牛初乳中免疫球蛋白G雙抗夾心ELISA檢測方法的建立

劉 金，王麗威，2，岳喜慶，*（.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 0866；2.遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧 阜新 23000）

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牛初乳中免疫球蛋白G雙抗夾心ELISA檢測方法的建立

劉 金1，王麗威1，2，岳喜慶1，*
（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧 阜新 123000）

將牛免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）作為免疫原免疫BALB/c小鼠，通過細胞融合、篩選獲得分泌抗牛IgG單克隆抗體的細胞株。制備小鼠腹水抗體，進一步純化獲得抗牛IgG單克隆抗體。建立雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測牛初乳中IgG質(zhì)量濃度，該方法在7.8～1 000 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，最低檢出限為7.06 ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)為4.52%，批間變異系數(shù)為4.94%，回收率為91.85%～102.45%。此法操作簡便、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，可用于實際牛初乳樣品的快速檢測。

牛初乳；免疫球蛋白G；單克隆抗體；雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法

牛初乳一般是指奶牛分娩7 d內(nèi)的乳汁。牛初乳不但含有常乳中的營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、脂肪酸、氨基酸和礦物質(zhì)），還富含多種生理活性因子，包括免疫球蛋白、乳鐵蛋白、生長因子、乳過氧化氫酶和溶菌酶等［1］。其中，免疫球蛋白是最重要的一類免疫因子，牛初乳中的免疫球蛋白主要是IgG、IgM和IgA，其中IgG的含量最高，約占80%～90%［2-3］。因此，IgG含量成為衡量牛初乳及其制品質(zhì)量的重要指標(biāo)。目前，牛初乳中IgG檢測方法主要包括免疫擴散法［1，3-6］、免疫比濁法［1，6-8］、高效液相色譜法［1，9-10］、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法［1，11-16］和表面等離子體共振法［16］等。這些方法中免疫擴散法應(yīng)用最為廣泛。但此法檢測時間長、精確度不高。高效液相色譜法操作繁瑣，不適合大批量檢測。ELISA法是近年來迅速發(fā)展的一類檢測方法，其操作簡便、特異性好、準(zhǔn)確度高，適合大量樣品檢測，在多個領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。在牛初乳IgG含量檢測中，國外已成功開發(fā)了試劑盒，反應(yīng)模式多數(shù)是競爭模式，也有夾心模式。我國在這方面起步較晚，目前主要依賴進口檢測試劑盒。本研究采用單克隆抗體和多克隆抗體，建立雙抗夾心ELISA法檢測牛初乳中IgG含量，為牛初乳的生產(chǎn)加工和質(zhì)量監(jiān)控提供可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛初乳樣品為奶牛分娩3 d內(nèi)所分泌的乳汁，采自遼寧輝山乳業(yè)，-20 ℃貯存。

BALB/c小鼠 白求恩醫(yī)科大學(xué)動物試驗中心；標(biāo)準(zhǔn)牛IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇、雞卵清白蛋白、冷水魚明膠、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體 美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG多克隆抗體 博奧森公司；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB）、96 孔酶標(biāo)板、小鼠單隆抗體亞類鑒定試劑盒 鼎國昌盛生物技術(shù)公司；其他試劑純度均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch微孔板分光光度計 美國Bio-Tex公司；移液器 美國Thermo公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

包被液：0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）；緩沖液：0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）（pH 7.4）、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）；稀釋液：0.01%、0.05%磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate-buffered saline with Tween-20，PBST）（0.01 mol/L PBS溶液中分別加入0.01%、0.05% Tween-20）、0.05% Tris-HCl吐溫緩沖液（Tris-HCl with Tween-20，TBST）（0.05 mol/L Tris-HCl溶液加入0.05% Tween-20）；底物：TMB底物；終止液：2 mol/L H2SO4。

1.3.2 抗體的制備

選擇6～8 周齡的雌性BALB/c小鼠，首次免疫時用標(biāo)準(zhǔn)牛IgG與等量弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔注射，100 μg/只；2 周后進行二次免疫，與等量弗氏不完全佐劑充分乳化，腹腔注射，100 μg/只；二次免疫1周后尾尖采血，間接ELISA測定血清效價，血清效價達到6 000用于細胞融合。在融合前不加佐劑加強免疫，3 d后取鼠脾細胞，與sp20骨髓瘤細胞用聚乙二醇誘導(dǎo)融合后培養(yǎng)。采用間接ELISA法篩選陽性孔，克隆化培養(yǎng)［17］。選取效價最高的雜交瘤細胞注射于小鼠腹腔中，1 周后采集腹水，采用辛酸-硫酸銨法粗提純后，使用Protein G親和層析柱純化并進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrymide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳分析［18］。測定單抗亞類、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及純度，間接ELISA法測定純化前后效價、抗體親和力［18］。

1.3.3 雙抗夾心法的建立

包被：用包被液將1.3.2節(jié)制備的小鼠抗牛IgG單抗稀釋至一定質(zhì)量濃度，每孔100 μL包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜；洗滌：棄去孔內(nèi)溶液并拍打，每孔加入洗滌液200 μL后，洗板60 s，重復(fù)3 次，在每兩步驟之間均需洗滌，以下同；封閉：每孔200 μL封閉劑，37 ℃孵育；加樣：每孔加100 μL標(biāo)準(zhǔn)牛IgG或，37 ℃孵育；加酶標(biāo)抗體：每孔加100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)兔抗牛IgG多克隆抗體（以下簡稱酶標(biāo)抗體），37 ℃孵育，洗滌4 次；加底物顯色：各反應(yīng)孔中加入剛剛配制的TMB底物溶液100 μL，37 ℃暗處反應(yīng)10 min；終止反應(yīng)：每孔加2 mol/L硫酸50 μL，酶標(biāo)儀450 nm波長條件下讀取OD值。以不加牛IgG的空白孔作為陰性對照。

1.3.4 包被抗體及酶標(biāo)抗體工作質(zhì)量濃度的確定

采用方陣法確定單抗包被質(zhì)量濃度和酶標(biāo)抗體質(zhì)量濃度，將純化后單抗按500、1 000、2 000、4 000 倍稀釋，包被酶標(biāo)板；將酶標(biāo)抗體分別稀釋至2 000、4 000、8 000、10 000 倍，選取陽性值（P值）1.0～1.5之間左右為最佳質(zhì)量濃度條件。

1.3.5 樣品稀釋液的確定

按照最優(yōu)條件進行操作，將稀釋液為分為3 組：a.0.01% PBST；b.0.05% PBST；c.0.05% TBST，測定OD450 nm值并計算陽性值/陰性值（P/N值），選擇P/N最大值對應(yīng)的稀釋液作為最佳稀釋液。

1.3.6 封閉劑及封閉時間的確定

分別用0.1 mol/L氯化銨溶液、1%脫脂奶粉、1% OVA、1%冷水魚明膠作為封閉劑，計算P/N值。選擇最優(yōu)封閉劑；封閉時間分別在設(shè)置37℃ 30、60、90、120 min，其余步驟按照夾心ELISA法，計算P/N值。

1.3.7 抗原及酶標(biāo)抗體作用時間的確定

根據(jù)已確定的條件進行操作，分別設(shè)置抗原與抗體作用時間：37 ℃ 30、45、60、90 min；酶標(biāo)抗體作用時間：37 ℃ 15、30、45、60 min，計算P/N值。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度

將標(biāo)準(zhǔn)牛IgG連續(xù)稀釋至7.8、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000 ng/mL質(zhì)量濃度，按優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法，測定OD450 nm值。每個質(zhì)量濃度設(shè)3 個平行。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度值的對數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，采用Excel計算回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)結(jié)果計算最低檢出限，即靈敏度。

1.3.9 精密度實驗

采用優(yōu)化后的雙抗夾心ELISA方法，檢測0.2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛IgG樣品，同一批次選取不同孔重復(fù)10 次，計算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，表示批內(nèi)差異；逐批重復(fù)10 次，計算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，表示批間差異。

1.3.10 加標(biāo)回收率實驗

取3 份同樣的牛初乳樣品，稀釋106倍后，取1 mL，分別加入0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛IgG 0.5、1、2.5 μL，使終質(zhì)量濃度分別為100、200、500 ng/mL，按優(yōu)化后的方法測定，每個質(zhì)量濃度做3 次重復(fù)，計算加標(biāo)回收率。

1.3.11 實際樣品檢測

按優(yōu)化的ELISA方法測定10 份牛初乳樣品中IgG的含量。將樣品稀釋106倍后按優(yōu)化后的方法測定后進行計算，每個樣品重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體鑒定

經(jīng)亞類鑒定試劑盒測定，單抗亞類為IgG1；純化前單抗蛋白質(zhì)量濃度為46.85 mg/mL，辛酸-硫酸銨法純化后質(zhì)量濃度為10.88 mg/mL，親和層析純化后質(zhì)量濃度為2.21 mg/mL，兩種方法純化后效價均為2.56×106，將原腹水及辛酸-硫酸銨法、親和層析兩種純化后的抗體進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖1、2所示，可直接觀察出純化前腹水中雜蛋白較多，辛酸-硫酸銨法純化后，可去除一部分雜蛋白，目的蛋白條帶逐漸清晰，而親和層析純化法后，條帶清晰，只有重鏈及輕鏈兩部分，分別位于50、25 kD處，純度較高，進一步測定親和力常數(shù)為8.92×108L/mol。

圖1 親和層析純化腹水Fig.1 Affinity chromatography of purified ascite

圖2 腹水單抗純化 SD S-P AG E凝膠電泳圖Fig.2 SDS-PAGE gels electrophoresis of purified ascites

2.2 雙抗夾心ELISA法的建立

2.2.1 包被單抗及酶標(biāo)抗體質(zhì)量濃度的確定

反應(yīng)體系中此條件最為關(guān)鍵，優(yōu)化方法采用方陣法，結(jié)果如表1所示，根據(jù)經(jīng)驗值OD值在1.0～1.5之間建立標(biāo)準(zhǔn)曲線比較合適，綜合判斷選擇單抗稀釋1 000 倍，酶標(biāo)抗體稀釋2 000 倍。

表1 包被單抗及酶標(biāo)抗體質(zhì)量濃度Table1 Coat in g c on centrati on s of McAb and diluti on of H RP-Ab

2.2.2 樣品稀釋液的確定

為降低空白值，提高準(zhǔn)確性，故對稀釋液進行優(yōu)化，由圖3可以看出，a組與b組P值相近，c組略低，但是b組與c組N值較低，且b組P/N值最大，因此確定0.05% PBST為樣品稀釋液。

圖3 稀釋液的確定Fig.3 Determination of the appropriate diluent

2.2.3 封閉劑及封閉時間的確定

在包被后，一般采用化學(xué)試劑或無關(guān)蛋白作為封閉劑，將酶標(biāo)板未結(jié)合的位點進行封閉，減少非特異性吸附，提高靈敏度，本實驗研究4 種封閉劑效果，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，0.1 mol/L氯化銨作為封閉劑時，P/N值最大，說明0.1 mol/L氯化銨封閉效果最佳。進一步研究氯化銨的封閉時間，結(jié)果如圖5所示，可以看出，37 ℃、60 min為最佳封閉時間。

圖4 封閉劑的確定Fig.4 Determination of sealant

圖5 封閉時間的確定Fig.5 Determination of blocking time

2.2.4 抗原及酶標(biāo)抗體作用時間的確定

不同反應(yīng)時間其OD450 nm值相差較大，為提高靈敏度及重復(fù)性，需對抗原、酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間進行優(yōu)化，結(jié)果如圖6所示，可以看出，抗原作用60 min時，P/N值最大，故抗原最佳作用時間為60 min；酶標(biāo)抗體作用時間如圖7所示，酶標(biāo)抗體最佳作用時間為30 min。

圖6 抗原作用時間的確定Fig.6 Determination of antigen action time

圖7 酶標(biāo)抗體作用時間的確定Fig.7 Determination of reaction time of enzyme linked antibody

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限實驗結(jié)果

牛IgG在7.8～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，OD值與牛IgG質(zhì)量濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)計算，回歸方程為y = 0.470 3 lgx-0.158 2，相關(guān)系數(shù)R2= 0.992 6。隨機選擇20 個孔做空白孔檢測，求出平均值和變異系數(shù)s，最低檢出限為平均值加3 倍變異系數(shù)（+3s），經(jīng)計算最低檢出限為7.06 ng/mL。

2.2.6 精密度實驗結(jié)果

對200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)牛IgG樣品分別進行批內(nèi)和批間重復(fù)檢測，結(jié)果如表2所示，所建立的雙抗夾心ELISA法，其批內(nèi)檢測平均值為197 ng/mL，變異系數(shù)為4.52%；批間檢測平均值為205 ng/mL，變異系數(shù)為4.94%，精密度符合要求。

表2 批內(nèi)與批間的變異系數(shù)Table 2 Intra-assay and in ter-assayC Vs

2.2.7 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

以100、200、500 ng/mL三個添加量測定樣品中IgG含量及回收率，結(jié)果見表3，可以看出，牛初乳樣品IgG含量為53.56 ng/mL，回收率為91.85%～102.45%，在80%～120%之間均在合理范圍內(nèi)；變異系數(shù)為3.30%～5.32%，均在10%以下。

表3 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 3 Results of spiked recovery

2.2.8 實際樣品檢測結(jié)果

按優(yōu)化的ELISA方法測定10 份樣品中牛IgG的含量，結(jié)果如表4所示。由于不同奶牛個體差異，所產(chǎn)牛初乳中IgG含量各不相同，IgG含量為50.29～79.68 mg/mL，平均值為65.40 mg/mL。

表4 牛初乳樣品中IgG含量Table 4 C on centrati on s of bov in e IgG in colostrum samples

3 討 論

牛初乳因含有大量的免疫球蛋白而備受關(guān)注，其檢測方法不斷發(fā)展，其中免疫學(xué)方法已成為主要的測定方法。其中免疫擴散法最為普遍，此方法是將樣品或標(biāo)準(zhǔn)牛IgG滴加于含兔抗牛IgG抗體的瓊脂板小孔中，經(jīng)24 h擴散后，形成肉眼沉淀環(huán)，然后測量沉淀環(huán)的直徑，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，牛IgG的含量與沉淀環(huán)的直徑呈正比，該方法操作簡便，設(shè)備要求低，結(jié)果直觀，但由于擴散直徑的測量誤差較大，導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確度和靈敏度都較低，檢測效率低。我國保健食品中IgG的測定采用高效親和色譜法，主要是借助于偶聯(lián)Protein A或Protein G的親和色譜柱進行定量，線性范圍為0.2～1.0 mg/mL［19］，準(zhǔn)確度高，但操作相對繁瑣。ELISA法具有特異性強、檢測效率高等優(yōu)點，適用于牛IgG的檢測。在出口牛乳制品中IgG測定的標(biāo)準(zhǔn)中，采用間接競爭ELISA法，檢測線性范圍為0～51.2 mg/L［20］，可滿足目前國內(nèi)牛初乳制品的質(zhì)量要求，但是競爭法為兩種抗原競爭有限抗體，故與夾心法存在一定差別。研究表明，對于分子質(zhì)量較大的蛋白物質(zhì)的測定，夾心ELISA比競爭ELISA靈敏度高，而夾心ELISA測定牛IgG時，需要兩種抗體，即包被抗體和酶標(biāo)抗體。若都采用同一動物來源的多克隆抗體，競爭表位，反應(yīng)值低；若采用不同動物來源的抗體，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，使背景值高，降低了方法的靈敏度。在夾心ELISA研究開發(fā)中，獲得親和力強、特異性好的配對抗體成為首要的技術(shù)步驟。單克隆抗體與多克隆抗體相比，具一定的優(yōu)越性，具有特異性強、效價高、重復(fù)性好等優(yōu)點。本研究制備特異性強的單克隆抗體，經(jīng)純化后純度高，效價為2.56×106，親和力常數(shù)為3.9×108L/mol，在107～1012范圍內(nèi)，屬高親和力抗體。另外，由于測定目標(biāo)物質(zhì)為牛初乳中IgG，封閉劑分為化學(xué)試劑或無關(guān)蛋白，在包被酶標(biāo)板后，對酶標(biāo)板未結(jié)合的位點進行封閉，減少非特異性結(jié)合，相對于化學(xué)試劑，蛋白試劑儲存效果不好，而一般市面蛋白封閉劑，例如牛血清白蛋白等蛋白試劑可能殘留IgG，如果采用進口試劑，成本較高，且實驗結(jié)果顯示氯化銨溶液封閉效果較好。

在此基礎(chǔ)上，對ELISA反應(yīng)體系中的抗體質(zhì)量濃度、稀釋液、封閉條件及反應(yīng)時間等進行了優(yōu)化，并對方法的準(zhǔn)確性、精確性和適用性進行了評價。優(yōu)化后的ELISA方法為：將單抗稀釋1 000 倍在4 ℃過夜包被后，加0.1 mol/L氯化銨37 ℃封閉60 min，加樣品后37 ℃反應(yīng)60 min，加入2 000 倍稀釋的酶標(biāo)兔抗牛抗體后37 ℃反應(yīng)30 min，最后加底物顯色測值，此法回歸方程為y= 0.470 3 lgx-0.158 2，R2= 0.992 6，在7.8～1 000 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)，最低檢出限能達到7.06 ng/mL，加標(biāo)回收率平均值為95.87%，變異系數(shù)低于10%，穩(wěn)定性好。在實際檢測中，奶牛在分娩后第一次分泌的乳汁牛初乳IgG最高，含量為50～100 mg/mL，然后將快速下降，1～2周后其含量基本與常乳一致［21-23］，采用此研究方法分別檢測10份牛初乳樣品，IgG含量在為50.29～79.68 mg/mL。奶牛雖存在個體差異，但此牛場奶牛分娩3 d內(nèi)所分泌的初乳能滿足初乳制品加工要求。綜合結(jié)果，本研究利用所獲抗體，建立了雙抗夾心ELISA方法，操作簡便，結(jié)果靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重復(fù)性強，可用于牛初乳中IgG的檢測。

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Development of Double Antibody Sandwich ELISA for Detection of Bovine Colostrum Immunoglobulin G

LIU Jin1， WANG Liwei1，2， YUE Xiqing1，*
（1.College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；2.College of Science， Liaoning Technology University， Fuxin 123000， China）

The hybridoma cells secreting monoclonal antibody （McAb） against bovine colostrum immunoglobulin G （IgG）were developed by cell fusion technology after immunization of BALB/c mice with bovine IgG.McAbs were obtained by purification of mouse ascites.A double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） technique was established for the detection of bovine colostrum IgG.The linear range was 7.8-1 000 ng/mL and the limit of detection （LOD）was 7.06 ng/mL.The intra-assay and inter-assay coefficient of variations were 4.52% and 4.94%， respectively.The recovery rate was 91.85%-102.45%.The ELISA method can provide a simple， accurate and stabile approach for the rapid detection of bovine colostrum IgG.

bovine colostrum； immunoglobulin G （IgG）； monoclonal antibody； sandwich ELISA

10.7506/spkx1002-6630-201614013

TS252.7

A

1002-6630（2016）14-0074-06

劉金， 王麗威， 岳喜慶.牛初乳中免疫球蛋白G雙抗夾心ELISA檢測方法的建立［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 74-79.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614013. http://www.spkx.net.cn

LIU Jin， WANG Liwei， YUE Xiqing.Development of double antibody sandwich elisa for detection of bovine colostrum immunoglobulin G［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 74-79.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614013. http://www.spkx.net.cn

2015-10-03

2011年度國家星火計劃項目（2011GA650001）

劉金（1991—），女，碩士研究生，研究方向為動物性產(chǎn)品加工。E-mail：liujin911216@163.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向為動物性產(chǎn)品加工。E-mail：yxqsyau@126.com