額爾古納自然保護(hù)區(qū)6種林型土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性

趙文靜　趙寶軍　崔岱宗　趙敏

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)　(中國(guó)內(nèi)蒙古森工集團(tuán))　(東北林業(yè)大學(xué))

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額爾古納自然保護(hù)區(qū)6種林型土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性

趙文靜趙寶軍崔岱宗趙敏

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(中國(guó)內(nèi)蒙古森工集團(tuán))(東北林業(yè)大學(xué))

摘要采用PCR-DGGE技術(shù)，研究了額爾古納國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)黑樺(Betula davurica)林、山楊(Populus davidiana)林、落葉松(Larix gmelinii)林、白樺(Betula platyphylla)林、樟子松(Pinus sylvestris)落葉松混交林、落葉松白樺混交林土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)的異同。結(jié)果表明：土壤真菌種類與森林類型密切相關(guān)，每個(gè)林型還存在著其特有的菌種。各林型土壤真菌多樣性高低順序依次為落葉松白樺混交林、落葉松林、樟子松落葉松混交林、山楊林、白樺林和黑樺林，同時(shí)各個(gè)林型土壤中優(yōu)勢(shì)真菌種類是不相同的；林型相似，土壤中真菌種類越相近，相反，林型差異越大，土壤中真菌種類差異就越大。

關(guān)鍵詞額爾古納國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)；土壤真菌；18S rDNA；PCR-DGGE；真菌多樣性

額爾古納國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)具有獨(dú)特的林型和土壤類型，植物類型比較豐富和復(fù)雜。雖然森林土壤中蘊(yùn)育著豐富的未開發(fā)土壤真菌，但是土壤中可培養(yǎng)的微生物在自然界中只占0.1%～10.0%[1-2]，很難客觀、全面地認(rèn)識(shí)土壤中微生物的真實(shí)情況。目前，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究生物生態(tài)學(xué)已經(jīng)比較廣泛，這為認(rèn)識(shí)環(huán)境中的微生物開辟了新途徑。在土壤微生物多樣性的諸多研究方法中，PCR-DGGE技術(shù)因穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被越來越多地運(yùn)用于土壤微生物多樣性的研究中。本研究通過PCR-DGGE技術(shù)對(duì)額爾古納國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)黑樺(Betula davurica)林、山楊(Populus davidiana)林、落葉松(Larix gmelinii)林、白樺(Betula platyphylla)林、樟子松(Pinus sylvestris)落葉松混交林、落葉松白樺混交林中土壤真菌的多樣性進(jìn)行分析，對(duì)6種林型土壤中真菌數(shù)量、種類進(jìn)行了相似性分析，明確了土壤真菌分布規(guī)律、數(shù)量及種類，為額爾古納自然保護(hù)區(qū)土壤真菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

2012年8月20日選擇額爾古納國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)黑樺林、山楊林、樟子松落葉松混交林、落葉松白樺混交林、落葉松林、白樺林作為研究樣地。用5點(diǎn)法采集各林型土壤樣品，并將其裝入無菌聚乙烯袋中，編號(hào)后帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存[3]。

1.2土壤總DNA的提取和純化

土壤總DNA的提取方法參照文獻(xiàn)[4]、[5]。土壤總DNA的純化方法參照文獻(xiàn)[6]。提取后的DNA粗提液用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后的DNA用于PCR擴(kuò)增。

1.3PCR擴(kuò)增

以純化后的土壤總DNA為模板，選擇真菌18 S rDNA通用引物NS1與GCFung[7]對(duì)土壤總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為：NS1-5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′；GCFung-5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT TCC CCG TTA CCC GTT G-3′。PCR產(chǎn)物片段大小和擴(kuò)增效果用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

PCR反應(yīng)體系：引物各4 μL(2.5 μmol·L-1)，10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.4 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.4 μL，DNA模板0.5 μL，去離子水8.7 μL，總體積20 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4DGGE凝膠的制備及染色

選用15%～45%(100%的變性劑是7 mol·L-1尿素與40%去離子甲酰胺的混合物)的變性梯度凝膠。因?yàn)殂y染法有易于操作和靈敏度高(為EB染色200倍)等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，所以選擇銀染法對(duì)DGGE凝膠進(jìn)行染色。

1.4.1DGGE凝膠的制備

(1)將玻璃板倒上洗滌劑，自來水沖洗干凈后，用去離子水潤(rùn)洗，自然風(fēng)干，將部件正確組裝，在組裝過程中旋擰螺母時(shí)用力要均一，避免玻璃板受力不均而碎裂。

(2)調(diào)節(jié)灌膠器齒輪到起始位置，用體積調(diào)節(jié)螺母設(shè)定所需要的凝膠體積。

(3)分別吸取高低變性膠16 mL于2個(gè)50 mL的三角瓶中，向每個(gè)三角瓶中分別加入70 μL 10% APS和15 μL TEMED，搖動(dòng)三角瓶，充分混勻。

(4)分別吸取15 mL高濃度和低濃度膠溶液到標(biāo)有“高”與“低”的注射器中，排空注射器中的空氣后，將注射器固定在制膠器上。

(5)將“Y”型接頭兩端連接到2個(gè)注射器上，“Y”型接頭另一端與一個(gè)19號(hào)平頭針頭相連，將平頭針頭固定在玻璃板中間后，準(zhǔn)備灌膠。

(6)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)灌膠器齒輪，慢慢的將變性膠灌到玻璃板中，待膠溶液到玻璃板頂部時(shí)，灌膠停止，將梳子插入凝膠中。

(7)清洗灌膠系統(tǒng)，避免堵塞。

(8)凝膠室溫放置2 h后即可凝固，待凝膠聚合后小心拔出梳子，凝膠制備完成。

1.4.2DGGE凝膠的染色

(1)電泳完成后，將玻璃板小心從膠板盒上取下，待玻璃板完全冷卻后，小心將玻璃板分開。

(2)在裝有去離子水的塑料托盤中，小心將凝膠從玻璃板上取下，去離子水洗滌2次，每次洗滌后盡量控盡凝膠上的去離子水。

(3)在裝有凝膠的塑料托盤中倒入固定液，使凝膠完全浸沒在固定液中，搖床振蕩15 min。

(4)倒掉固定液，凝膠用去離子水洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為3 min。將染色液倒入裝有凝膠的托盤中，置于搖床上避光振蕩20 min。

(5)用去離子水洗滌染色后的凝膠1次，轉(zhuǎn)移凝膠至黑暗處，在裝有凝膠的托盤中倒入在冰上遇冷過的顯影液，搖床振蕩約6 min，待凝膠上出現(xiàn)清晰的條帶時(shí)，倒入終止液。

(6)將凝膠取出后，去離子水洗滌凝膠3次，在凝膠成像裝置中觀察DGGE電泳效果并照相。

1.5DGGE條帶分析

(1)DGGE中特異條帶的回收。

(2)切膠回收后的PCR反應(yīng)采用不帶GC夾的引物NS1-5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′；Fung-5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物片段大小和擴(kuò)增效果用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

(3)連接轉(zhuǎn)化。將膠回收后的PCR產(chǎn)物與pMD-18T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli Trans109感受態(tài)細(xì)胞中，檢測(cè)轉(zhuǎn)化結(jié)果后，由華大基因科技有限公司完成測(cè)序工作。

1.6DGGE電泳

運(yùn)用Quantity One 4.5.2軟件對(duì)DGGE圖譜上的條帶進(jìn)行定量分析，將各個(gè)泳道與條帶的分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到優(yōu)勢(shì)度、相似性指數(shù)、豐度及香濃系數(shù)等參數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1森林土壤樣品基因組DNA提取

采用凍融法破碎真菌細(xì)胞壁，SDS裂解法破碎真菌菌體提取土壤中真菌總DNA，并將DNA粗提液用小量瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，從而獲得了高質(zhì)量的目標(biāo)基因組DNA片段，如圖1所示，目的片段明亮，無彌散，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2不同林地土壤總DNA的PCR擴(kuò)增

以提取到的土壤總DNA為模板，用真菌18 S rDNA通用引物NS1與GCfung進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。由圖可知擴(kuò)增出的片段大小在350 bp左右，證實(shí)為目的條帶。目的片段明亮、無彌散、有少許非特異性擴(kuò)增片段，但不影響后續(xù)的DGGE凝膠電泳分析。

2.3不同林型土壤真菌的菌群結(jié)構(gòu)

將不同林型土壤樣品的PCR產(chǎn)物取樣13 μL，經(jīng)DGGE電泳后，結(jié)果如圖3所示。從圖可以看出，每個(gè)林型土壤樣品經(jīng)過DGGE電泳后都分離出數(shù)目不同的條帶，且每個(gè)條帶的遷移率和強(qiáng)度各不相同。各個(gè)林型土壤樣品中既有共同的條帶，也有特異性條帶，這說明不同林型土壤樣品中既存在著相同的真菌，也存在著各自特有的真菌種類。條帶Z1在山楊林土壤中顏色最深，說明此種真菌是山楊林土壤中的優(yōu)勢(shì)菌種；條帶Z2和Z4在每個(gè)林型土壤中都存在，說明每個(gè)林型土壤中都存在這2種真菌菌種；條帶Z3只存在于楊樹林、白樺林和黑樺林土壤中，說明此種菌種只分布于3種林型土壤中；條帶Z5和Z6在落葉松林土壤中顏色最深，說明這2種真菌是落葉松林土壤中的優(yōu)勢(shì)菌種。

1、2.山楊林；3、4白樺林；5、6黑樺林；7、8、落葉松林；9、10落葉松白樺混交林；11、12樟子松落葉松混交林。

1.Marker；2.山楊林；3.白樺林；4.黑樺林；5.落葉松林；6.落葉松白樺混交林；7.樟子松落葉松混交林。

圖2不同林型土壤總18 S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

1.山楊林；2.白樺林；3.黑樺林；4.落葉松林；5.落葉松白樺混交林；6.樟子松落葉松混交林。

圖3不同林型土壤樣品的PCR產(chǎn)物的DGGE圖

運(yùn)用Quantity One 4.5.2軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析，得到相似性指數(shù),如圖4和表1所示。由圖可知，白樺林土壤中真菌菌群的構(gòu)成與其他林型土壤中真菌菌群的構(gòu)成具有明顯的相關(guān)性，與落葉松白樺混交林土壤中真菌組成相似性最高，其次為黑樺、山楊和落葉松林土壤，與樟子松落葉松林土壤中真菌組成的差異性最大。

表1　6種林型土壤真菌的相似性聚類分析結(jié)果

黑樺林、山楊林、樟子松落葉松混交林、落葉松白樺混交林、落葉松林、白樺林土壤中真菌菌群的香農(nóng)系數(shù)分別為：3.08、3.17、3.20、3.45、3.24、3.13。落葉松白樺混交林中真菌菌群的香農(nóng)系數(shù)最大，表明該林型土壤中真菌多樣性最高；黑樺林土壤中真菌菌群的香農(nóng)系數(shù)最小，表明該林型土壤中真菌多樣性最低。

2.4DGGE條帶的序列

為了對(duì)不同林型土壤真菌多樣性和分布有更進(jìn)一步的了解，將DGGE圖譜中較為優(yōu)勢(shì)的條帶切膠回收。對(duì)回收的條帶進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序后，通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將其初步鑒定到屬，并根據(jù)本研究中的菌種特點(diǎn)，在NCBI中索取到菌種Genebank登錄號(hào)，確定菌種種名并供他人檢索如表2。

圖4　不同林型土壤真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

條帶編號(hào)GeneBank登錄號(hào)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的最相近序列最相近序列的GenBank登錄號(hào)相似度/%Z1KF776496VolvopluteusearleivoucherMA22816HM56227099Z2KF776497GeomycesdestructansGU35043499Z3KF776498ArxulaterrestrisAB00066398Z4KF776499Penicilliumsolitumstrain20-01JN64222299Z5KF776500HemifridericiaparvaGU90190699Z6KF776501BaculentulustianmushanensisAY03716993

3結(jié)論與討論

在DGGE電泳圖譜中，處于不同位置的每條條帶都是不同屬種微生物的18 S rDNA的核酸片段，其相對(duì)亮度代表森林土壤真菌群落中某一特定真菌菌種及其在群落中的相對(duì)豐度，電泳條帶越亮，表示該菌種的數(shù)量越多[10]，電泳條帶數(shù)量越多，說明微生物種群越多[11-12]。根據(jù)DGGE圖譜中條帶數(shù)目不同，可以得出各林型土壤真菌多樣性高低順序依次為：落葉松白樺混交林、落葉松林、樟子松落葉松混交林、山楊林、白樺林和黑樺林，進(jìn)一步利用Quantity One 4.5.2軟件對(duì)各泳道的香農(nóng)系數(shù)進(jìn)行分析，得到了相似的結(jié)果。根據(jù)DGGE圖譜中條帶亮度不同，可以看出各個(gè)林型土壤中優(yōu)勢(shì)真菌種類是不相同的，同時(shí)對(duì)DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠回收、克隆、測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。上述結(jié)論表明：森林土壤真菌區(qū)系與森林類型密切相關(guān)，這與董愛榮等[13]關(guān)于涼水自然保護(hù)區(qū)森林土壤真菌的多樣性研究及姚賢民等[14]關(guān)于長(zhǎng)白山森林土壤真菌區(qū)系研究結(jié)果相似。

根據(jù)系統(tǒng)樹和相似性指數(shù)數(shù)據(jù)可以得出：林型相似，土壤中真菌種類越相近，相反，林型差異越大，土壤中真菌種類差異就越大。如白樺林土壤樣品中真菌種類與落葉松白樺混交林中真菌種類最相近；闊葉林如白樺林、黑樺林和楊樹林土壤真菌種類比較相近，而針葉林如落葉松林和樟子松落葉松混交林土壤真菌種類比較相近。由此可見，生態(tài)環(huán)境的多樣性直接影響了真菌的分布格局[15]，同時(shí)森林土壤微生物種群的結(jié)構(gòu)比例特征，在對(duì)土壤性質(zhì)的反映上也起到了重要的作用[16]。

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第一作者簡(jiǎn)介，趙文靜，女，1988年10月生，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，碩士研究生。E-mail：786951580@qq.com。 通信作者：趙敏，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail：82191513@163.com。

收稿日期：2014年6月4日。

分類號(hào)S714.3

Diversity Analysis of Soil Fungal Community Structure in Erguna National Nature Reserve by PCR-DGGE//

Zhao Wenjing(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R.China); Zhao Baojun(Inner Mongolia Forest Industry Group); Cui Daizong, Zhao Min(Northeast Forestry University)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：76-79.

We studied the variation of the fungal community structure in the soil of Betula davurica, Populus davidiana, Pinus sylvestris-Larix gmelinii, Larix gmelinii-Betula platyphylla, Larch and Betula platyphylla in Erguna National Nature Reserve by PCR-DGGE.The soil mycobiota were closely related to forest types, and each forest type had its unique species.The diversity ratio of soil fungi in different forest types ranged in descending order of Larix gmelinii-Betula platyphylla, Larch, pinus sylvestris-Larix gmelinii, Populus davidiana, Betula platyphylla and Betula davurica Stands, and each forest type had its unique advantage species.Soil fungi was resemble in similar, but various in different forest soil type.

KeywordsErguna National Nature Reserve; Soil fungi; 18SrDNA; PCR-DGGE; Fungal Diversity

責(zé)任編輯：程紅。