鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化及組分1)

趙玉紅　　　　　張立鋼　　　張睿

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)　　　　(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))　　　　(東北林業(yè)大學(xué))

?

鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化及組分1)

趙玉紅張立鋼張睿

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))(東北林業(yè)大學(xué))

摘要以梅花鹿(Cervus nippon Temminck)鹿茸為原料，采用緩沖溶液提取水溶性蛋白質(zhì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化鹿茸水溶性蛋白質(zhì)的提取條件，采用Sephadex G-100凝膠層析和SDS-PAGE電泳對(duì)提取物組分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：鹿茸水溶性蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為pH=9.18，料液比1.0 g∶60.4 mL，提取時(shí)間5.9 h，在此條件下蛋白提取量為90.84 mg·g-1。采用Sephadex G-100凝膠層析對(duì)鹿茸水溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行分離得到3個(gè)吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為66 000、29 000、14 000。鹿茸水溶性蛋白質(zhì)主要為小分子蛋白質(zhì)。

關(guān)鍵詞梅花鹿；鹿茸；水溶性蛋白質(zhì)

梅花鹿鹿茸是梅花鹿(Cervus nippon Temminck)雄鹿密生茸毛的未骨化的幼角[1]。鹿茸作為哺乳動(dòng)物界唯一存在的可快速重生的組織器官[2-3]，其中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、磷脂、多糖等多種有機(jī)成分，還含有人體必需的多種常量和微量元素[1]。鹿茸蛋白占鹿茸總質(zhì)量的52%以上[4],具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)傷口愈合、改善性功能、抗疲勞、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。

鹿茸水溶性成分主要包括蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等，其中蛋白質(zhì)和多糖是具有生物功能的活性物質(zhì)。Sui et al.[7]采用生理鹽水和pH=4.0、pH=10.0的緩沖溶液對(duì)鹿茸中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，用STD裂解緩沖液提取其中可溶性蛋白質(zhì)，并用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，對(duì)產(chǎn)物采用RPLC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析，其酸性和堿性緩沖溶液提取蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯增殖效果。嚴(yán)銘銘[8]從梅花鹿茸中分離純化得到5種蛋白質(zhì)CNTPⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和1個(gè)多肽CNT14，發(fā)現(xiàn)蛋白CNTPⅢ和多肽CNT14同源性與已知蛋白序列相比小于50%。董萬超等[9]將二杠梅花鹿茸經(jīng)40%乙醇提取，分離、純化，獲得梅花鹿茸多肽Ⅰ和Ⅱ組分。王華等[10]從梅花鹿鹿茸中提取了天然鹿茸總多肽(VATP)，通過HPLC純化，分離出了相對(duì)分子質(zhì)量為200～600的小肽活性組分(VAP-B2)。王豐等[11]通過凝膠層析、離子交換層析以及HPLC法，從馬鹿茸中分離得到一種相對(duì)分子質(zhì)量為3 095.1的多肽。

本研究以梅花鹿鹿茸為原料，利用水溶液對(duì)鹿茸蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化提取鹿茸水溶性蛋白質(zhì)的提取工藝，并對(duì)產(chǎn)物組分進(jìn)行分級(jí)和分子質(zhì)量分析，旨在優(yōu)化鹿茸蛋白質(zhì)提取的適宜工藝條件，提高鹿茸蛋白質(zhì)提取效率，節(jié)約生產(chǎn)成本。為發(fā)現(xiàn)鹿茸提取物中新的活性物質(zhì)，為鹿茸水溶性蛋白質(zhì)的進(jìn)一步應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

梅花鹿鹿茸：黑龍江省大莊園集團(tuán)提供。鹿茸為二杠鋸茸，具有典型分枝，為帶血茸，皮黑褐，亮澤，斷面含血充分、均勻，呈暗紅色。單枝質(zhì)量不低于125 g。

1.2方法

1.2.1鹿茸的預(yù)處理及提取方法

取冷凍鮮茸，剝皮，去除殘余鹿茸血，將去血的鹿茸切成2～5 mm的小塊，凍干后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，鹿茸粉密封備用。用不同pH的緩沖溶液浸泡鹿茸干粉，得鹿茸蛋白粗提物。

1.2.2提取工藝條件優(yōu)化

(1)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取緩沖溶液pH、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素為主要影響因素。①緩沖溶液pH對(duì)鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響。精確稱取鹿茸粉末1 g，分別在pH為2.6、5.0、7.0、8.0(磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液)、9.0、10.0(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液)、12.0(氯化鉀-氫氧化鈉緩沖溶液)，提取2 h，料液比1 g∶20 mL的條件下提取，測(cè)定不同pH條件下提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。②料液比對(duì)鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響。精確稱取鹿茸粉末1 g，分別在料液比為1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50 mL、1 g∶60 mL、1 g∶70 mL、1 g∶80 mL、1 g∶90 mL、1 g∶100 mL，pH=9.0，提取2 h的條件下提取，測(cè)定不同料液比條件下提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。③提取時(shí)間對(duì)鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響。精確稱取鹿茸粉末1 g，分別在時(shí)間為1、2、4、6、8 h，pH=9.0，料液比1 g∶60 mL的條件下提取，測(cè)定不同提取時(shí)間下提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。用SAS9.0軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行分析。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平編碼值見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素水平編碼

1.2.3蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.005 9x+0.013 7，R2=0.995 2。

1.2.4鹿茸蛋白質(zhì)的分離純化

(1)水提物中蛋白質(zhì)的初步分離

取鹿茸緩沖溶液提取物，加入80%硫酸銨，攪拌均勻，使硫酸銨完全溶解，于冰箱中4 ℃冷藏過夜，使蛋白沉淀析出，高速離心，得粗蛋白，-20 ℃冷凍備用。

(2)Sephadex G-100排阻層析

凝膠的預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取4 g Sephadex G-100于燒杯中，加入200 mL蒸餾水，浸泡72 h，使凝膠充分溶脹，傾去水分和表層的細(xì)小顆粒及雜質(zhì)。溶脹后如果仍有細(xì)小顆粒存在，可以充分?jǐn)嚢杌虺曁幚硪源蛩榧?xì)小顆粒，必須保證葡聚糖凝膠的均一性。凝膠充分溶脹后，用蒸餾水反復(fù)洗滌2～3次后，于冰箱4 ℃冷藏備用。

裝柱：取潔凈的層析住，垂直固定在鐵架臺(tái)上，不可傾斜，關(guān)閉下端出口，在柱中加入約1/3柱床體積的洗脫液，邊輕輕攪拌邊將葡聚糖凝膠勻漿通過內(nèi)壁一側(cè)傾入柱中，待凝膠沉積1～2 cm后，打開層析柱下端出口，流速一般為0.3～0.6 mL·min-1；同時(shí)不斷緩慢加入凝膠懸液，待沉積膠面上升至標(biāo)記處時(shí)，灌膠完畢；關(guān)閉出水口，靜置片刻，等凝膠完全沉降后，接上恒流泵，用3～5倍柱床體積的平衡液平衡柱子24 h，使柱床穩(wěn)定。裝柱過程應(yīng)始終注意速度，以防有氣泡進(jìn)入。

經(jīng)過初步分離的鹿茸蛋白質(zhì)，溶于pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，上樣質(zhì)量濃度為20 g·L-1，上樣體積為1 mL(5%)。層析柱規(guī)格為1.0 cm×40.0 cm，徑高比為1∶25，流速0.5 mL·min-1，5 mL·管-1收集流出液。分別用紫外/可見光分光光度計(jì)(280 nm處)檢測(cè)紫外吸收峰。根據(jù)洗脫曲線收集合并相同的組分，-20 ℃冷凍備用。

(3)SDS-PAGE電泳

SDS不連續(xù)凝膠垂直電泳，3%濃縮膠，15%分離膠。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1pH對(duì)鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響

pH為2.6、5.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0時(shí)，鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取量分別為17.23、48.75、63.38、65.47、81.75、77.00、64.46 mg·g-1?？梢姡诰彌_溶液pH<7時(shí)，蛋白質(zhì)的提取量是隨著pH的升高而增加的，而由pH=7到pH=8附近又趨于平穩(wěn)，即蛋白質(zhì)提取量不隨pH改變而有明顯變化。從pH=8到pH=9過程中蛋白質(zhì)提取量又隨著pH升高而繼續(xù)升高，到pH=9以后，隨著pH增大，蛋白質(zhì)提取量呈降低趨勢(shì)，當(dāng)pH=9時(shí)蛋白質(zhì)的提取量最大。

2.1.2料液比對(duì)鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響結(jié)果

料液比為1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50 mL、1 g∶60 mL、1 g∶70 mL、1 g∶80 mL、1 g∶90 mL、1 g∶100 mL時(shí)，鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取量分別為77.17、78.38、79.20、80.36、82.19、79.96、75.72、73.29、70.90 mg·g-1。可見，料液比小于1 g∶60 mL時(shí)，蛋白質(zhì)提取量是隨著料液比的增加而增加，從料液比1 g∶60 mL到1 g∶100 mL階段，蛋白質(zhì)的提取量隨著料液比增加而明顯降低。料液比為1 g∶60 mL時(shí)蛋白質(zhì)提取量最大。

2.1.3提取時(shí)間對(duì)鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響

提取時(shí)間為1、2、4、6、8 h時(shí)，鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取量分別為64.40、66.69、72.28、82.96、73.04、71.77 mg·g-1?？梢?，提取時(shí)間小于6 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加蛋白質(zhì)的提取量增加，直到提取6 h時(shí)蛋白質(zhì)提取量達(dá)到最大(82.96 mg·g-1)。提取時(shí)間從6 h到12 h蛋白質(zhì)提取量又隨著時(shí)間的增加而減少。

2.2鹿茸水溶性蛋白質(zhì)提取工藝條件優(yōu)化

試驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，二次旋轉(zhuǎn)多元回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)。以提取時(shí)間(X1)、料液比(X2)、pH(X3)3個(gè)因素為自變量，以蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)

應(yīng)用SAS 9.0軟件對(duì)回歸系數(shù)顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

各因素經(jīng)回歸擬合后，解得回歸方程為：

Y=92.059 2-1.334 8X1-0.317 9X2+5.339 1X3-

8.682 1X1X1-9.826 4X2X2-7.665 4X3X3-

3.050 8X1X2-1.017 3X1X3+2.101 0X2X3。

式中：Y為蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；X1為提取時(shí)間；X2為料液比；X3為pH。

表3　回歸系數(shù)顯著性分析結(jié)果

表4　回歸方程檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)此二元回歸模型進(jìn)行方差分析，其回歸系數(shù)R2=0.9897，R2越接近1，證明擬合度越高，全體自變量與因變量之間的多元回歸關(guān)系就越顯著，且模型的p值小于0.01，表明該模擬二次方程極顯著，失擬性結(jié)果不顯著(p>0.05)，所以該模型的擬合度很好，可用該模型對(duì)未知條件下提取鹿茸蛋白的工藝進(jìn)行理論預(yù)測(cè)。由表5的p值可知，各因素對(duì)結(jié)果的影響由大到小為：pH值、提取時(shí)間、液料比。其中，X3、X1X1、X2X2、X3X3、X1X2對(duì)Y的影響極顯著(p<0.01)，X1、X2X3對(duì)Y的影響顯著(p<0.05)，說明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，其中二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響較大，交互項(xiàng)的作用較小。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面及等高線圖，考察所擬合的響應(yīng)面的形狀，分析3因素對(duì)蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。響應(yīng)面圖和等高圖見圖1。從pH與提取時(shí)間響應(yīng)面和等高線圖可以看出，最優(yōu)點(diǎn)趨近于pH=9.0和提取時(shí)間為6 h，并在這2點(diǎn)附近取得最大值。從等高線圖可看出，pH比提取時(shí)間對(duì)蛋白提取量的影響大。從pH與料液比響應(yīng)面和等高線可以看出，最優(yōu)點(diǎn)趨近于pH=9.0和料液比為1 g∶60 mL，并在這2點(diǎn)附近取得最大值。從等高線圖可看出，pH比料液比對(duì)蛋白提取量的影響大。從料液比與提取時(shí)間響應(yīng)面和等高線可以看出，最優(yōu)點(diǎn)趨近于料液比為1 g∶60 mL和提取時(shí)間為6 h，并在這2點(diǎn)附近取得最大值。從等高線圖可看出，料液比比提取時(shí)間對(duì)蛋白提取量的影響大。

利用SAS 9.0軟件對(duì)該試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行脊嶺分析，最終確定了鹿茸蛋白的最優(yōu)提取條件為pH=9.18，料液比1.0 g∶60.4 mL，提取時(shí)間5.90 h。

圖1　梅花鹿鹿茸蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與提取因素的響應(yīng)面和等高線圖

為了驗(yàn)證擬合數(shù)據(jù)的可行性，在得到的最佳提取條下，進(jìn)行鹿茸蛋白提取驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到實(shí)際平均蛋白提取量為90.84 mg·g-1，是理論預(yù)測(cè)值的97.54%，十分接近理論預(yù)測(cè)值。因此，響應(yīng)面法對(duì)鹿茸蛋白提取條件的優(yōu)化是可行的，得到的鹿茸蛋白的提取條件具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

2.3Sephadex G-100排阻層析結(jié)果

用Sephadex G-100葡聚糖凝膠對(duì)經(jīng)過初步分離得到的鹿茸蛋白進(jìn)行的純化、收集洗脫峰部分，結(jié)果見圖2。從圖2可知，經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析后得到了3個(gè)吸收峰，依次為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中第1個(gè)吸收峰較大，后兩個(gè)吸收峰較小，這說明鹿茸水溶性蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量范圍主要集中在這3處。

2.4蛋白分子質(zhì)量分布

用SDS-PAGE電泳測(cè)定粗蛋白及經(jīng)分離純化后蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布(圖3)。由圖3可以看出，3個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量從高到低依次為66 000、29 000和14 000，說明鹿茸中的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在這3個(gè)分子質(zhì)量范圍內(nèi)，且Sephadex G-100層析柱能夠有效地將鹿茸蛋白質(zhì)各個(gè)分子質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)分離開，效果顯著。

圖2　鹿茸水溶性蛋白質(zhì)Sephadex G-100凝膠排阻層析曲線

1.經(jīng)硫酸銨分離后的粗總蛋白；2.組分Ⅰ；3.組分Ⅱ；4.組分Ⅲ；5.蛋白Marker。

圖3鹿茸水溶性蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖

3結(jié)論

通過對(duì)梅花鹿鹿茸中的水溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行提取條件優(yōu)化并對(duì)其組分進(jìn)行分析可知：鹿茸水溶性蛋白質(zhì)的最佳提取條件為：pH=9.18，料液比1.0 g∶60.4 mL，提取時(shí)間5.9 h，在此條件下蛋白提取量為90.84 mg·g-1。通過Sephadex G-100凝膠層析，得到了3個(gè)吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定，相對(duì)分子質(zhì)量分別為66 000、29 000、14 000。鹿茸水溶性蛋白質(zhì)主要為小分子蛋白質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]傅雷,孫藝平,趙心宇,等.鹿茸的化學(xué)成分以及藥理作用研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2007,18(4):805-806.

[2]KIERDORF U, LI C Y, PRICE J S.Improbable appendages: Deer antler renewal as a unique case of mammalian regeneration[J].Seminars in Cell & Developmental Biology,2009,20(5):535-542.

[4]李和平.中國茸鹿品種(品系)的鹿茸化學(xué)成分[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,31(4):26-28.

[5]WU F F, LI H Q, JIN L J, et al.Deer antler base as a traditional Chinese medicine: A review of its traditional uses, chemistry and pharmacology[J].Journal of Ethnopharmacology,2013,145(2):403-415.

[6]桂麗萍,郭萍,郭遠(yuǎn)強(qiáng).鹿茸化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2010,33(3):237-240.

[7]SUI Z G, YUAN H M, LIANG Z, et al.An activity-maintaining sequential protein extraction method for bioactive assay and proteome analysis of velvet antlers[J].Talanta,2013,107(30):189-194.

[8]嚴(yán)銘銘.人參鹿茸中蛋白多肽的純化及活性研究[D].長春:長春中醫(yī)藥大學(xué),2007.

[9]董萬超,張秀蓮,劉春華,等.梅花鹿茸多肽新成分的提取分離及其生物效應(yīng)研究[J].特產(chǎn)研究,2000(2):7-10.

[10]王華,林喆,劉強(qiáng),等.鹿茸寡肽的制備及其促成骨細(xì)胞的增殖作用[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(9):1791-1796.

[11]王豐,梅子青,周秋麗,等.鹿茸多肽的分離純化及藥理活性[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2003,41(1):111-114.

第一作者簡介：趙玉紅，女，1968年8月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail：zhao@nefu.edu.cn。

收稿日期：2015年12月18日。

分類號(hào)S865.42；R284.2

Component and Optimization of Extraction Conditions for Water Soluble Protein from Deer Antler//

Zhao Yuhong(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R.China); Zhang Ligang(Northeast Agricultural University); Zhang Rui(Northeast Forestry University)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：120-124.

Antler velvet from Cervus nippon Temm inck was used as raw material, and water-soluble protein was extracted with buffer solution.The extraction condition was optimized by Box-Benhnken central composite experiment based on single factor tests.The components were analyzed with Sephadex G-100 gel filtration chromatography and SDS-PAGE.The optimized extraction conditions of water soluble protein were pH of 9.18, solid-liquid ratio of 1.0 g∶60.4 mL, and extraction time of 5.9 h with the protein yield of 90.84 mg/g.Three peaks were got with Sephadex G-100 gel filtration chromatography.The molecular weight of protein was investigated by SDS-PAGE with 66 kD, 29 kD and 14 kD.Water-soluble protein from antler velvet was small molecular protein.

KeywordsCervus nippon Temminck; Deer antler; Water soluble protein

1)中央高?？茖W(xué)前沿與交叉學(xué)科創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2572014CAQ02)；黑龍江省高校科技成果產(chǎn)業(yè)化前期研發(fā)培育項(xiàng)目(1254CGZH14)。

責(zé)任編輯：程紅。