù)收集我院2014年1－8月臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌，剔除同一患者分離的重復(fù)菌株。藥敏試驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 抗菌藥物和試劑 藥敏試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品如美羅培南、厄他培南、阿米卡星等購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院、多黏菌素B和多黏菌素E分別購(gòu)自阿波羅生物藥業(yè)有限公司和江蘇正大天晴公司；藥敏試驗(yàn)所用MH瓊脂、MH肉湯為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品； PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，rTaq酶等相關(guān)試劑為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)瓊脂稀釋法測(cè)定719株腸桿菌科細(xì)菌對(duì)厄他培南、美羅培南、阿米卡星、多黏菌素B和多黏菌素E 5種藥物的敏感性。其中細(xì)菌對(duì)前3種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果按2014年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀［8］；多黏菌素結(jié)果根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀［9］，MIC≤2 mg/L為敏感，MIC＞2 mg/L為耐藥。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè) PCR方法檢測(cè)blaKPC碳青霉烯酶基因，所用引物按文獻(xiàn)設(shè)計(jì)［10］。陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序后比對(duì)分析以確定基因型別。本研究中CRE菌株定義為對(duì)美羅培南或厄他培南中任一種藥物耐藥者。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌及其分布

2014年1—8月共收集719株腸桿菌科細(xì)菌，包括克雷伯菌屬（315/719，43.8%，其中肺炎克雷伯菌310株，產(chǎn)酸克雷伯菌5株）和大腸埃希菌（219/719， 30.4%）、沙雷菌屬（84/719，11.7%，其中黏質(zhì)沙雷菌83株，氣味沙雷菌1株）、腸桿菌屬（47/719，6.5%，其中陰溝腸桿菌30株，產(chǎn)氣腸桿菌14株，日溝維腸桿菌1株，棲水腸桿菌1株，阿氏腸桿菌1株）、枸櫞酸桿菌屬（18/719，2.5%，其中弗氏枸櫞酸桿菌9株，異型枸櫞酸桿菌5株，無(wú)丙二酸枸櫞酸桿菌2株，楊氏枸櫞酸桿菌1株，布氏枸櫞酸桿菌1株）、摩根菌屬（15/719，2.1%，摩根摩根菌15株）、變形桿菌屬（14/719，1.9%，其中奇異變形桿菌7株、普通變形桿菌5株、雷特格變形桿菌2株）及斯氏普羅威登菌（6株）、植生拉烏爾菌（1株）等其他腸桿菌科細(xì)菌（7/719，1.0%）。

2.2藥敏試驗(yàn)

克雷伯菌屬、大腸埃希菌和枸櫞酸桿菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率較低，＜3%；腸桿菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率分別為10.9%、11.1%；沙雷菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率分別為47.5% 和44.7%；摩根菌屬和變形桿菌屬細(xì)菌對(duì)多黏菌素B和多黏菌素E的耐藥率均超過(guò)90%。碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株主要見(jiàn)于克雷伯菌屬，其對(duì)美羅培南、厄他培南耐藥率均高于40%，但對(duì)多黏菌素B、E耐藥率分別為2.9%、2.6%；枸櫞酸桿菌屬和沙雷菌屬細(xì)菌對(duì)厄他培南的耐藥率分別為27.8%和17.9%；其他腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥率小于10%。7株黏質(zhì)沙雷菌和2株肺炎克雷伯菌同時(shí)對(duì)碳青霉類(lèi)和多黏菌素耐藥，見(jiàn)表1。

2.3KPC型碳青霉烯酶基因檢測(cè)

PCR檢測(cè)及DNA測(cè)序結(jié)果顯示，719株腸桿菌科細(xì)菌中，20.7%（149/719）的菌株blaKPC基因呈陽(yáng)性，主要見(jiàn)于克雷伯菌屬（129/315，41.0%）。碳青霉烯耐藥菌株中blaKPC-2陽(yáng)性率為70.9%（144/203），其中克雷伯菌屬、沙雷菌屬及枸櫞酸桿菌屬中blaKPC-2的檢出率高，分別為79.1%（129/163）、66.7%（10/15）、80%（4/5），大腸埃希菌中blaKPC-2陽(yáng)性率相對(duì)較低，僅為5.6%（1/18）。

表1　2014年臨床分離腸桿菌科細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 1 Antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae strains isolated from Huashan Hospital in 2014

2.4多黏菌素耐藥CRE菌株

2株肺炎克雷伯菌和7株黏質(zhì)沙雷菌同時(shí)對(duì)碳青霉烯類(lèi)及多黏菌素耐藥，且對(duì)多黏菌素呈高水平耐藥（MIC＞128 mg/L），7株黏質(zhì)沙雷菌和1株肺炎克雷伯菌對(duì)阿米卡星敏感，另外1株肺炎克雷伯菌blaKPC-2陽(yáng)性且對(duì)5種抗菌藥物均耐藥（MIC≥128 mg/L）。這7株黏質(zhì)沙雷菌中blaKPC-2的檢出率可高達(dá)71.4%，見(jiàn)表2。

表2　多黏菌素耐藥CRE菌株的耐藥譜及blaKPC檢測(cè)結(jié)果Table 2 Antibiotic resistant pattern of polymyxin-resistant and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains and blaKPCgene detection

3　討論

CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，近年來(lái)CRE菌株呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)，尤見(jiàn)于肺炎克雷伯菌，其對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥率由2006年0.3%［11］上升至2013年13%［12］；我院臨床分離碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌檢出率由2005年0.9%急劇上升至2011年32.7%［3］。本項(xiàng)研究中CRE檢出率較高，其中克雷伯菌屬對(duì)美羅培南的耐藥率高達(dá)44.1%。以上數(shù)據(jù)顯示我院腸桿菌科細(xì)菌尤其是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥率呈快速上升趨勢(shì)。無(wú)疑我院臨床抗感染治療已面臨著CRE菌株的巨大挑戰(zhàn)。

本研究中除摩根摩根菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、普羅威登菌、黏質(zhì)沙雷菌等多黏菌素天然耐藥菌株［8］，其他腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素耐藥率尚低。值得關(guān)注的是，黏質(zhì)沙雷菌作為多黏菌素天然耐藥菌株，其耐藥率僅為44.7%，機(jī)制有待進(jìn)一步探索。我國(guó)大陸地區(qū)多黏菌素尚未被審批用于臨床，非天然耐藥菌株中，克雷伯菌屬、大腸埃希菌、腸桿菌屬等中檢出多黏菌素耐藥菌株，可能由于基因組DNA的自發(fā)性突變，也有文獻(xiàn)資料表明在牛乳腺炎中分離到多黏菌素耐藥菌株，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料表明我國(guó)是世界上多黏菌素用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最多的國(guó)家之一，接受多黏菌素治療過(guò)的牲畜也成為多黏菌素耐藥菌株的一個(gè)傳播源［6， 14］。

多黏菌素耐藥CRE菌株感染治療選擇非常有限且常伴發(fā)高病死率，本研究中僅4.4%CRE菌株同時(shí)對(duì)多黏菌素耐藥，耐藥率尚低，但應(yīng)引起臨床重視。多項(xiàng)研究表明產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌為體外多黏菌素穩(wěn)定耐藥常見(jiàn)型別，尤其是在低劑量多黏菌素誘導(dǎo)下更易出現(xiàn)［15］，近期一有關(guān)β內(nèi)酰胺酶與多黏菌素耐藥性關(guān)聯(lián)的全球性監(jiān)測(cè)項(xiàng)目也表明，產(chǎn)KPC腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素敏感性相對(duì)較低［16］，本研究中blaKPC基因主要見(jiàn)于克雷伯菌屬（129/315，41.0%），且已檢測(cè)出1株blaKPC陽(yáng)性肺炎克雷伯菌對(duì)5種抗菌藥物全耐藥（MIC≥128 mg/L），盡管目前非天然耐藥腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素仍保持著較高的敏感性，但應(yīng)注意合理用藥，盡量延緩產(chǎn)KPC腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素的敏感性下降。

多黏菌素天然耐藥菌株中，8.3%黏質(zhì)沙雷菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)及多黏菌素耐藥且同時(shí)耐藥菌株中blaKPC檢出率可達(dá)71.4%，阿根廷耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明黏質(zhì)沙雷菌等多黏菌素天然耐藥菌在臨床的感染率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［17］，對(duì)這種攜帶可轉(zhuǎn)移blaKPC耐藥基因的多黏菌素天然耐藥菌株，應(yīng)該加強(qiáng)臨床監(jiān)測(cè)。

綜上所述，我院臨床分離的主要腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素的耐藥率較低，但CRE菌株檢出率高。多黏菌素雖然目前已成為臨床治療CRE菌株所致感染的重要選擇，但應(yīng)合理用藥，盡量避免多黏菌素耐藥菌株的出現(xiàn)甚至暴發(fā)流行。

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中圖分類(lèi)號(hào)：R378.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-7708（2016）03-0373-04

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.022

收稿日期：2015-11-18 修回日期：2016-03-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81273559）；國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX09303004-001）。

作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040。

作者簡(jiǎn)介：孫麗（1990—），女，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

通信作者：胡付品，E-mail：hufupin@163.com。

Analysis of polymyxin susceptibility in Enterobacteriaceae

SUN Li， GUO Yan， YANG Yang， XU Xiaogang， YANG Fan， HU Fupin.
（Institute of Antibiotics， Huashan Hospital， Fudan University， Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibioties， Ministry of Health， Shanghai 200040， China）

Abstract:Objective To investigate the distribution and antimicrobial susceptibility of clinical strains of Enterobacteriaceae isolated from Huashan Hospital in 2014. Methods Enterobacteriaceae were isolated from January to August 2014. Antimicrobial susceptibility testing was performed by agar dilution method. The blaKPCgene was screened by PCR and DNA sequencing. Results were analyzed by WHONET 5.6 software. Results A total of 719 strains of Enterobacteriaceae were collected， of which Klebsiella spp.， and E .coli accounted for 43.8% （315/719） and 30.4% （219/719）， respectively. Resistance rates of Klebsiella spp.， E. coli，and Citrobacter spp.， to polymyxin B and polymyxin E were low （＜3%）. The percentage of the Enterobacter strains resistant to polymyxin B and polymyxin E was 10.9% and 11.1%， respectively. About 47.5% and 44.7% of the Serratia strains were resistant to polymyxin B and polymyxin E， respectively. More than 90% of the Morganella and Proteus isolates were resistant to polymyxin B or polymyxin E. The carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains were mainly identifed in Klebsiella isolates， more than 40% of which were resistant to meropenem and ertapenem， but only 2.9% and 2.6% were resistant to polymyxin B and polymyxin E， respectively. Ertapenem resistance was identified in 27.8% of the Citrobacter isolates and 17.9% of the Serratia isolates. Less than 10% of the other Enterobacteriaceae strains were resistant to carbapenem. Overall， 20.7% （149/719） of the isolates were blaKPCpositive， mainly in K. pneumoniae （129/315，41.0%）. Seven strains of Serratia marcescens and 2 strains of K. Pneumoniae were resistant to both carbapenems and polymyxin. Conclusions The clinical isolates of Klebsiella，E. coli， Enterobacter and Citrobacter in 2014 were still highly susceptible to polymyxin antibiotics.

Key words:Enterobacteriaceae； carbapenem-resistant；polymyxin； blaKPC