纖維素酶輔助青稞粉提取淀粉工藝研究

趙彥巧，朱志勇，王凱，李建穎（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

纖維素酶輔助青稞粉提取淀粉工藝研究

趙彥巧，朱志勇，王凱，李建穎*
（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

采用纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉，以淀粉提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH4個(gè)主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳的提取工藝條件，并將其應(yīng)用于超聲中試放大試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，加酶量、酶解溫度以及酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用對(duì)淀粉提取率有顯著影響。試驗(yàn)范圍內(nèi)獲得的最佳提取工藝條件為：加酶量100U/g、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間6h、pH4.8，此時(shí)，淀粉提取率為80.02%。中試放大試驗(yàn)結(jié)果表明，正交試驗(yàn)所確定的最佳提取工藝穩(wěn)定。

青稞；淀粉；提?。焕w維素酶

青稞，是生長(zhǎng)在我國(guó)西北、西南特別是西藏、青海一帶的一種在地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著極其重要地位的糧食作物，青稞的淀粉平均含量為59.25%，蛋白質(zhì)平均含量為11.31%，β-葡聚糖平均含量為5%，遠(yuǎn)高于其他谷類(lèi)作物，粗脂肪平均含量為2.13%，此外還含有豐富的水分、纖維和鉬、鉻、硒、鋅等12種人體所需的微量元素［1］。

青稞淀粉具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，而尋找一條簡(jiǎn)便高效的青稞淀粉提取工藝路線(xiàn)已成為當(dāng)前促進(jìn)青稞淀粉利用急需解決的重要問(wèn)題之一。本試驗(yàn)采用纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH等因素對(duì)淀粉提取率的影響程度，并用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉的最佳工藝條件，提高淀粉提取率，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行超聲中試放大試驗(yàn)，為建立理想的青稞淀粉提取工藝路線(xiàn)及青稞淀粉的利用奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

青稞：產(chǎn)于云南香格里拉縣；纖維素酶，酶活力（U/ g）≥10 000；α-淀粉酶，酶活力（U/g）≥3 700；羧甲基纖維素鈉、乙醚、碘、碘化鉀、濃鹽酸、乙醇（95%）、氫氧化鈉、次甲基藍(lán)、硫酸銅、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、無(wú)水硫酸鈉、冰醋酸、醋酸鈉等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

AUY-220電子分析天平：日本SHIMADZU（島津）公司；WE-3水浴恒溫振蕩器、EMS-2型加熱定時(shí)磁力攪拌器、XMTD-204型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DGG-H-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SK5210LHC超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；PHS-3B型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-7504型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；DL-6000型低速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；3-18K低溫高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；TGCXZ-B5組合式超聲循環(huán)提取機(jī)：北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1酶解輔助淀粉提取工藝

酶解輔助淀粉提取工藝流程參考Puchongkavarin H［2-3］、張玉玉［4］等的淀粉提取工藝并加以改進(jìn)，提取工藝如下：青稞粉過(guò)100目篩、稱(chēng)重，按一定料液比加水浸泡制漿，加入纖維素酶、恒溫振蕩水浴酶解一定時(shí)間；將酶解液在5 000 r/min進(jìn)行第一次離心，離心10 min，倒出上清液，刮去上層（暗黃色層），取下層（白色層）；將第一次離心得到的下層（白色層）加水制漿，過(guò)200目篩后，淀粉漿在5 000 r/min進(jìn)行第二次離心，離心10 min，倒出上清液，小心刮去上層（灰色層），收集下層產(chǎn)品；自然條件干燥24 h，得青稞淀粉。

1.2.2淀粉提取率的計(jì)算

1.2.3淀粉含量的測(cè)定

依據(jù)GB/T 5009.9-2008《食品中淀粉的測(cè)定》淀粉酶水解法并加以改進(jìn)測(cè)定淀粉含量。

1.2.4纖維素酶比活力的測(cè)定

采用普遍使用且結(jié)果較為準(zhǔn)確的CMC-DNS法［5-6］測(cè)定纖維素酶的比活力。

1.2.5超聲輔助中試放大試驗(yàn)

中試放大試驗(yàn)將小試劑量放大50倍，稱(chēng)取1000g過(guò)100目篩青稞粉原料，按料液比1∶4（g/mL）加入蒸餾水，采用TGCXZ-B5組合式超聲循環(huán)提取機(jī)，超聲條件為：超聲時(shí)間10 min，頻率30 kHz，間歇比30 s/5 s。超聲后加入纖維素酶，控制各工藝條件與正交優(yōu)化確定的最佳條件一致。

2　結(jié)果與討論

2.1青稞原料中淀粉含量

經(jīng)測(cè)定，本試驗(yàn)所選用的青稞原料的平均淀粉含量為56.77%，與文獻(xiàn)［1］報(bào)道的淀粉平均含量59.25%相當(dāng)，可以作為試驗(yàn)原料進(jìn)行酶解輔助青稞粉提取淀粉的工藝研究。

2.2料液比對(duì)青稞淀粉提取的影響

在纖維素酶加入量80 U/g、提取溫度50℃、提取時(shí)間8h的條件下，分別按料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g/mL）進(jìn)行青稞淀粉的提取，探討料液比對(duì)其淀粉提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　料液比對(duì)淀粉提取率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on starch extraction yield

可以看出，淀粉提取率隨著料液比的增大而逐漸提高。在料液比為1∶3（g/mL）時(shí)，由于漿液黏度較大，分子擴(kuò)散速率較低，體系分散不均勻，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，因此，淀粉提取率較低。當(dāng)料液比≥1∶5（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大。若再繼續(xù)增加料液比，對(duì)淀粉提取率無(wú)明顯影響。因此，料液比以1∶5（g/mL）為宜。

2.3加酶量對(duì)青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、提取溫度50℃、提取時(shí)間8 h的條件下，分別按加酶量為50、60、70、80、90、100U/g進(jìn)行青稞淀粉的提取，探討加酶量對(duì)其淀粉提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

可以看出，隨加酶量的增加，淀粉提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，淀粉提取率最大值出現(xiàn)在加酶量為90 U/g時(shí)。當(dāng)加酶量較少時(shí)，由酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可知，加酶量成為酶促反應(yīng)的主要限制因素，此時(shí)酶濃度與反應(yīng)速度呈正比關(guān)系［7］。當(dāng)加酶量為90 U/g時(shí)，酶濃度達(dá)到飽和，故提取率達(dá)到最大值。當(dāng)加酶量超過(guò)90 U/g時(shí)，淀粉提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。纖維素酶是一種復(fù)合酶，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等3種酶，作用機(jī)制較為復(fù)雜［8-9］。此時(shí)，漿液中的其它成分可能與纖維素酶作用，影響纖維素酶對(duì)植物細(xì)胞壁的降解。此外，纖維素酶系中一般還含有一定量的淀粉酶作為輔酶［10］，故當(dāng)加酶量過(guò)大時(shí)，其含有的淀粉酶可能降解淀粉，使提取率降低?？疾旒用噶颗c其他因素的交互作用，故選取80、90、100 U/g進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4酶解時(shí)間對(duì)青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、纖維素酶加入量80 U/g、提取溫度50℃的條件下，分別提取2、4、6、8、10、12、24 h，探討提取時(shí)間對(duì)其淀粉提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 加酶量對(duì)淀粉提取率的影響Fig.2　Effect of added-amount of cellulase on starch extraction yield

圖3　酶解時(shí)間對(duì)淀粉提取率的影響Fig.3　Effect of enzymatic time on starch extraction yield

可以看出，隨酶解時(shí)間的增加，淀粉提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，最大值出現(xiàn)在酶解時(shí)間為6 h。在酶促反應(yīng)初期，酶活性及反應(yīng)速率均較高，隨酶解時(shí)間的增加，淀粉提取率不斷增加。但當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)6 h后，酶促反應(yīng)基本進(jìn)行完全，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)造成離心時(shí)過(guò)多的B淀粉與戊聚糖類(lèi)物質(zhì)粘連，從而導(dǎo)致提取率下降［11］?？紤]酶解時(shí)間與其他因素可能存在交互作用，故選取4、6、8 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5酶解溫度對(duì)青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、纖維素酶加入量80 U/g、提取時(shí)間8 h的條件下，控制提取溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，探討提取溫度對(duì)其淀粉提取率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　酶解溫度淀粉對(duì)提取率的影響Fig.4　Effect of enzymatic temperature on starch extraction yield

可以看出，酶解溫度對(duì)淀粉提取率的影響較為顯著，隨酶解溫度的增加，淀粉提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，最大值出現(xiàn)在酶解溫度為45℃時(shí)。溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響一般呈現(xiàn)鐘罩形曲線(xiàn)［12］，主要是由于溫度較低時(shí)，升溫有利于加快反應(yīng)速率，而當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)變性而使酶失活；此外，較高的溫度也可能使提取出的淀粉糊化而影響淀粉提取效果，因此提取率在酶解溫度超過(guò)45℃后開(kāi)始下降。故選取40、45、50℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.6pH對(duì)青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、纖維素酶加入量80 U/g、提取溫度50℃、提取時(shí)間8 h的條件下，分別調(diào)節(jié)浸提液的pH為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6，探討pH對(duì)其淀粉提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5pH對(duì)提取率的影響Fig.5　Effect of pH on starch extraction yield

可以看出，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨pH的增加，淀粉提取率先增大后減小，提取率最大值出現(xiàn)在pH為4.4時(shí)。pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響一般也呈鐘罩形曲線(xiàn)，存在酶的最適pH［10］。pH是酶促反應(yīng)的主要影響因素之一，故選取pH為4.0、4.4、4.8 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.7正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 4個(gè)因素對(duì)淀粉提取率的影響，并考慮酶解時(shí)間和酶解溫度、酶解時(shí)間和加酶量以及酶解溫度和加酶量三組交互作用，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化，以淀粉提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以確定提取青稞淀粉的最佳工藝條件，因素水平表見(jiàn)表1。選用L27（313）表，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表Table 2　The result and range analysis of orthogonal test

表1　正交試驗(yàn)的因素水平表Table 1　Factor-levels of orthogonal test

由表2可以看出，各因素對(duì)淀粉提取率的影響次序是：C（加酶量）＞B（酶解溫度）＞A×B＞A×C＞A（酶解時(shí)間）＞B×C＞D（pH）。影響淀粉提取率的主要因素是C、B 和A×B，其他因素和交互作用的影響均較小。因素水平的選取，C應(yīng)取C3，B應(yīng)取B2。因素A和B的交互作用很大，甚至超過(guò)了因素A的單獨(dú)作用，因此必須考慮因素A和B水平的最優(yōu)搭配。根據(jù)表2，列出二元分析表如表3所示。

表3　A、B交互作用二元分析表Table 3　Bivariate analysis of the interaction between factor A and B

由表3可見(jiàn)，A2B2的淀粉提取率最高，與單獨(dú)考慮因素A和B的結(jié)果一致。由于因素D的影響最小，可任取一水平，考慮到提取工藝的經(jīng)濟(jì)性和簡(jiǎn)便性以及對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中設(shè)備的耐酸性要求，宜選擇較高的pH，即取D3。最后得到試驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即當(dāng)加酶量為100 U/g，調(diào)節(jié)pH 4.8，在45℃下酶解6 h時(shí)，淀粉提取效果最佳。

根據(jù)正交優(yōu)化試驗(yàn)確定的最佳提取工藝條件進(jìn)行酶解輔助青稞粉提取淀粉驗(yàn)證試驗(yàn)，做3組試驗(yàn)取平均值，淀粉提取率為80.02%，與正交優(yōu)化試驗(yàn)中A2B2C3D3組合（正交試驗(yàn)號(hào)15）的提取率79.52%接近，證明該優(yōu)化工藝條件較為穩(wěn)定，可以進(jìn)行中試放大試驗(yàn)。

2.8超聲中試放大試驗(yàn)的結(jié)果與分析

在正交優(yōu)化試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行超聲中試放大試驗(yàn)，中試放大試驗(yàn)的結(jié)果顯示，青稞淀粉提取率為83.54%，淀粉提取率較正交試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果有所提高，其原因可能是超聲有利于青稞細(xì)胞壁的破碎從而使淀粉更多的溶出，淀粉提取率上升。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉，以淀粉提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 4個(gè)主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉的最佳工藝條件，并進(jìn)一步進(jìn)行超聲中試放大試驗(yàn)，得出如下主要結(jié)論。

1）在試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)淀粉提取率的影響次序是：C（加酶量）＞B（酶解溫度）＞A×B＞A×C＞A（酶解時(shí)間）＞B×C＞D（pH），其中加酶量、酶解溫度以及酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用對(duì)提取率有顯著影響。

2）在試驗(yàn)范圍內(nèi)，纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉的最佳工藝條件為：當(dāng)加酶量為100 U/g，調(diào)節(jié)pH 至4.8，在45℃下酶解6 h時(shí)，淀粉提取效果最佳，提取率為80.02%。

3）通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)及超聲中試放大試驗(yàn)可以認(rèn)為試驗(yàn)確定的最佳提取工藝條件較為穩(wěn)定，通過(guò)酶解輔助青稞粉提取淀粉的最終產(chǎn)率達(dá)80%左右，提取效果良好，可以為建立適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模的酶解輔助青稞粉提取淀粉的工藝路線(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

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Study on Starch Extraction from Highland Barley Flours Assisted by Cellulase

ZHAO Yan-qiao，ZHU Zhi-yong，WANG Kai，LI Jian-ying*
（College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Starch was extracted from highland barley flours assisted by cellulose.In order to find the best conditions of enzymatic hydrolysis，with the starch extraction yield as the evaluation index，an orthogonal test was adopted to investigate added-amount of cellulase，enzymatic time，enzymatic temperature and pH value based on the results of single-factor tests.According to the best extraction conditions obtained，ultrasonic pilot enlarge experiment was carried out.The result of the orthogonal optimization test showed that added-amount of cellulase，enzymatic temperature，as well as the interaction between enzymatic time and enzymatic temperature have significant effects on the starch extraction yield.The best extraction conditions would be：added-amount of cellulase was 100 U/g，enzymatic temperature was 45℃，enzymatic time was 6 h and pH value was 4.8，under which the starch extraction yield from highland barley was 80.02%.The result of the ultrasonic pilot enlarge experiment indicates that the best extraction conditions obtained by the orthogonal optimization test were stable.

highland barley；starch；extraction；cellulase

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.022

天津市高?！皟?yōu)秀青年教師資助計(jì)劃”；天津市高校科技發(fā)展基金項(xiàng)目（140023）；天津市教育科學(xué)“十二五”規(guī)劃重點(diǎn)研究課題（HE3024）；天津市科學(xué)技術(shù)普及項(xiàng)目（13KPXM01SY008）

趙彥巧（1979—），女（漢），副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物的提取與分離。
*

李建穎（1961—），女（漢），教授，碩士，研究方向：天然化合物提取和生物化工。

2015-04-08