氣相色譜法同時測定食品中的膽固醇和植物甾醇

陳月曉，何 濤，唐凌軒，徐佳佳，白沙沙，崔亞娟，*，何 梅，李 東，黃 華，路 勇（.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 00069；.北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 0004）

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氣相色譜法同時測定食品中的膽固醇和植物甾醇

陳月曉1，何 濤2，唐凌軒1，徐佳佳1，白沙沙1，崔亞娟1，*，何 梅1，李 東1，黃 華2，路 勇2
（1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100041）

建立氣相色譜法同時測定食品中植物甾醇和膽固醇含量的分析方法，測定植物甾醇含量較高的常見植物油和同時含有膽固醇及植物甾醇的樣品。采用5α-膽甾烷為內(nèi)標參照物，樣品經(jīng)皂化后提取，濃縮后正庚烷定容上機進樣分析。膽固醇和植物甾醇在0.001～2.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。方法的檢出限為0.3 mg/100 g，定量限為1.0 mg/100 g，該方法相較于液相色譜法能有效將膽固醇和植物甾醇進行分離，具有步驟簡單、重復性好、準確度和靈敏度高等特點。

氣相色譜法；膽固醇；植物甾醇

植物甾醇是存在于植物中的一大類化學物質(zhì)的總稱，其化學結(jié)構(gòu)是與膽固醇相似的一類甾體化合物，幾乎存在于所有的植物性食物中，最常見的包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇，其次是這些植物甾醇的飽和形式，即谷甾烷醇和豆甾烷醇等［1-2］。植物甾醇與膽固醇結(jié)構(gòu)類似，而生理學作用卻相差甚遠［3-5］。大量流行病學資料和實驗室研究證明，人體血清膽固醇增高，易增加心血管疾病的患病幾率。而攝入較多的植物甾醇與人群許多慢性病的發(fā)生率較低有關(guān)，如降低高膽固醇血癥、冠狀動脈硬化性心臟病、癌癥等疾病的危險性［6-9］。人體內(nèi)不能合成植物甾醇，也不能由膽甾醇轉(zhuǎn)化而成，只能由食物中攝取［10-12］。植物甾醇廣泛存在于植物中，在種子、植物油、蔬菜、水果等含量較多。自然界中最常見、含量最多的是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇等［13-16］。

目前對膽固醇和植物甾醇的測定方法有分光光度計法、酶法、液相色譜法［17］、薄層色譜法［18-19］、氣相色譜法［20-22］、氣相色譜-質(zhì)譜法［23-27］等。如比色法樣品前處理需要提取樣品中的脂肪，且容易受到其他甾醇和甘油三酯的干擾，造成結(jié)果的顯著偏大。操作繁雜、誤差大、重復性差，僅適用于動物性食品。酶法技術(shù)含量較高，特異性強，僅適用于動物性食品。液相色譜法采用波長205～210 nm檢測，如此低的檢測波長使得待測組分不能與實際樣品中的基體完全分離，而干擾其準確定量。氣相色譜法的選擇性較高，分離效果好。氣相色譜-質(zhì)譜法操作復雜，耗費更大。

本實驗定量采用內(nèi)標法，是一種間接、相對的校準方法，通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算，因而在一定程度上能校正和消除操作條件對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，提高分析結(jié)果的準確度。色譜條件對結(jié)果影響不大，準確度、精度較高，可克服進樣量的誤差對測量結(jié)果的影響，比較適用于多成分的測定方法。

因此有必要建立簡便、靈敏度和準確度較好的固醇類分析方法，有效分離并測定植物甾醇和膽固醇的含量，對估計居民攝入量有重要意義，也為科學指導居民膳食提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物油、牛奶餅干 市售。

5α-膽甾烷 美國AcrosOrganics公司；膽固醇（純度＞99%）、豆甾醇（純度＞95%）、β谷甾醇（純度＞95%）、豆甾烷醇（純度＞95%） 美國Sigma-Aldrich公司；菜油甾醇（純度＞95%） 美國ChromaDex公司；菜籽甾醇 日本Tama Biochemical公司；氫氧化鉀、體積分數(shù)95%乙醇溶液、無水乙醚、無水硫酸鈉（均為分析純） 北京化工廠；正庚烷（色譜純）美國Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC2010plus氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器）日本島津公司；萬分之一天平 德國Sartorius公司；磁力攪拌電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、分液漏斗振蕩器 東京理化公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

DB-5毛細管色譜柱（25 m×0.32 mm，0.17 μm）；氫火焰離子化檢測器；升溫程序：柱溫210 ℃，以12 ℃/min升至300 ℃，保持12.5 min；進樣口溫度270 ℃；檢測器溫度280 ℃；氫氣流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min；進樣量1 μL；分流比30∶1。

1.3.2 樣品制備

稱取適量樣品于皂化瓶中，依次加入2.0 mg/mL內(nèi)標物（5α-膽甾烷）、40 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液、8 mL質(zhì)量分數(shù)50% KOH溶液，將皂化瓶置于磁力攪拌電熱套中，連接冷凝裝置，回流冷凝（60±10）min，輕搖試樣保證完全皂化。回流冷凝結(jié)束后，關(guān)閉熱源，冷凝管上端加入60 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液。保持磁力攪拌，15 min后，將皂化瓶從冷凝管移下，冷卻至室溫。皂化液中加入100 mL乙醚溶液，將溶液轉(zhuǎn)移至500 mL干凈的分液漏斗中。加入110 mL 1 mol/L KOH溶液輕輕振搖，待分層清洗后，棄水層。加入40 mL 0.5 mol/L KOH溶液到分液漏斗，輕輕振搖10 s，棄去水層。用40 mL水清洗乙醚層溶液，待分層后棄去水相。反復水洗至少3 次。完成水洗后，將乙醚層從分液漏斗上通過有玻璃棉和20 g無水硫酸鈉的玻璃漏斗轉(zhuǎn)移到錐形燒瓶中，并于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（55±3） ℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無水。正庚烷5 mL定容，取適量于進樣瓶中，上機分析。

1.3.3 內(nèi)標溶液配制

精確稱取5α-膽甾烷100 mg于50 mL容量瓶，正庚烷溶解定容，得到2.0 mg/mL的內(nèi)標溶液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用氣相色譜法對待測組分進行測定，根據(jù)保留時間定性，峰面積定量。以5α-膽甾烷為內(nèi)標參比計算膽固醇和植物甾醇的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合標準溶液及樣品的色譜分離情況

使用單個標準溶液，注入氣相色譜儀，核準、確定各組分的保留時間后，將配制好的混合標準溶液注入氣相色譜儀，獲得出峰順序及保留時間，如表1所示。依據(jù)已建立的色譜條件將混合標準注入氣相色譜儀，如圖1A所示。代表樣品的氣相色譜分離情況如圖1B、C所示。從標準溶液及樣品的測定情況可見，膽固醇和植物甾醇各組分在此實驗條件下能實現(xiàn)良好分離。

表1 各組分的出峰順序及保留時間Table 1 Peak sequence and r etenti on times of cholesterol and p hytosterols

圖1 混合標準溶液 （ A）、植物油樣品（ B）、牛奶餅干樣品（ C）氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of mixed standards of cholesterol and phytosterols （A）， vegetable oil （B） and milk biscuits （C）

2.2 前處理方法的優(yōu)化

分別采用不同體積分數(shù)的氫氧化鉀-乙醇溶液進行皂化，并對皂化溫度和時間進行比較和優(yōu)化，最終確定在40 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液和8 mL質(zhì)量分數(shù)50% KOH溶液進行皂化，持續(xù)（60±10） min條件下能將樣品完全皂化。對標準品的衍生前后進行了上機對比，在儀器上的分離效果并無差異，因此確定為提取后直接上機測定。

2.3 混標溶液配制及標準曲線的建立

表2 混標溶液工作 液各組分的質(zhì)量濃 度Table 2 Thec on centrati on of eachc omp on ent in mixed st and ard wo rk in g soluti on

分別稱取適量菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、膽固醇、5α-膽甾烷、豆甾烷醇混合標準，配制為儲備液。用正庚烷分別稀釋為不同質(zhì)量濃度梯度的工作液，如表2所示，注入氣相色譜儀。結(jié)果顯示線性良好，如表3所示。

表3 混標溶液工作液各組分的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 L in earr egressi on equati on and correlati on c oefficient of each comp on ent in mixed stan da rd wo rk in g soluti on

2.4 加標回收實驗結(jié)果

選取花生油樣品進行加標回收率實驗，根據(jù)各成分的含量進行3 個不同質(zhì)量濃度（本底值的0.5、1、2 倍）的加標回收實驗，如表4所示。

表4 花生油樣品的加標回收率結(jié)果 （n =6 ）T abl e4 R esults of r ecov ery in s pike d pean ut oil （n =6）

由表4可知，膽固醇和植物甾醇各組分的加標回收率均在90%～110%之間，說明該方法的準確度達到要求。

2.5 方法的檢出限和定量限

本方法通過逐步稀釋標準溶液，根據(jù)信號與噪音的比值，確定標準溶液的檢出限，依據(jù)本方法最小定容體積為3 mL的情況下，最大稱樣量為5 g，計算得出方法的檢出限為0.3 mg/100 g，定量限為1.0 mg/100 g。

2.6 樣品的測定

如表5所示，本方法對于同時含有膽固醇及植物甾醇的樣品能夠有效進行分離并定量。在常見的植物油中一般不含有膽固醇或其含量很低；植物甾醇總含量最高的油脂種類是玉米油，高達1 339.54 mg/100 g，其次是樹莓籽油、米糠油、菜籽油；從植物甾醇種類分布方面來看通常是β-谷甾醇含量最高，其次是菜油甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇等。

表5 不同類別食用植物油中膽固醇和植物甾醇的含量Table 5 C on tents of cholesterol and phytosterols in edible vegetable oils

3 討 論

本實驗優(yōu)化了樣品前處理條件，利用氣相色譜儀，采用DB-5毛細管色譜柱對膽固醇和植物甾醇進行分離，內(nèi)標法定量。研究結(jié)果顯示在同時含有植物甾醇和膽固醇的樣品中，應用此方法能夠?qū)⑵溥M行良好的分離及定量，且膽固醇和植物甾醇各組分的線性及回收率結(jié)果良好。數(shù)據(jù)結(jié)果表明在常見植物油中一般不含膽固醇或含量很低；植物甾醇總含量最高的是玉米油，其次是樹莓籽油、米糠油、菜籽油；植物甾醇分布方面通常是β-谷甾醇含量最高，其次是菜油甾醇。

該方法相較于GB/T 22220—2008《食品中膽固醇的測定：高效液相色譜法》法測定膽固醇，能有效將樣品中的膽固醇和植物甾醇進行分離，減少樣品中植物甾醇成分對膽固醇測定的干擾。相較于氣相色譜-質(zhì)譜法節(jié)約成本，具有步驟簡單、重復性好、準確度和靈敏度高等特點。

［1］ 韓軍花， 楊月欣.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應用［J］.國外醫(yī)學（衛(wèi)生學分冊）， 2001， 28（5）： 285-291.

［2］ 周曉星， 蘇宜香.植物甾醇降膽固醇作用的研究現(xiàn)狀［J］.國外醫(yī)學（衛(wèi)生學分冊）， 2007， 34（2）： 101-105.

［3］ OSTLUND R E J.Phytosterols in human nutrition［J］.Annual Review of Nutrition， 2002， 22: 533-549.DOI:10.1002/jssc.200900180.

［4］ MIETTINEN T A， PUSKA P， GYLLING H， et al.Reduction of serum cholesterol with sitostanol-estermargarine in a mildly hypercholesterolemic population［J］.New England Journal of Medicine，1995， 333: 1308-1312.DOI:10.1056/NEJM199511163332002.

［5］ NIGON F， SERFATY-LACROSNIERE C， BEUCLER I， et al.Plant sterol-enriched margarine lowers plasma LDL inhyperlipidemic subjects with low cholesterol intake: effectof fibrate treatment［J］.Clinical Chemistry and Laboratory Medicine， 2001， 39（7）: 634-640.

［6］ 左玉.植物甾醇研究與應用［J］.糧食與油脂， 2012， 25（7）： 1-4.DOI：10.3969/j.issn.1008-9578.2012.07.001.

［7］ 朱俊東， 糜漫天.植物甾醇降低血膽固醇作用的研究進展［J］.重慶醫(yī)學， 2006， 35（19）： 1798-1800.DOI：10.3969/ j.issn.1671-8348.2006.19.039.

［8］ 張艷， 張麗， 王俊芳.植物甾醇對預防血管動脈硬化的作用［J］.西北國防醫(yī)學雜志， 2012， 33（4）： 466-468.

［9］ 張蕾， 陳慶森， 閆亞麗， 等.植物甾醇對心血管疾病作用的研究現(xiàn)狀［J］.食品科學， 2013， 34（23）： 344-350.DOI：10.7506/spkx1002-6630-201323069.

［10］ BERND G， GUNTHER S， de GUY B， et al.Plant sterols and cardiovascular disease: a systematicreview and meta-analysis［J］.European Heart Journal， 2012， 33（4）: 444-451.

［11］ AGOT L， AMUNDSEN P， LEIV O， et al.Plant sterol ester-enriched spread lowers plasma total and LDL cholesterol in children with familial hypercholesterlemia［J］.American Journal of Clinical Nurition，2002， 76（2）： 338-344.

［12］ 謝心美， 郝海鑫， 何劍斌.植物甾醇的生理功能及其應用［J］.草業(yè)科學， 2013， 30（12）： 2105-2109.

［13］ 韓軍花， 楊月欣， 馮妹元， 等.中國常見植物食物中植物甾醇的含量和居民攝入量初估［J］.衛(wèi)生研究， 2007， 36（3）： 301-305.DOI：10.3969/j.issn.1000-8020.2007.03.012.

［14］ 馮妹元， 韓軍花， 劉成梅， 等.常見精練油中植物甾醇測定方法的建立及含量分析［J］.中國食品衛(wèi)生雜志， 2006， 18（3）： 197-201.DOI：10.3969/j.issn.1004-8456.2006.03.002.

［15］ 彭浩， 陳文強， 鄧百萬.氣相色譜法測定食用菜籽油中植物甾醇的組成及含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學， 2006， 34（19）: 4830-4831.DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2006.19.005.

［16］ 王三永， 李曉光， 李春榮， 等.含脂肪食品中植物甾醇含量的氣相色譜法測定［J］.分析測試學報， 2001， 20（4）: 43-44.DOI:10.3969/ j.issn.1004-4957.2001.04.013.

［17］ 高瑜瑩， 裘愛泳， 潘秋琴， 等.植物甾醇的分析方法［J］.中國油脂，2001， 26（1）： 25-28.DOI：10.3321/j.issn：1003-7969.2001.01.011.

［18］ 楊虹， 姜元榮， 魏婷婷， 等.食用油中植物甾醇測定方法的優(yōu)化及含量分析［J］.中國糧油學報， 2011， 26（2）： 120-123； 128.

［19］ 李和， 李玉幗.植物油中常見的幾種植物甾醇的薄層色譜分離與鑒別［J］.中國油脂， 1997， 22（2）： 20-22.

［20］ 陳茂彬， 吳謀成.植物甾醇的毛細管氣相色譜分析方法研究［J］.中國糧油學報， 2004， 19（6）： 88-90.DOI：10.3321/ j.issn：1003-0174.2004.06.024.

［21］ Association of Official Analytical Chemists.AOAC official method 2007.03 campesterol， stigmasterol， and beta-sitosterol in saw palmetto raw materials and dietary supplements gas chromatography first action 2007［S］.

［22］ Association of Official Analytical Chemists.AOAC official method 994.10 cholesterol in foods direct saponifcation-gas chromatographic method frst action 1994［S］.

［23］ 薛芳， 戴亞， 李東亮， 等.煙草中植物甾醇的GC-MS分析［J］.化學研究與應用， 2012， 24（4）： 617-620.

［24］ 楊春英， 劉學銘， 陳智毅， 等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定14 種食用植物油中的植物甾醇［J］.2013， 28（2）： 123-128.DOI：10.3969/ j.issn.1003-0174.2013.02.026.

［25］ 徐響， 孫麗萍， 董捷， 等.氣相色譜-質(zhì)譜法測定蜂王漿中的植物甾醇組成［J］.食品科學， 2010， 31（18）： 317-320.

［26］ 張紅城， 董捷， 任向楠， 等.四種蜂花粉中植物甾醇的GC-MS分析［J］.2008， 29（12）： 522-524.DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2008.12.118.

［27］ TOIVO J， PHILLIPS K， LAMPI A M， et al.Determination of sterols in foods： recovery of free， esterifed， and glycosidic sterols［J］.Journal of Food Composition and Analysis， 2001， 14（6）： 631-643.DOI：10.1006/ jfca.2001.1019.

Simultaneous Determination of Cholesterol and Phytosterol in Foods by Gas Chromatography

CHEN Yuexiao1， HE Tao2， TANG Lingxuan1， XU Jiajia1， BAI Shasha1， CUI Yajuan1，*， HE Mei1， LI Dong1， HUANG Hua2， LU Yong2
（1.Beijing Research Institute for Nutritional Resources， Beijing 100069， China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment， Beijing 100041， China）

A method for the simultaneous determination of phytosterol and cholesterol in foods was established by gas chromatography （GC） in this research.Cholesterol， brassicasterol， campesterol， stigmasterol， β-sitosterol， and stigmasterol were quantifed using 5α-cholestane as the internal reference standard.Samples were saponifed before extraction and the extract was concentrated and diluted again with n-heptane before being injected into the chromatographic system.The results showed that cholesterol and phytosterols were separated well and displayed linear relationship over the concentration range of 0.001-2.5 mg/mL.The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） of this method were 0.3 and 1.0 mg/100 g，respectively.Compared with high performance liquid chromatography （HPLC）， the GC method could effectively separate cholesterol and phytosterols， with simpler operation， better reproducibility， and higher accuracy and sensitivity.

gas chromatography； cholesterol； phytosterol

10.7506/spkx1002-6630-201614032

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0180-04

陳月曉， 何濤， 唐凌軒， 等.氣相色譜法同時測定食品中的膽固醇和植物甾醇［J］.食品科學， 2016， 37（14）: 180-183.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614032. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yuexiao， HE Tao， TANG Lingxuan， et al.Simultaneous determination of cholesterol and phytosterol in foods by gas chromatography［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 180-183.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614032. http://www.spkx.net.cn

2015-11-05

首都居民膳食結(jié)構(gòu)研究與數(shù)據(jù)平臺搭建項目（Z141100002614013）；創(chuàng)新工程Ⅱ-3項目：食物中四類植物化學物檢測技術(shù)的開發(fā)改進及植物化學物配方食品加工方法研究項目（PXM2014-178102-000011）

陳月曉（1985—），女，助理研究員，碩士，研究方向為食物營養(yǎng)成分。E-mail：yuexiaochen@hotmail.com

*通信作者：崔亞娟（1979—），女，副研究員，博士研究生，研究方向為食物營養(yǎng)成分。E-mail：cuiyj66@163.com