靈芝孢子粉破壁工藝優(yōu)化及其抗腫瘤作用

劉春延，張國財(cái)*，程方志，張國珍*，趙 博，林連男（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

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靈芝孢子粉破壁工藝優(yōu)化及其抗腫瘤作用

劉春延，張國財(cái)*，程方志，張國珍*，趙 博，林連男
（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以靈芝孢子粉為原料，采用高壓均質(zhì)法破壁靈芝孢子，研究靈芝孢子粉破壁優(yōu)化工藝及破壁孢子粉抗腫瘤作用。選取水為破壁溶劑，以均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、料液比為試驗(yàn)因素，以靈芝孢子破壁率為試驗(yàn)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)靈芝孢子破壁工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過建立S180荷瘤小鼠模型，對(duì)破壁靈芝孢子粉的抗腫瘤作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，最佳破壁工藝條件為均質(zhì)壓力150 MPa、均質(zhì)次數(shù)3、料液比1∶100（g/mL），破壁率為94.35%。抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，破壁靈芝孢子對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制率為43.37%～57.59%，且肝體比和肺體比變化穩(wěn)定，并可顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。因此，破壁靈芝孢子粉具有良好的抗腫瘤作用。

靈芝孢子；破壁；高壓均質(zhì)法；抗腫瘤作用

靈芝孢子粉（Ganoderma lucidum spores，GLS）是靈芝在生長(zhǎng)成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳物質(zhì)［1］。藥理研究表明，GLS具有抗腫瘤、增加免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、治療神經(jīng)性疾病等多種藥理作用［2-8］。但由于GLS為雙壁結(jié)構(gòu)，質(zhì)地堅(jiān)硬，由幾丁質(zhì)和纖維素等高分子物質(zhì)構(gòu)成，限制了機(jī)體對(duì)孢內(nèi)有效物質(zhì)的消化吸收。為了充分利用靈芝孢內(nèi)有效物質(zhì)，破壁處理是必要的，且破壁處理可以提高GLS的生物活性［9-10］。

目前，國內(nèi)外關(guān)于GLS破壁方法有超聲波處理法、酶水解處理法、離心剪切粉碎法和CO2超臨界處理法［11-13］等，但這些方法普遍存在效率低、破壁率較低的缺點(diǎn)，關(guān)于高壓均質(zhì)法破壁GLS的工藝亦有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了高壓均質(zhì)法GLS破壁工藝優(yōu)化，并對(duì)破壁后靈芝孢子粉（broken Ganoderma lucidum spores，BGLS）的抗腫瘤作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GLS由吉林白石山林業(yè)局培養(yǎng)并提供，品種為“韓芝1號(hào)”?？鼓[瘤實(shí)驗(yàn)中BGLS是用高壓均質(zhì)機(jī)在最佳破壁工藝條件下獲得。

清潔級(jí)昆明種小鼠（雄雌各半，體質(zhì)量（20±2）g）黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)。

小鼠實(shí)體移植肉瘤180（S180）由東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，液氮凍存。無水硫酸鋅、無水乙醇國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；注射用環(huán)磷酰胺（批號(hào)：20140942，200 mg/支） 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

血球計(jì)數(shù)板（25 mm×16 mm） 哈爾濱賽拓生化試劑儀器公司；TH-500BQ型超聲波儀 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；QL901型渦旋混合器 江蘇海門其林貝爾公司；BH-2型普通光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯公司；AH100B型高壓均質(zhì)機(jī) 上海市ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GLS破壁工藝

GLS→過80 目篩→沖洗數(shù)次→抽干→烘干（60 ℃）→預(yù)處理GLS→制成懸濁液→超聲處理（1 h）［14］→振蕩（1 次/10 min數(shù)次）→高壓均質(zhì)機(jī)破壁→BGLS懸濁液→減壓濃縮→BGLS

1.3.2 破壁率的測(cè)定

參考倪偉鋒［15］方法對(duì)BGLS采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=8 069.2x+1.694 4（y為孢子粉平均數(shù)，x為孢子粉質(zhì)量，R2=0.999 5），按照（1）式計(jì)算破壁率：

式中：X為破壁率/%；Nl為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的與待測(cè)樣品相同質(zhì)量的未破壁GLS數(shù)目；N2為計(jì)數(shù)得到的BGLS樣品中未破壁的GLS數(shù)目。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以水為破壁工藝溶劑，按照1.3.1節(jié)中的工藝對(duì)GLS進(jìn)行破壁處理，通過單因素試驗(yàn)考察料液比、均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)對(duì)GLS破壁率的影響，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，固定條件為：料液比1∶100（g/mL）、均質(zhì)壓力130 MPa、均質(zhì)次數(shù)1。

表1 單因素試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and t heirl evels used for o ne-factor-at-a-time experiments

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以料液比、均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)為試驗(yàn)因素，以破壁率為指標(biāo)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法［16］對(duì)破壁工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 GLS破壁工藝正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and t heir levelsu sed for orthog on ala rray experiments

1.3.5 BGLS抗腫瘤作用

1.3.5.1 荷瘤造模

復(fù)蘇S180腫瘤細(xì)胞，腹腔接種，傳代3 次后用于實(shí)驗(yàn)。無菌抽取傳代7 d、生長(zhǎng)良好的S180荷瘤小鼠的腹水，加入生理鹽水調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分子數(shù)量濃度至1×107/mL。

小鼠60 只，雌雄各半，喂養(yǎng)1 周。造模時(shí)每鼠右腋皮膚消毒，于右腋皮下接種瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠接種0.2 mL［17］。

1.3.5.2 分組給藥

接種24 h后，將小鼠隨機(jī)分為8 組，即模型對(duì)照（等容食用油）、GLS（0.5、1、2 g/kg）、環(huán)磷酰胺（75 mg/kg）和BGLS（0.5、1、2 g/kg）組。灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)10 d［18-20］。

1.3.5.3 BGLS對(duì)S180荷瘤小鼠模型的影響

停藥次日稱質(zhì)量并處死小鼠，分別稱取小鼠腫瘤質(zhì)量、肝臟、肺、胸腺和脾臟質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率［21］、肝體比、肺體比、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)［22］等，如式（2）～（6）所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)破壁率的影響

圖1 料液比對(duì)破壁率的影響Fig.1 Effects of solid-to-liquid ratio on the percentage of broken spores

由圖1可知，料液比在1∶50～1∶100（g/mL）范圍內(nèi)，GLS破壁率隨著溶劑用量的增加而提高，當(dāng)料液比為1∶100（g/mL）時(shí)，破壁率最大，達(dá)57.24%。當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時(shí)破壁率反而下降。然而高壓均質(zhì)機(jī)處理GLS時(shí)，強(qiáng)大的機(jī)械力使GLS相互碰撞達(dá)到破壁的目的，當(dāng)溶劑用量較小時(shí)，GLS之間碰撞距離較短，撞擊力較低，導(dǎo)致破壁率較低，隨著溶劑用量的增大，GLS之間的碰撞距離隨之增大，破壁率會(huì)因撞擊力變大而提高，但當(dāng)溶劑用量增大到一定程度時(shí)GLS破壁率會(huì)因碰撞幾率減小而下降。故選料液比1∶100（g/mL）為最佳。2.1.2 均質(zhì)壓力對(duì)破壁率的影響

圖2 均質(zhì)壓力對(duì)破壁率的影響Fig.2 Effects of homogenization pressure on the percentage of broken spores

由圖2可知，GLS破壁率隨著均質(zhì)壓力的增大而升高，當(dāng)均質(zhì)壓力在70～110 MPa時(shí)，破壁率較低且緩慢升高，當(dāng)均質(zhì)壓力達(dá)到110 MPa時(shí)，破壁率顯著升高，當(dāng)達(dá)到高壓均質(zhì)機(jī)最大均質(zhì)壓力150 MPa時(shí)，破壁率達(dá)到57.38%。結(jié)果表明，利用高壓均質(zhì)機(jī)對(duì)GLS破壁處理，均質(zhì)壓力越大，提供的機(jī)械能越大，GLS破壁率越高?？紤]到本實(shí)驗(yàn)高壓均質(zhì)機(jī)最大使用均質(zhì)壓力為150 MPa，因此，均質(zhì)壓力選擇130 MPa。

2.1.3 均質(zhì)次數(shù)對(duì)破壁率的影響

圖3 均質(zhì)次數(shù)對(duì)破壁率的影響Fig.3 Effects of the number of homogenization cycles on the percentage of broken spores

由圖3可知，GLS破壁率隨著均質(zhì)次數(shù)增加而升高，當(dāng)均質(zhì)3 次時(shí)，破壁率達(dá)到89.33%，均質(zhì)次數(shù)繼續(xù)增加，破壁率趨于平穩(wěn)。因此，選擇均質(zhì)次數(shù)3。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 GLS破壁工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table3 Orthog on alarray designlayout withexperimental results for pe rc en tag e disru pti on of G.luc idum s pores

表4 正交 試驗(yàn) 結(jié)果 方差 分析Table4 Analysis of variance of theresults o for thog on alarray experiments

表4方差分析結(jié)果表明：3 個(gè)因素的主次順序?yàn)榫|(zhì)壓力（B）＞均質(zhì)次數(shù)（C）＞料液比（A），即均質(zhì)壓力對(duì)GLS破壁率具有極顯著的影響（P＜0.01），均質(zhì)次數(shù)對(duì)破壁率影響顯著（P＜0.05），而料液比對(duì)破壁率的影響不顯著。

由表3、4可知，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)于B因素，GLS破壁率在各水平間的差異顯著，B3和B1破壁率差異極顯著，以B3為最佳。對(duì)于C因素，GLS破壁率C1水平分別與C2、C3水平差異顯著，但C2水平和C3水平間無顯著差異，實(shí)踐中選取C2為最佳。對(duì)于A因素，GLS破壁率在各水平間無顯著差異，在A2水平上破壁率最大，因此，實(shí)踐中選取A2為最佳。綜合考量得出：GLS破壁工藝最優(yōu)條件為B3C2A2，即均質(zhì)壓力150 MPa、均質(zhì)次數(shù)3、料液比1∶100（g/mL）。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照最佳破壁工藝B3C2A2采用高壓均質(zhì)法對(duì)GLS進(jìn)行3 次平行破壁處理，破壁率的平均值達(dá)94.35%，與正交試驗(yàn)中的結(jié)果相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了該破壁工藝的可行性。其中，GLS和BLGS的顯微結(jié)構(gòu)見圖4，未破壁GLS視野范圍內(nèi)孢子完整，而BGLS視野范圍內(nèi)大部分孢子已被破壁，兩者差異明顯。

圖4 GLS （a）和BGLS （b）顯微鏡圖（×400）Fig.4 Optical microscope photographs of intact （a） and broken （b）G.lucidum spores （×400）

2.4 BGLS抗腫瘤功能

2.4.1 BGLS對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量的影響

表5 BGLS 對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響（x±s，n=6）Table 5 Inhibitory effects of broken G.luc idum sporeso nt umor gr ow th in S18 0 tum or-be ar in g mice （x± s，n=6）

由表5可知，給藥10 d后處死小鼠，剝離腫瘤后，各組腫瘤質(zhì)量均低于模型對(duì)照組，且抑瘤率與給藥劑量呈一定正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)GLS給藥劑量相同時(shí)，BGLS劑量組抑瘤率均高于GLS劑量組，其中BGLS高劑量組腫瘤質(zhì)量最小，抑瘤率最高，為57.59%，相比環(huán)磷酰胺組低了10.58%，相比BGLS中劑量組僅提高了0.53%。方差分析表明，GLS劑量組腫瘤質(zhì)量與模型對(duì)照組差異顯著，證明GLS對(duì)S180有明顯的抑制作用，同時(shí)，BGLS劑量組與GLS劑量組差異顯著，BGLS高劑量組與BGLS中劑量組腫瘤抑制率無顯著差異，結(jié)果表明BGLS劑量組抑瘤率優(yōu)于GLS劑量組。綜合考量，選BGLS中劑量組為最佳。

2.4.2 GLS對(duì)S180荷瘤小鼠肺體比、肝體比、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

表6 BGLS對(duì)S180荷瘤小鼠肺體比、肝體比、胸腺指數(shù)、脾指 數(shù)的 影響 （x±s，n=6）Table 6 Effects of broken G.lucidum sporeso nl ung in dex， liver in dex，ch estg l and in d ex ， and spleen in d ex in S1 80 tum or-be ar in g m ice （x± s，n=6）

由表6可知，不同處理組肺體比和肝體比中，不同劑量組與模型對(duì)照組相比變化不大，且差異不顯著，表明GLS對(duì)小鼠肝肺影響較?。坏h(huán)磷酰胺組肺體比和肝體比均高于其他處理組，且與其他處理組均有顯著差異。不同處理組胸腺指數(shù)中，BGLS劑量組胸腺指數(shù)均高于其他處理組，以BGLS中劑量組為最高，方差分析表明，BGLS劑量組胸腺指數(shù)與其他各處理組差異顯著；GLS劑量組胸腺指數(shù)與模型對(duì)照組相比變化不大且無顯著差異，環(huán)磷酰胺組胸腺指數(shù)比模型對(duì)照組下降了49.81%。分析結(jié)果表明，BGLS可以提高小鼠胸腺指數(shù)，GLS對(duì)小鼠胸腺指數(shù)無影響而環(huán)磷酰胺可以對(duì)使小鼠胸腺指數(shù)大大下降。不同處理組脾指數(shù)中，隨著GLS劑量組劑量的增加，脾指數(shù)呈上升趨勢(shì)，但BGLS高劑量組脾指數(shù)低于BGLS中劑量組，同時(shí)，BGLS中劑量組脾指數(shù)高于GLS劑量組，此外，環(huán)磷酰胺組胸腺指數(shù)與模型對(duì)照組相比下降了53.21%。方差分析表明，GLS和BGLS劑量組脾指數(shù)與模型對(duì)照組具有顯著差異，與環(huán)磷酰胺處理組差異極顯著，分析結(jié)果表明，GLS可以提高小鼠脾指數(shù)，且以BGLS中劑量組為最佳，環(huán)磷酰胺可以對(duì)使小鼠脾指數(shù)下降。

3 討論與結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化法探討高壓均質(zhì)法破壁GLS工藝條件，確定最佳破壁工藝參數(shù)為：均質(zhì)壓力150 MPa、均質(zhì)次數(shù)3、料液比1∶100（g/mL）。高壓均質(zhì)機(jī)與傳統(tǒng)工藝相比，高壓均質(zhì)機(jī)操作簡(jiǎn)單，更易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，GLS平均破壁率與均質(zhì)壓力呈正相關(guān)，由于受實(shí)驗(yàn)裝置的構(gòu)造所限不可能無限地增大均質(zhì)壓力，故本實(shí)驗(yàn)選擇最大均質(zhì)壓力為150 MPa。

抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，GLS劑量組與模型對(duì)照組相比具有明顯的抗腫瘤作用，環(huán)磷酰胺組對(duì)S180荷瘤小鼠的平均抑瘤率雖然最高，但其會(huì)大大降低S180荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，出現(xiàn)肺體比增大和肝體比增大等現(xiàn)象，對(duì)免疫器官的損傷，極大降低了機(jī)體的抵抗力，同時(shí)，GLS劑量組中S180荷瘤小鼠肺體比和肝體比比較穩(wěn)定，且胸腺指數(shù)和脾指數(shù)與模型對(duì)照組相比有上升趨勢(shì)，這表明GLS對(duì)小鼠不但有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，同時(shí)還可以增強(qiáng)小鼠的免疫功能，這與李潔［23］的白花蛇舌草對(duì)S180小鼠的抗腫瘤研究的結(jié)果相符。此外，通過比較BGLS與GLS的抗腫瘤效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BGLS可以更顯著提高S180小鼠的抗腫瘤活性及免疫功能，這與Liu Xin［2］、吳學(xué)謙［24］等的研究結(jié)果相符，并且腫瘤抑制率與給藥劑量的呈正相關(guān)，這與馬晶晶［25］的研究結(jié)果相符，但BGLS的抗腫瘤效果中，BGLS中劑量組作用最明顯，因此，BGLS使用時(shí)并不是劑量越大越好，而是存在最適劑量，這與林庶茹等［26］的研究結(jié)果相符。故在抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中選用BGLS中劑量組為最佳，為1 g/kg。本研究為BGLS的抗氧化、改善細(xì)胞呼吸、抑制凋亡、腸道菌群調(diào)節(jié)和刺激細(xì)胞因子等生物活性的深入研究提供了參考。

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Optimization of Disruption of Ganoderma lucidum Spores and Antitumor Effect of the Broken Spores

LIU Chunyan， ZHANG Guocai*， CHENG Fangzhi， ZHANG Guozhen*， ZHAO Bo， LIN Liannan
（College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

The purpose of this study was to investigate the optimum conditions for breaking Ganoderma lucidum spores by high-pressure homogenization using water as the solvent and to evaluate the antitumor effect of the broken spores.The optimization of three process variables including solid-to-liquid ratio， homogenization pressure， and the number of homogenization cycles for improved percentage of broken spores was conducted through one-factor-at-a-time and orthogonal array experiments.S180 tumor-bearing mice models were established for evaluation of the antitumor effect of the broken G.lucidum spores.The results showed that the optimal conditions for breaking G.lucidum spores were obtained as follows: homogenization pressure， 150 MPa； homogenization cycles， 3 times； and solid-to-liquid ratio， 1:100 （g/mL）.Under these conditions， the percentage of broken spores could be up to 94.35%.Antitumor tests showed that the percentage inhibition of tumor growth in S180 tumor-bearing mice by the broken spores was 43.37%-57.59%， and the liver index and lung index were little affected while the thymus index and spleen index were significantly enhanced.Therefore， broken G.lucidum spores possessed good antitumor effect.

Ganoderma lucidum spores； spore disruption； high pressure homogenization method； antitumor effect

10.7506/spkx1002-6630-201614009

R285.5

A

1002-6630（2016）14-0051-05

劉春延， 張國財(cái)， 程方志， 等.靈芝孢子粉破壁工藝優(yōu)化及其抗腫瘤作用［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 51-55.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614009. http://www.spkx.net.cn

LIU Chunyan， ZHANG Guocai， CHENG Fangzhi， et al.Optimization of disruption of Ganoderma lucidum spores and antitumor effect of the broken spores［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 51-55.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201614009. http://www.spkx.net.cn

2015-11-19

哈爾濱市科技局科技項(xiàng)目（2014FF6CJ002）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2572014AA08）

劉春延（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭秤镁钚猿煞?。E-mail：Lcy7621@126.com

*通信作者：張國財(cái)（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯仲Y源保護(hù)及利用。E-mail：Zhang640308@126.com

張國珍（1964—），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)樯峙嘤Y源。E-mail：Zhangguozhen60@126.com