致陰道病的白念珠菌多位點序列分型分析及遺傳多樣性

王志恒，應(yīng)春妹，趙　虎

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致陰道病的白念珠菌多位點序列分型分析及遺傳多樣性

王志恒1，應(yīng)春妹2，趙虎1

摘要：目的 對上海市3所婦產(chǎn)科醫(yī)院分離的114株白念珠菌進行分子流行病學研究，分析本地?？漆t(yī)院分離的白念珠菌主要基因型別與菌株耐藥關(guān)系，并了解菌株間遺傳多樣性與種群分類關(guān)系。方法 收集來自復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、上海市第一婦幼保健院和國際和平婦幼保健院共114株白念珠菌，采用eBURST進行菌株親緣性分析，多位點序列分型（MLST）方法進行分型，并采用ATBTM FUNGUS 3試劑盒作真菌體外藥物敏感試驗。結(jié)果 114株菌株中共有47種DST型（diploid strain types， DST），其中已知30種，主要組群為DST 79和DST 435。114株白念珠菌對氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑敏感率分別為96.5%、100%、85.1%、55.2%、84.3%。結(jié)論 上海地區(qū)不同婦產(chǎn)科醫(yī)院致病性白念珠菌呈多克隆系，但主要為DST 79和DST 435型，且具有一定耐藥性。通過應(yīng)用MLST分型方法，初步發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)白念珠菌具有遺傳多樣性，且種群分類與基因分型具有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：白念珠菌； 多位點序列分型； 基因分型

念珠菌性陰道病是一種常見婦科疾病，發(fā)病率僅次于細菌性陰道病。有研究表明，念珠菌性陰道病致病念珠菌85%～95%為白念珠菌［1］。白念珠菌陰道病危害嚴重，不僅會造成陰道瘙癢引起生活質(zhì)量下降，而且可以通過影響精子運動引發(fā)不孕，極少數(shù)患者會導(dǎo)致早產(chǎn)及胎兒發(fā)育不良，也可引起宮頸糜爛、輸卵管炎及盆腔炎［2］。隨著臨床抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，真菌耐藥性也越益嚴重。對真菌耐藥基因的檢測有助于抗真菌藥物的選擇，但真菌基因型隨著環(huán)境與時間的變化會產(chǎn)生一系列突變，最終導(dǎo)致其耐藥性的產(chǎn)生［3］。多位點序列分型（MLST）是一種基于核酸序列測定的分型方法，能對基因結(jié)構(gòu)高度多態(tài)性的致病性真菌進行分型和遺傳分組，并能很好地區(qū)分來自同一種群或地區(qū)的菌株，其具有很高的分辨能力，適于分子流行病學研究和分子進化學研究。本研究采用MLST方法對3所醫(yī)院114株引起念珠菌陰道病的白念珠菌進行基因分型并探索其基因的變化過程。

1　材料與方法

1.1菌株來源及鑒定保存

收集2013年11月—2014年1月臨床分離白念珠菌114株，其中 29株來自國際和平婦嬰保健院，26株來自上海市第一婦嬰保健院，59株來自復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，菌株均分離自患有念珠菌性陰道病女性的陰道分泌物，患者年齡21～56歲。陰道分泌物標本收集后立即接種于 YPD（yeast extract peptone dextrose medium，YPD，上海生工生物工程科技有限公司）瓊脂平皿和科瑪嘉顯色平皿（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司），置于35℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 ～48 h，YPD瓊脂平皿上菌落呈奶酪色，表面濕潤光滑且邊緣整齊；科瑪嘉顯色平皿上菌落呈翠綠色；涂片鏡檢，見鏡下圓形或卵圓形菌體或孢子及假菌絲，則鑒定為白念珠菌。

1.2方法

1.2.1 DNA制備、擴增和測序 使用Biospin真菌基因組DNA抽提試劑盒（BioFlux公司）抽提白念珠菌基因組DNA， NanoDrop2000測量DNA濃度，用雙蒸水稀釋至100～200 ng/μL。本實驗中使用白念珠菌的7個管家基因及其PCR擴增引物見表1。PCR總反應(yīng)體系為30 μL，包括：基因組DNA 50 ng，2×MasteMix 15 μL， 10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，用去離子水補充至30 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物測序由華大基因公司完成。1.2.2 測序結(jié)果分析和MLST 利用BioEdit以及DNAStar對菌株管家基因的測序結(jié)果進行閱讀和比對；將7個管家基因與數(shù)據(jù)庫上相應(yīng)的等位基因進行比較，分別獲得每個菌株的等位基因型，并確定其DST型（diploid strain types， DST）。

表1　白念珠菌7種管家基因引物序列Table 1 Primers of 7 housekeeping genes of Candida albicans

1.2.3 菌株進化關(guān)系分析 采用eBURST進行菌株親緣性分析，并參照網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中下載的所有白念珠菌MLST信息，利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對菌株進行聚類分析和數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 真菌體外藥物敏感試驗 菌株分離純化后，使用酵母樣真菌敏感性檢測試劑盒（ATBTMFUNGUS 3，法國生物梅里埃公司）鑒定。該試劑盒包括氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑5種抗真菌藥物。以近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作為質(zhì)控菌株。

2　結(jié)果

2.1MLST分型結(jié)果

通過對114株白念球菌的7個管家基因的測序結(jié)果分析和在線比對，97株菌株為網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中已登記DST型，見表2。17株可能為新DST型，網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中尚未登記。

2.2菌株親緣性分析

由于17株菌落可能的DST型未在數(shù)據(jù)庫中登記，其DST型還沒有確定，因此，只對已登記的97株菌株進行分析。97株DST型菌株中，有30種不同的基因型。通過eBURST分析，30種基因型的白念球菌分2個主要克隆群：DST 79和DST 435，其中DST 79共有40株，占總數(shù)的35.1%（40/114），DST 435有 14株， 占 12.3% （14/114）。DST 1395有7株，DST 2627有4株，其他DST型菌株單個或雙個分散存在，為獨特型，見圖1。

表2　部分白念珠菌等位基因數(shù)和DST型Table 2 Allele number of selected genes and DST type of Candida albicans

通過與數(shù)據(jù)庫（http：//pubmlst.org/calbicans/）中世界各地不同DST型菌株進行eBURST比對分析發(fā)現(xiàn)，菌株群可分為多個分支，主要克隆群是DST 69，由DST 69菌株群向其他類型菌株分離進化。我們實驗中得到的DST 79是DST 69的一個直接分支，再由DST 79向DST 435方向進一步分型，見圖2。

2.3體外藥物敏感性試驗

114株白念珠菌中，所有菌株對兩性霉素B敏感，敏感率100%；110株對氟胞嘧啶敏感，占96.5%；97株對氟康唑敏感，占85.1%；63株對伊曲康唑敏感，占55.2%；96株對伏立康唑敏感，占84.3%。見表3。

2.4菌株進化與耐藥性關(guān)系分析

圖1　30種DST型菌株eBURST親緣性分析Figure 1 Phylogenetic analysis of 30 DST isolates by eBURST

利用SPSS對114株白念球菌進行聚類分析，采用Between-groups linkage聚類方法分析，結(jié)果見圖3。所有菌株主要分為8個分支，其中，主要克隆群DST 79和DST 435處于同一組中，其余分散存在的克隆以及未知DST型克隆分別在其他7個分支中。

圖2　DST 69、DST 79和DST 435克隆群分布圖Figure 2 Colony distribution of DST 69， DST 79 and DST 435

表3　114株白念珠菌對5種抗真菌藥物敏感率Table 3 Susceptibility of 114 strains of Candida albicans to 5 antifungal agents

將DST聚類分析與其相應(yīng)的耐藥性相比較，主要的耐藥菌株類型為DST 79、DST 435和DST 608等，見表4。通過將3所醫(yī)院取得的菌株分別統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院分離的菌株DST型種類最多，且主要的耐藥菌株類型是DST 79和DST 435；第一婦嬰保健院主要的耐藥菌株類型是DST 79；國際和平婦嬰保健院耐藥株比例較低，主要也為DST 79株。

3　討論

MLST作為基因分型的標準方法被廣泛應(yīng)用于微生物感染的分子流行病學研究中［4］。本研究采用MLST方法分析了上海3所婦產(chǎn)科醫(yī)院陰道分離的114株白念珠菌，主要結(jié)果：①分離自患者陰道分泌物的致病白念珠菌主要類型是DST 79 和DST 435克隆群；②DST 79和DST 435克隆群屬于祖源型菌株DST 69的一個分支型，也是本實驗中主要耐藥型菌株；③菌株主要分布于8個分支，DST 79和DST 435集中在同一分支，其余分散存在的克隆以及未知DST型克隆分別分在另外7個分支中。

本實驗發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株的基因型集中在DST 79、DST 435、DST 608、DST 1395、DST 2627 和DST 2897基因型，但這6種基因型菌株耐藥率并不是100%，且對不同藥物的耐藥率不同。DST 608型菌株雖然對其中3種藥物的耐藥率為100%，但由于該基因型菌株只有1株，不足以說明該基因型的確切耐藥情況。TAVANTI等［5］和ODDS 等［6］利用MLST方法也有類似的狀況，耐藥基因型也是散在不同分支中，且同一分支菌株耐藥率并不是100%。導(dǎo)致同類型菌株不同耐藥性的原因可能是不同基因型如特定位點雜合子或純合子差異等。

圖3　MLST分型結(jié)果聚類分析圖Figure 3 Cluster analysis of genotyping results of multilocus sequence typing

表4　不同DST型耐藥菌株統(tǒng)計Table 4 Summary of drug resistant strains in terms of DSTs

祖源型菌株DST 69菌株主要分離自美國、日本、馬來西亞、中東、新西蘭、英國和歐洲等［7- 8］國家和地區(qū)，而中國的白念珠菌主要以其分支為主，很少發(fā)現(xiàn)DST 69菌株。經(jīng)過比對，WU等［9］在上海某醫(yī)院中分離的白念珠菌DST 型在本實驗所有的分支中都有，表明上海地區(qū)人群中的白念珠菌具有較強的一致性。GONG等［10］通過對取自沈陽人群消化道的白念珠菌進行MLST發(fā)現(xiàn)，DST 1593和DST 142等是最常見的基因型，由此可見，不同地區(qū)的致病白念珠菌基因型群具有較大的差異。SHIN等［11］發(fā)現(xiàn)，從韓國人群中分離的菌株主要類型為DST 69和DST 732，包括了來自中國、韓國、日本等亞洲國家的菌種以及西方的主要菌種，表明白念珠菌可能隨著人群流動而播散。

白念珠菌作為一種條件致病性真菌，其基因組具有很大的變化潛能，經(jīng)過環(huán)境選擇的壓力，其染色體更易產(chǎn)生重組從而進化出具有較強的致病性特征［12］。因此，對白念珠菌的種群結(jié)構(gòu)、流行病學調(diào)查和念珠菌屬物種的系統(tǒng)發(fā)育分析，為臨床提供了有用的診斷信息。本實驗中發(fā)現(xiàn)的致病菌基因種類多樣，耐藥菌株種類集中，且主要為對伊曲康唑耐藥，而對氟胞嘧啶和兩性霉素B耐藥性非常低，因此，檢測白念珠菌類型可以更好地指導(dǎo)臨床用藥。

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2.復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗科。

中圖分類號：R379.4

文獻標識碼：A

文章編號：1009-7708（2016）03-0330-06

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.014

收稿日期：2015-08-31 修回日期：2015-12-02

作者單位：1.復(fù)旦大學附屬華東醫(yī)院檢驗科，上海 200040；

作者簡介：王志恒（1986—），男，碩士，初級技師，主要從事細菌耐藥性監(jiān)測和耐藥機制研究。

通信作者：趙虎，E-mail：hubertzhao@163.com。

Multilocus sequence typing and genetic diversity of Candida albicans in patients with vulvovaginal candidiasis

WANG Zhiheng， YING Chunmei， ZHAO Hu. （Department of Lobratory Medicine， Huadong Hospital Affliated to Fudan University， Shanghai 200040， China）

Abstract:Objective To investigate the molecular epidemiology of 114 C. albicans strains isolated from the vaginal discharge of female patients treated in three obstetrics and gynecology hospitals in Shanghai by analyzing the relationship between the main genotypes and resistance profle， and the relationship between genetic diversity and cluster of C. albicans. Methods A total of 114 strains of C. albicans were collected from the Obstetrics & Gynecology Hospital of Fudan University， Shanghai First Maternity and Infant Hospital Corporation and the International Peace Maternity & Child Health Hospital of China welfare institute. Phylogenetic analysis of strains were carried out by eBURST. C. albicans strains were also analyzed by multilocus sequence typing （MLST）. The susceptibility of the C. albicans strains was tested by ATB FUNGUS 3. Results A total of 47 diploid strain types （DSTs） were identifed from the 114 strains， 30 of which were known types. DST 79 and DST 435 were the main types. Of the 114 C. albicans strains， 96.5% were susceptible to fucytosine， 100% to amphotericin B， 85.1% to fuconazole， 55.2% to itraconazole and 84.3% to voriconazole. Conclusions The pathogenic C. albicans strains isolated from different obstetrics and gynecology hospitals in Shanghai were originated from multiple clones， the main type of which was DST 79 and DST 435 with certain degree of antifungal resistance. MLST typing suggests that genetic diversity is present in the C. albicans strains isolated in Shanghai area. The clustering analysis of C. albicans strains is consistent with its genotypes.

Key words:C. albicans； multilocus sequence typing； genotyping