鈦膠RP-HPLC法同時(shí)測定5 種維生素

耿 瑛，李 榮*，姜子濤，張發(fā)博（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

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鈦膠RP-HPLC法同時(shí)測定5 種維生素

耿 瑛，李 榮*，姜子濤，張發(fā)博
（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

采用鈦膠反相色譜柱，建立高效液相色譜法同時(shí)測定5 種維生素：煙酸、生物素、煙酰胺、葉酸和鈷胺素含量的檢測方法。研究5 種維生素的保留行為與磷酸緩沖鹽pH值、緩沖鹽類型及濃度、柱溫和流速的關(guān)系，得出了最優(yōu)色譜條件：于波長210 nm處檢測生物素和鈷胺素，于波長270 nm處檢測煙酸、煙酰胺和葉酸，磷酸鹽pH 7.0，濃度5.0 mmol/L，柱溫50 ℃，流速0.8 mL/min。分析5 種維生素保留的熱力學(xué)參數(shù)焓、熵和吉布斯自由能。煙酸、生物素、煙酰胺、葉酸和鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（R2＞0.999 0）；煙酸、生物素、煙酰胺、葉酸和鈷胺素的檢出限分別為6、10、20、22、8 ng/mL；5 種物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于1.36%；加標(biāo)回收率范圍為92.30%～107.20%。方法的精密度和準(zhǔn)確度均可滿足高效液相色譜法的測定要求。

鈦膠反相色譜柱；高效液相色譜法；維生素

隨著高效液相色譜在分析領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣，色譜填料的發(fā)展也引起越來越多的關(guān)注?，F(xiàn)在普遍使用的是硅膠色譜填料，但是它適用的pH值范圍窄（pH值通常為3～10），并存在對堿性化合物不可逆吸附的缺點(diǎn)。而能克服其弱點(diǎn)的鈦膠色譜填料，具有極其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，在pH 1～14范圍都能夠穩(wěn)定存在［1］，對堿性化合物具有很好的分離效果［2］，鈦膠基質(zhì)可以與含有羥基、磷酸、羧酸等基團(tuán)的化合物進(jìn)行結(jié)合［3］，且鈦膠色譜柱具有熱穩(wěn)定性，升高溫度使色譜柱具有較低的柱壓，有利于分析物的分離分析，利用這一特性可測出分析物保留時(shí)的熱力學(xué)常數(shù)ΔH°、ΔS°和ΔG°。由于這些優(yōu)于硅膠色譜柱的特點(diǎn)，近年來鈦膠作為色譜填料，吸引了眾多的國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行研究［4-8］。

Zhou Ting等［9］用鈦膠色譜柱分析了核苷酸以及它的中間體；Zhao Jing等［10］分析了大豆蛋白中的卵磷脂；Ozawa等［11］分析了嘌呤類化合物；?i?kovsky等［12］分析了昂丹司瓊及其相關(guān)的化合物；Liu Tenghao等［13］測定了飲料中的甜味劑；包榮等［14］分析了飲料中的咖啡因含量；杜麗霞等［15］分析了飲料中的檸檬黃含量；孫倩倩等［16］測定了飲料中的檸檬酸含量。這些研究表明，鈦膠是具有良好發(fā)展前景、性能優(yōu)異的色譜填料。

維生素對于維護(hù)人體健康、預(yù)防及治療多種疾病都有著重要的作用，目前出現(xiàn)了越來越多補(bǔ)充維生素的食品及保健品，因此對于維生素含量的分析與測定具有重要意義。文獻(xiàn)中采用硅膠色譜柱測定維生素的方法，大多采用了離子對試劑：辛烷磺酸鈉［17］、庚烷磺酸鈉［18-19］、三氟乙酸［20-22］和醋酸銨［23］。離子對試劑和色譜柱固定相結(jié)合會產(chǎn)生不可逆吸附，進(jìn)而影響固定相的活性位點(diǎn)，對色譜柱造成不可逆的傷害，縮短色譜柱的使用壽命。同時(shí)，由于VB12在維生素片中的含量少，文獻(xiàn)報(bào)道的方法對樣品中VB12含量的檢測低于檢出限［20］，或?qū)B12單獨(dú)進(jìn)行分析，不能與其他維生素同時(shí)分析［19］，影響了分析效果。Tan等［24］采用鈦膠正相色譜柱分析了VB1，鈦膠反相色譜柱對其他維生素的分析鮮見報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)采用鈦膠反相色譜柱建立對5 種維生素分離分析新方法，結(jié)果表明此法對5 種維生素能較好地分離檢測，同時(shí)，鈦膠色譜柱有較高的靈敏度，能夠不用復(fù)雜的前處理過程，可直接檢測出樣品中的鈷胺素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2 種維生素片、4 種飲料樣品 市購；煙酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：59-67-6；99.5%）、煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：98-92-0；99.0%） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；生物素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：58-85-5；98.0%） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：59-30-3；98.0%）、鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：68-19-9；98.0%） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（色譜級） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Heal Force SMART-N純水機(jī)上海圣科儀器設(shè)備有限公司；0.45 μm濾膜 上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠。

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀（可變波長檢測器）美國Agilent公司；FA1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Spectrometer Lambda 25 UV/VIS分光光度計(jì)美國Perkin-Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.0 mg/mL煙酸、煙酰胺和鈷胺素：準(zhǔn)確稱取20.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容至10 mL。2.0 mg/mL生物素和葉酸：準(zhǔn)確稱取20.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容至10 mL。儲備液置于4 ℃冰箱儲存避光保存。標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用儲備液按一定比例混合配制，用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0。

不同pH值和濃度的磷酸緩沖鹽溶液由50 mmol/L Na2HPO4和50 mmol/L NaH2PO4配制。

1.3.1.2 樣品處理

維生素片：取若干片維生素片，用研缽研細(xì)，準(zhǔn)確稱取粉末0.200 0 g，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容到10 mL，超聲溶解20 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液5 mL，用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，定容到10 mL，過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。飲料：取5 mL飲料，超聲脫氣，過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。

1.3.2 色譜條件

Titania Sachtopore-RP色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm，300 ?）。于波長210 nm處檢測生物素和鈷胺素，于波長270 nm處檢測煙酸、煙酰胺和葉酸。具體波長檢測為：0～3.15 min，270 nm；3.15～4.5 min，210 nm；4.5～10 min，270 nm；10～12 min，210 nm；12～20 min，270 nm。流動(dòng)相流速0.8 mL/min。

流動(dòng)相由水（溶液A）、甲醇（溶液B）和磷酸緩沖鹽（溶液C）組成，C在流動(dòng)相中的比例始終保持為10%。流動(dòng)相在0～2 min時(shí)，A為90%；2～12 min時(shí)，A 由90%降低到45%。以保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取10 μL進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察方法的線性范圍。

1.3.4 熱力學(xué)參數(shù)的測定

按照方法1.3.2節(jié)色譜條件，采用柱溫箱在5 個(gè)不同溫度條件下（30、40、50、60、70 ℃）對維生素進(jìn)行分離。根據(jù)公式（1）van't Hoff方程［12，25］，當(dāng)lnk′和1/T呈線性關(guān)系時(shí)，由斜率和截距可以計(jì)算維生素保留時(shí)間的焓變（ΔH°）和熵變（ΔS°）；不同溫度條件下的吉布斯自由能ΔG°由公式（2）計(jì)算：

式（1）中：k′為容量因子；R為氣體常數(shù)；T為絕對溫度/K；φ為相比。

按公式（3）計(jì)算容量因子k′：

式中：t為分析物的保留時(shí)間/min；to為色譜柱的死時(shí)間/min；通過測定不同色譜柱作用的水的保留時(shí)間作為死時(shí)間。

按公式（4）計(jì)算相比φ：

式中：VS是色譜柱中固定相的體積/mL；Vo是色譜柱的死體積/mL。

按公式（5）、（6）計(jì)算VS、Vo：

式中：VCOL為色譜柱的幾何體積/mL；F為流動(dòng)相的流速/（mL/min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

圖1 5 種維生素在200 ～400 nm的紫外吸收光譜Fig.1 UV spectra of five vitamins within200-400 nm

用紫外分光光度計(jì)分別對5 種維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液于波長200～400 nm處進(jìn)行掃描，如圖1所示，根據(jù)吸收曲線選擇生物素和鈷胺素選擇于波長210 nm處進(jìn)行檢測，煙酸、煙酰胺和葉酸于波長270 nm處進(jìn)行檢測。

2.2 pH值及其緩沖鹽的選擇

圖2 保留時(shí)間（a）、半峰寬（b）、柱效（c）與磷酸緩沖鹽pH值的關(guān)系Fig.2 Effects of phosphate buffer pH on retention time（a）， peak width at half height（b）and the number of plates （c）

按照1.3.2節(jié)方法，在磷酸緩沖鹽濃度5.0 mmol/L、流速0.8 mL/min、柱溫25 ℃時(shí)，選擇磷酸緩沖鹽pH值范圍為5.0～8.0對5 種維生素進(jìn)行分析，如圖2所示。

由圖2a可以看出，分析物在pH值為5.0時(shí)的保留時(shí)間都比較長，因?yàn)殡x子交換作用，PO43-離子與TiO2的表面結(jié)合，導(dǎo)致分析物的陽離子強(qiáng)的保留。當(dāng)pH值大于5.0時(shí)，分析物分子脫質(zhì)子化，離子交換作用減弱，因此，保留時(shí)間隨著pH值的增大而減小，與?i?kovsky等［12］分析的昂丹司瓊在鈦膠柱上的保留行為一致；隨著pH值增大，半峰寬呈現(xiàn)減小的趨勢，在pH值為7.0和8.0時(shí)最好（圖2b）；理論塔板數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢，在pH值為7.0 和8.0時(shí)最好（圖2c）；煙酰胺、葉酸和鈷胺素之間的分離效果很好，但是，在pH值為7.0時(shí)，生物素和煙酸的分離度為3.16，而pH值為8.0時(shí)，生物素和煙酸的分離度為2.74。綜合考慮，選擇pH值為7.0對5 種維生素進(jìn)行分析。

2.3 磷酸緩沖鹽濃度的選擇

按照1.3.2節(jié)方法，在pH 7.0、流速0.8 mL/min、柱溫25 ℃時(shí)，分別選取流動(dòng)相中磷酸緩沖鹽濃度為2.5、5.0、7.5 mmol/L和10.0 mmol/L進(jìn)行分析，如圖3所示。

圖3 保留時(shí)間 （ a）、半峰寬 （b ）、柱效 （c）與磷酸緩沖鹽濃度的關(guān)系Fig.3 Effect of phosphate buffer concentration on retention time （a），peak width at half height （b） and the number of plates （c）

由圖3a可以看出，隨著磷酸鹽濃度的增大，煙酸、生物素和煙酰胺的保留時(shí)間變化不大，而葉酸和鈷胺素的保留時(shí)間逐漸減小，因?yàn)榱姿岣鳛長ewis堿可以與鈦膠表面上的Lewis酸位點(diǎn)結(jié)合，這種競爭關(guān)系減弱了維生素在鈦膠上的保留；由圖3b、c可以看出，在2.5～7.5 mmol/L時(shí)，半峰寬呈減小趨勢，柱效呈增加趨勢，但當(dāng)磷酸鹽增加到7.5 mmol/L，這種減小的趨勢會有所降低，當(dāng)磷酸緩沖鹽濃度增加到10.0 mmol/L時(shí)，煙酸、生物素、煙酰胺的半峰寬會增加，煙酸、生物素、煙酰胺和鈷胺素的柱效降低。綜合考慮，選擇磷酸鹽濃度為5.0 mmol/L。

2.4 柱溫的影響

2.4.1 柱溫的選擇

按照1.3.2節(jié)方法，在pH 7.0、磷酸鹽濃度5.0 mmol/L、流速0.8 mL/min時(shí)，選擇柱溫30～70 ℃對5 種維生素進(jìn)行分析，如圖4所示。

圖4 保留時(shí)間 （a）、半峰寬 （b ）、柱效 （c）與柱溫的關(guān)系Fig.4 Effect of column temperature on retention time （a）， peak width at half height （b） and the number of plates （c）

從圖4a可以看出，隨著色譜柱溫度的升高，維生素的保留時(shí)間減少，說明5 種維生素在鈦膠反相色譜柱上的保留過程是放熱的。隨著溫度的升高，保留時(shí)間會減小，煙酸和生物素保留時(shí)間減小非常少，煙酰胺和鈷胺素保留時(shí)間有所減少，葉酸保留時(shí)間明顯減少；由圖4b可以看出，生物素、煙酰胺和鈷胺素的半峰寬減小，煙酸的半峰寬變化很小，而葉酸的半峰寬在50 ℃時(shí)最小，超過50 ℃半峰寬很寬；同時(shí)，增加柱溫可以減小柱壓，峰形變好；但是當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，煙酸、煙酰胺和葉酸的柱效會降低（圖4c），同時(shí)，煙酸和生物素的分離效果會變差，綜合考慮，選擇柱溫為50 ℃。

2.4.2 熱力學(xué)研究

按照1.3.4節(jié)方法，在30～70 ℃對5 種維生素進(jìn)行分析，如圖5，表1、2所示。

圖5 不同溫度條件下鈦膠色譜柱分離分析物的 v a n 't Ho f f曲線Fig.5 van't Hoff plots for five analytes on titania column at different temperatures

表1 分析 物的 回歸 參數(shù)Table 1 Regressi on parameters for theanalytes

由圖5和表1可以看出，鈦膠色譜柱在不同溫度時(shí)對5種維生素的分離呈現(xiàn)很好的線性，說明在30～70 ℃的溫度范圍內(nèi)鈦膠柱對它們的分離機(jī)理是一致的。

表2 分析物在323.15K 的熵、焓和吉布斯自由能Table 2 St and ard enthalpy（ ΔH °）， entropy （Δ S°） and Gibbsfree en er gy （ΔG °） at3 23.15 K

由表2可以看出，鈦膠色譜柱對上述5 種維生素的分離是由不同的ΔH°和ΔS°決定的。煙酸、生物素和煙酰胺的ΔG°為正值，說明它們的保留行為是由ΔS°驅(qū)動(dòng)的；葉酸和鈷胺素的ΔG°為負(fù)值，說明它們的保留行為是由ΔH°驅(qū)動(dòng)的；ΔG°為負(fù)值表明分析物從流動(dòng)相進(jìn)入固定相是熱力學(xué)自發(fā)過程，ΔG°越小，表明分析物越容易從流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到固定相中，因而導(dǎo)致分析物在鈦膠固定相中的保留越強(qiáng)。葉酸和鈷胺素的ΔG°是負(fù)值，它們的保留也較強(qiáng)，可能是因?yàn)樗鼈兪蔷哂惺杷员江h(huán)的大分子。煙酸、生物素、煙酰胺、葉酸和鈷胺素的ΔG°依次減小，這也從熱力學(xué)角度驗(yàn)證了分析物的保留順序。

2.5 流速的選擇

按照1.3.2節(jié)方法，在pH 7.0、磷酸鹽濃度5.0 mmol/L、柱溫50 ℃時(shí)，選擇流速分別為0.6、0.8 mL/min和1.0 mL/min對5 種維生素進(jìn)行分析，如圖6所示。

圖6 保留時(shí)間 （a）、半峰寬 （b ）、柱效 （c）與流速的關(guān)系Fig.6 Effect of flow rates on retention time （a）， peak width at half height （b） and the number of plates （c）

由圖6a、b可以看出，流速為0.6 mL/min時(shí)，5 種維生素的保留時(shí)間都長，半峰寬較寬；流速為1.0 mL/min時(shí)，雖然分析的時(shí)間縮短，半峰寬會減少，但是煙酸和煙酰胺的柱效降低（圖6c），同樣也會影響煙酸和生物素的分離效果。綜合考慮，選擇流速為0.8 mL/min。

綜合考慮以上因素，于波長210 nm處檢測生物素和鈷胺素，于波長270 nm處檢測煙酸、煙酰胺和葉酸，磷酸緩沖鹽pH 7.0，濃度5.0 mmol/L，柱溫50 ℃，流速0.8 mL/min對5 種維生素進(jìn)行分析，如圖7所示。

圖7 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離色譜圖Fig.7 Chromatogram of mixed vitamin standard solutions

2.6 方法驗(yàn)證

按照方1.3.3節(jié)法，測定5 種維生素的線性范圍。結(jié)果顯示煙酸、生物素、煙酰胺、葉酸和鈷胺素的質(zhì)量濃度分別在0.020～80.0、0.033～400.0、0.066～80.0、0.073～80.0 μg/mL和0.026～80.0 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。分別對最小質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測定，得到檢出限。對0.020 μg/mL的煙酸、0.033 μg/mL的生物素、0.066 μg/mL的煙酰胺、0.073 μg/mL的葉酸和0.026 μg/mL的鈷胺素重復(fù)測定8 次，得出方法的精密度，如表3所示。

表3 5 種維生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和精密 度（n=8）Table3 L in earregressi on equati on s，c orrelati on coefficients， LODs an d pr ec isi on （RS D） （n= 8）

2.7 樣品測定結(jié)果

圖8 樣品1～6的色譜圖Fig.8 Chromatograms of samples1-6

在最優(yōu)色譜條件下，5 種維生素在維生素片和功能性飲料中測定結(jié)果如表4和圖8所示。每個(gè)樣品加入3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，測定加標(biāo)回收率（n=3）。由表4可以看出，加標(biāo)回收率范圍為92.30%～107.20%。由圖8可知，在本實(shí)驗(yàn)提出的色譜條件下，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對5 種維生素的色譜分離是切實(shí)可行的。

表4 樣品測定結(jié)果和加標(biāo)回收率Table 4 Vitam in c on tents of realsamples and s piked recoveries

續(xù)表4

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)分離分析5 種維生素的方法，研究5 種維生素的保留行為與磷酸緩沖鹽pH值、緩沖鹽濃度、柱溫和流速的關(guān)系，得出了最優(yōu)色譜條件：檢測波長210 nm和270 nm，磷酸鹽pH值7.0，濃度5.0 mmol/L，柱溫50 ℃，流速0.8 mL/min，同時(shí)由柱溫計(jì)算出維生素從流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到固定相的ΔH°、ΔS°和ΔG°，這從熱力學(xué)角度驗(yàn)證了分析物的保留順序。5 種維生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（R2＞0.999 0），煙酸、生物素、煙酰胺、葉酸和鈷胺素的檢出限分別為6、10、20、22、8 ng/mL，5 種物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都低于1.36%，加標(biāo)回收率范圍在92.30%～107.20%之間。同時(shí)，本法樣品前處理過程簡單，操作方便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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Simultaneous Determination of Five Vitamins by Titania-Based RP-HPLC

GENG Ying， LI Rong*， JIANG Zitao， ZHANG Fabo
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China）

A new method for simultaneous separation and determination of five vitamins including nicotinic acid （vitamin PP）， biotin （VB7）， nicotinamide （vitamin PP）， folic acid （VB9）， and cyanocobalamin （VB12） using high performance liquid chromatography （HPLC） on a titania-based column has been developed.The influence of buffer pH， buffer type， buffer concentration， column temperature and flow rate on separation efficiency was investigated.The optimized chromatographic conditions were obtained as follows: 5.0 mmol/L phosphate solution at pH 7.0 as buffer solution， column temperature of 50 ℃， and a flow rate of 0.8 mL/min.Biotin and cyanocobalamin were detected at 210 nm and three other vitamins at 270 nm.The thermodynamic parameters enthalpy， entropy and Gibbs free energy were calculated for the retention of the analytes.The proposed method presented good linearity （R2＞ 0.999 0） for the five vitamins.The limits of detection （LODs）for nicotinic acid， biotin， nicotinamide， folic acid and cyanocobalamin were 6， 10， 20， 22， and 8 ng/mL， respectively.The precisions （RSDs） for the five vitamins were less than 1.36%.The recoveries of spiked samples were between 92.30% and 107.20%.The precision and accuracy of this method can meet the requirements of HPLC analysis.

titania-based reverse phase； high performance liquid chromatography （HPLC）； vitamins

10.7506/spkx1002-6630-201614020

TS218

A

1002-6630（2016）14-0116-07

耿瑛， 李榮， 姜子濤， 等.鈦膠RP-HPLC法同時(shí)測定5 種維生素［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 116-122.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201614020. http://www.spkx.net.cn

GENG Ying， LI Rong， JIANG Zitao， et al.Simultaneous determination of five vitamins by titania-based RP-HPLC［J］.Food Science，2016， 37（14）: 116-122.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614020. http://www.spkx.net.cn

2015-12-02

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JCYBJC18700；12JCZDJC34100）

耿瑛（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：gengying92@126.com

*通信作者：李榮（1962—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称贩治?。E-mail：lirong@tjcu.edu.cn