高效液相色譜法同時(shí)測定棗果實(shí)中的有機(jī)酸和VC含量

馬倩倩，吳翠云，2，*，蒲小秋，王 德，孫亞強(qiáng)（.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)南疆特色果樹生產(chǎn)工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

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高效液相色譜法同時(shí)測定棗果實(shí)中的有機(jī)酸和VC含量

馬倩倩1，吳翠云1，2，*，蒲小秋1，王 德1，孫亞強(qiáng)1
（1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)南疆特色果樹生產(chǎn)工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

目的：建立棗果實(shí)中有機(jī)酸含量的高效液相色譜測定方法。方法：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法，水浴超聲、離心、膜過濾提取棗果實(shí)中的有機(jī)酸。色譜條件：色譜柱為Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.04 mol/mL KH2PO4溶液，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm。結(jié)果：在此色譜條件下，草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸和VC在30 min之內(nèi)得到基線分離。7 種有機(jī)酸和VC標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.998 9以上；精密度檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.98%～4.77%（n=5）；重復(fù)性檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%～2.19%（n=5）；回收率在91.35%～105.74%之間。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確、高效、便捷，適于棗果實(shí)中有機(jī)酸的測定。

高效液相色譜法；棗；有機(jī)酸；VC

酸棗（Ziziphus jujuba var.spinosa）和棗（Ziziphus jujuba Mill.）均為鼠李科棗屬植物，棗果實(shí)中含有豐富的黃酮類、五環(huán)三萜類、環(huán)磷酸腺苷、VC、膳食纖維、精油、醇溶性物質(zhì)等，不僅營養(yǎng)豐富而且具有很高的藥用和食療價(jià)值［1］。其果實(shí)除鮮食味美外，還可干制，研制糖果、飲料、冷飲、果酒、果脯等產(chǎn)品［2］。棗果實(shí)具有安神、鎮(zhèn)靜、健腦、補(bǔ)血、增強(qiáng)免疫力、抗癌等功效。在新疆獨(dú)特的氣溫與光照條件下棗果實(shí)的營養(yǎng)物質(zhì)含量均高于其原產(chǎn)地［3］。而有機(jī)酸和VC作為果實(shí)風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)的重要構(gòu)成因素，起到了調(diào)節(jié)風(fēng)味和增加營養(yǎng)的功效。因此研究棗果實(shí)中的有機(jī)酸和VC對于棗產(chǎn)品的開發(fā)和利用具有重要意義。

有機(jī)酸的測定通常采用滴定法［4］、分光光度法［5］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［6］、離子色譜法［7］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［8］等。目前，HPLC法對有機(jī)酸和VC的測定已經(jīng)成功應(yīng)用到葡萄［9］、南瓜［10］、沙棘［11］、藍(lán)莓［12］、蜜桃［13］、人參果［14］、柑橘［15］、李［16］、山楂［17］、菠蘿蜜［18］等果實(shí)中。周曉明等［9］采用HPLC法對新疆40 個(gè)有核和20 個(gè)無核葡萄品種中的酒石酸、檸檬酸和蘋果酸進(jìn)行了定量分析；夏春華等［18］發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜果肉中的有機(jī)酸主要為檸檬酸和蘋果酸，不同株系間有機(jī)酸含量和組分差異顯著；楊巍等［19］對不同前處理后‘澳洲青蘋’蘋果果實(shí)中有機(jī)酸組成和含量的變化進(jìn)行了分析，得出在常溫（25 ℃）條件下超聲振蕩提取15min為宜；孫延芳等［20］利用HPLC法檢測出了陜北地區(qū)酸棗干果、鮮果和果醬中有機(jī)酸和VC的含量；李衛(wèi)紅等［21］利用HPLC法測定出了冬棗中6 種有機(jī)酸的含量；Rodrigo等［22］對水果果汁中蘋果酸、酒石酸和VC進(jìn)行了檢測分析。但目前關(guān)于棗果實(shí)中有機(jī)酸和VC含量測定的報(bào)道較少，測定方法和條件也不盡相同，不利于研究者對文獻(xiàn)進(jìn)行對比分析。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種更加方便、快捷的針對棗果實(shí)中的有機(jī)酸和VC同步測定的HPLC法，同時(shí)對南疆地區(qū)駿棗和0604酸棗果實(shí)中主要有機(jī)酸和VC進(jìn)行定量分析，期待為棗果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的科學(xué)評價(jià)和棗產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用材料為塔里木大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站棗種質(zhì)資源圃中的駿棗和0604酸棗。

草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、VC標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；純凈水 娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀（配有G1311C型四元泵、G1329B自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4212B二極管陣列檢測器、OpenLAB CDS色譜工作站） 美國Agilent公司；Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 日本GL Sciences公司；FA1104N電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī) 德國Heraeus公司；雷磁PHSJ-4F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.04 mol/mL pH 2.4的KH2PO4-H3PO4緩沖溶液；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 有機(jī)酸對照品溶液制備

分別精密稱取適量酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、富馬酸、琥珀酸、VC，加入純凈水分別制成酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、富馬酸、琥珀酸、VC的10 mg/mL對照品儲備液。

1.3.3 混合對照品溶液的制備

分別精密吸取適量上述對照品儲備液，加水制成草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和VC分別為0.1、1、1、1、1、0.1、0.5、0.3 mg/mL的混合對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜待測。

1.3.4 樣品處理

參照張麗麗［23］、郭燕［24］等方法并有所改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取1 g果肉加入0.04 mol/L的KH2PO4研磨提取液冰浴研磨至勻漿，倒入離心管中，用0.04 mol/L的KH2PO4研磨提取液多次沖洗研缽，超聲20 min 后轉(zhuǎn)至4 ℃15 000 r/min離心20 min，取上清液，殘?jiān)貜?fù)提取，最后定容至10 mL容量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)1.3.3節(jié)方法配制不同質(zhì)量濃度有機(jī)酸混合對照品溶液在相同條件下，連續(xù)進(jìn)樣5 次平行測定。以質(zhì)量濃度（X）對峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照信噪比3∶1確定檢出限，結(jié)果見表1。

表1 7 種有機(jī)酸和VC測定的線性相關(guān)性Table 1 L in ear equati on s for determ in ati on of sevenorganicacids and vitam in C

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選擇KH2PO4作為流動(dòng)相，在對色譜條件的篩選過程中，發(fā)現(xiàn)隨著流動(dòng)相濃度和流速的升高，保留時(shí)間均有不同程度的延長，且分離度也越大；但流動(dòng)相濃度大、流速快時(shí)，磷酸鹽對泵和C18柱的損傷程度會(huì)增大，且流速越高，系統(tǒng)壓力也越大。當(dāng)柱溫升高時(shí)，保留時(shí)間提前，且分離度也越大，但鑒于溫度過高對有機(jī)酸揮發(fā)產(chǎn)生影響，因此綜合考慮，最終選擇KH2PO4的濃度為0.04 mol/L、流速為0.5 mL/min、柱溫為30 ℃。在此條件下，7 種有機(jī)酸和VC可實(shí)現(xiàn)基線分離，且分離度較高，結(jié)果見色譜圖1、2所示。

圖1 有機(jī)酸和VC的混合對照品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards of organic acids and vitamin C

圖2 駿棗果實(shí)樣品（A）、0604酸棗果實(shí)樣品（B）HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of Junzao jujube （A） and sour jujube （B）

表2 駿棗 果實(shí) 色譜 分析 數(shù)據(jù)Table 2 Analytical data of o rganica cids and vitam in Ci n Ju nzao jujub e by HP LC

表3 06 04酸 棗果 實(shí)中 有機(jī) 酸及 VC 含量 色譜 分析 數(shù)據(jù)Table 3 Analytical data of o rganica cids and vitam in Ci nsour jujube fruits by HP LC

由表2、3可知，6 種有機(jī)酸和VC的分離度較好，在此條件下，駿棗和0604酸棗果實(shí)樣品中6種有機(jī)酸和VC可實(shí)現(xiàn)有效分離，琥珀酸未檢測出。

2.3 精密度檢測結(jié)果

將1.3.2節(jié)方法配制的有機(jī)酸混合對照品溶液在相同條件下，連續(xù)進(jìn)行5 次平行測定，考察方法的精密度，根據(jù)其峰面積分別計(jì)算精密度，草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和VC的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）范圍在0.98%～4.77%之間，表明該方法的精密度良好。結(jié)果見表4。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）Table4 Results of p recisi on experiments （n= 5）

2.4 重復(fù)性檢測結(jié)果

按照1.3.3節(jié)方法制備同一份棗果實(shí)樣品5 份，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)其測得峰面積計(jì)算重復(fù)性（表5），在完熟期棗果實(shí)中未檢測出琥珀酸含量，得出草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、VC 的RSD范圍在0.88%～2.19%之間，表明該方法的重復(fù)性均達(dá)到分析的要求。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（n=5）Table5 Results of repeatability experiments（n= 5）

2.5 回收率測定結(jié)果

采用加標(biāo)回收法。按照1.3.3節(jié)方法分別制備5 份相同質(zhì)量且已知各組分含量的駿棗果實(shí)樣品，分別加入相同體積不同質(zhì)量濃度的有機(jī)酸對照品溶液，完全溶解后過0.22 μm微孔濾膜待測，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣。各有機(jī)酸的平均回收率在91.35%～105.74%之間，表明該方法準(zhǔn)確率較高，結(jié)果見表6。

表6 有機(jī)酸和VC加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 6 Recovery rates of seven organic acids and vitam in C spiked in samples （n= 5）

2.6 棗果實(shí)樣品有機(jī)酸和VC含量的測定

按照1.3.3節(jié)方法制備棗果實(shí)樣品溶液，設(shè)3 次重復(fù)，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣，測定駿棗、0604酸棗果實(shí)中有機(jī)酸和VC的組分和含量，見表7。

表7 棗果實(shí)中有機(jī)酸和VC的含量Table 7 C on tents o for ganicacids and vitam in C in jujubefruits

由表7可知，駿棗果實(shí)中有機(jī)酸以蘋果酸、檸檬酸和酒石酸為主，占總酸含量的85.46%，含量分別為9.58、2.71、2.34 mg/g，其次依次為奎寧酸2.28 mg/g、草酸0.19 mg/g、富馬酸0.01 mg/g，琥珀酸未檢測到，其中，VC含量為2.17 mg/g。0604酸棗果實(shí)中有機(jī)酸以蘋果酸、檸檬酸、酒石酸為主，占總酸含量的92.42%，分別為9.74、3.39、2.72 mg/g，其次是奎寧酸和草酸，分別為0.93 mg/g和0.37 mg/g，富馬酸含量較少為0.05 mg/g，未檢測到琥珀酸，VC含量為0.50 mg/g。在完熟期棗果實(shí)中除奎寧酸外酸棗中各有機(jī)酸含量均高于駿棗，而駿棗果實(shí)中VC含量高于0604酸棗。棗果實(shí)中6 種有機(jī)酸含量由高到低依次為：蘋果酸＞檸檬酸＞酒石酸＞奎寧酸＞草酸＞富馬酸。

3 討論與結(jié)論

綜上所述，棗果實(shí)中有機(jī)酸以蘋果酸為主，因此可將其歸為蘋果酸型果實(shí)，這與李紅衛(wèi)等［21］的研究結(jié)果一致。孫延芳等［20］利用HPLC法檢測得陜北地區(qū)酸棗鮮果中蘋果酸、酒石酸的含量分別為6.77、1.83 mg/g，本實(shí)驗(yàn)對0604酸棗的檢測與其研究結(jié)果相比，測得的含量相對較高，同時(shí)增加了對奎寧酸和富馬酸的定量分析且分離效果較好（圖1）。劉曉庚等［25］利用甲醇提取有機(jī)酸進(jìn)行色譜分析，測得南酸棗中有機(jī)酸21 種，鑒定出19 種，其中蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的含量分別為1.95、2.30、1.40 mg/g，本研究與以上研究結(jié)果的差異可能與有機(jī)酸的提取方法、檢測方法和酸棗品種的種源地不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器，Inertsil ODS-3色譜柱，以0.04 mol/L KH2PO4溶液為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為210 nm，有機(jī)酸和VC在30 min內(nèi)得到有效分離和定量，從而建立了一種快捷、高效測定棗果實(shí)中有機(jī)酸和VC的方法。本方法較傳統(tǒng)的有機(jī)酸測定方法靈敏度高，較氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［6］方便快捷。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)對南疆棗果實(shí)中的主要有機(jī)酸和VC進(jìn)行了快速定量分析，這對南疆棗產(chǎn)品的研發(fā)具有實(shí)用價(jià)值，為棗果實(shí)中有效成分的質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

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Simultaneous Determination of Organic Acids and Vitamin C in Jujube Fruits by HPLC

MA Qianqian1， WU Cuiyun1，2，*， PU Xiaoqiu1，WANG De1， SUN Yaqiang1
（1.Engineering Laboratory of Characteristic Fruit Tree Production in Southern Xinjiang， Xinjiang Production and Construction Corps，College of Plant Science， Tarim University， Alar 843300， China； 2.Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin， Tarim University， Alar 843300， China）

Objective: This study aimed to establish and validate a high performance liquid chromatographic （HPLC） method for the fast simultaneous determination of organic acids and vitamin C （VC） in jujube fruits.Methods: The analytes in samples were extracted ultrasonically in a water bath， centrifugated and purified by membrane filtration for analysis by HPLC with diode-array detection （DAD）.The chromatographic column used was Inertsil ODS-3 （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）.The separation was performed using 0.04 mol/L KH2PO4（pH 2.40） as mobile phase at 0.5 mL/min flow rate by isocratic elution.The column temperature and detection wavelength were set as 30 ℃ and 210 nm， respectively.Results: Under these chromatographic conditions， 7 organic acids and VC could be successfully separated in 30 minutes.The coefficients of determination （R2） of the standard calibration curves of the analyzed compounds were all above 0.998 9 and the precision expressed as relative standard deviations were between 0.98% and 4.77% （n = 5） and the repeatability RSDs were in the range of 0.88% to 2.19% （n = 5）.The mean recovery rates of seven organic acids and vitamin C were in the range of 91.35% to 105.74%.Conclusion: This method is an accurate， rapid， and applicable method to determine organic acids and vitamin C in jujube fruits.

high performance liquid chromatography （HPLC）； jujube； organic acid； vitamin C

10.7506/spkx1002-6630-201614026

S665.1

A

1002-6630（2016）14-0149-05

馬倩倩， 吳翠云， 蒲小秋， 等.高效液相色譜法同時(shí)測定棗果實(shí)中的有機(jī)酸和VC含量［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 149-153.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614026. http://www.spkx.net.cn

MA Qianqian， WU Cuiyun， PU Xiaoqiu， et al.Simultaneous determination of organic acids and vitamin C in jujube fruits by HPLC［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 149-153.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614026. http://www.spkx.net.cn

2015-12-11

兵團(tuán)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（2014CC006）；兵團(tuán)產(chǎn)學(xué)研重大專項(xiàng)（2013AA001-1）；

塔里木大學(xué)校長基金育種專項(xiàng)（TDYZZX201401）

馬倩倩（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡溥z傳育種。E-mail：maqianqianqc@sina.com

*通信作者：吳翠云（1968—），女，教授，研究方向?yàn)楣麡浞N質(zhì)資源與品種選育。E-mail：wcyby@163.com