液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定牛奶中三聚氰胺的不確定度分析*

李研東，李肖莉，金世清，王振來，韓 雪（.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050035；.河北科技大學(xué)，石家莊 050000）

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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定牛奶中三聚氰胺的不確定度分析*

李研東1，李肖莉1，金世清1，王振來1，韓 雪2
（1.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050035；2.河北科技大學(xué)，石家莊 050000）

摘 要：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22388-2008第二法，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定了牛奶中三聚氰胺含量，對整個測量過程的不確定度來源進(jìn)行了分析，并對不確定度各分量進(jìn)行了評定和合成。結(jié)果顯示，重復(fù)性測量不確定度分量對總不確定度的影響不明顯。因此，該實驗室牛奶中三聚氰胺含量的內(nèi)標(biāo)測定方法準(zhǔn)確性較高，達(dá)到國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求。

關(guān)鍵詞：牛奶中三聚氰胺 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 內(nèi)標(biāo)法 測量不確定度

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquicy UPLC Xevo Tq-S，美國Waters公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99%；三聚氰胺內(nèi)標(biāo)：純度大于99%；固相萃取凈化柱：MCX型，美國Waters公司；電子分析天平：BP221S型，感量0.1 mg，德國Sartorius公司；電子天平：JJ2000型，感量0.01 g，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

乙腈使用色譜純乙腈，默克公司；水使用超純水，屈臣氏公司。乙酸銨、三氯乙酸使用分析純試劑。

1.2 測量方法

試樣用三氯乙酸溶液一乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)法定量。測定步驟見圖1。

2 數(shù)學(xué)模型

待測樣品中三聚氰胺含量按公式計算（1）：

式中：X——待測樣品中三聚氰胺含量，mg/kg；

c——待測樣品中三聚氰胺濃度，μg/L；

V——待測樣品最終定容體積，ml；

m——樣品質(zhì)量，g；

f——稀釋倍數(shù)。

引入內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)因子進(jìn)行計算（2）：

式中：A1——標(biāo)準(zhǔn)中三聚氰胺內(nèi)標(biāo)峰面積；

A2——三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)對照品峰面積；

d2——標(biāo)準(zhǔn)中內(nèi)標(biāo)液濃度；

d1——三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液濃度；

3 識別和分析不確定度來源

LC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法測定三聚氰胺含量，其不確定度的來源包括以下幾個方面：（1）重復(fù)性測定引入的不確定度。（2）檢測方法引入的不確定度。（3）標(biāo)準(zhǔn)（內(nèi)、外標(biāo)）工作溶液引入的不確定度：包括標(biāo)準(zhǔn)樣品引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)樣品稱量引人的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液添加引入的不確定度。（4）待測樣品溶液定容體積引入的不確定度。（5）待測樣品稱量引入的不確定度。（6）其它不確定度來源。充分考慮所有不確定度貢獻(xiàn)因素。

圖1 三聚氰胺測定過程

4 測量不確定度評定

4.1 重復(fù)測定引入的不確定度評定

實驗按照標(biāo)準(zhǔn)對同一牛奶樣品中的三聚氰胺采取10次平行測定，測定結(jié)果見表1。

計算重復(fù)性測量不確定度：

相對不確定度：

1.2 檢測方法引入的不確定度評定

通過測定加標(biāo)樣品回收率的偏差分析來進(jìn)行方法引入的不確定度評定?；厥章式Y(jié)果見表2。

結(jié)果計算了20個樣品的平均回收率為90%，回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差為16%。標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

檢測統(tǒng)計數(shù)據(jù)t用下式來計算：

這個數(shù)據(jù)與95%置信度，n-1自由度的雙邊臨界值tcrit比較（其中n=20是用來評估（Rec的測試結(jié)果的數(shù)目），t大于或等于tcrit值，說明Rec與1有顯著性差異。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)品的純度和標(biāo)準(zhǔn)液移取、稀釋和定容等操作引起。

4.3.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)）的純度

4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

用準(zhǔn)確至0.1 mg的電子分析天平稱取100 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，不確定度主要由環(huán)境、天平校準(zhǔn)、稱量線性所產(chǎn)生。固體稱量受環(huán)境影響一般可忽略，而稱量線性在重復(fù)性中已經(jīng)評定，因此稱量過程中所引入的不確定度來自天平校準(zhǔn)。天平最大誤差為0.1 mg，兩次減量法稱量引入的不確定度屬于B類不確定度。按均勻分布處理，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)純度一致，配置方法一致，所以內(nèi)標(biāo)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度也是0.01。

4.5 待測樣品溶液定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

該方法中待測樣品溶液的最終定容體積為1.0 ml，1 ml A級移液管的最大誤差為0.008 ml，按均勻分布處理，待測樣品溶液定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定為urel（V樣）=0.004 6。

4.6 待測樣品稱量引入的不確定度

4.7 樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度

樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液的測量不確定度與4.4的不確定度評定多了0.1 ml分度移液管的不確定度，少了一個10 ml容量瓶引起的不確定度，0.1 ml分度移液管容量允差為0.002 ml，經(jīng)計算得urel（V0.1）=0.012，因此樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度為：

表1 樣品中三聚氰胺測定的結(jié)果 　mg/kg

表2 加標(biāo)樣品測定的回收率結(jié)果

4.8 串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度

4.9 其它不確定度因素：牛奶樣品中三聚氰胺分布不均勻引入的不確定度

不均勻性是樣品的一種基本屬性，它體現(xiàn)了樣品各特性量值存在的分散性。當(dāng)這種分散性相對于特性量值測量的分散性可以忽略時，認(rèn)為樣品是均勻的。通過一個修正因子來反映的數(shù)學(xué)期望值應(yīng)為1，但其不確定度卻不為零。而奶樣經(jīng)過搖勻處理，使其不均勻性降到最小，通過重復(fù)性測量已經(jīng)把不均勻性引入的不確定度包含在內(nèi)，因此不再單獨考慮。

5 合成不確定度

以上各不確定度分量互不相關(guān)，則三聚氰胺檢測結(jié)果的相對不確定度為：

6 擴(kuò)展不確定度與測定結(jié)果的表示

參考文獻(xiàn)

［1］ GB/T 22388—2008 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法

［2］ JJF 1059.1—2012測量不確定評定和表示

［3］ JJG 196—1990玻璃儀器檢定規(guī)程

*資助項目：河北省科技計劃項目（15277107D）；河北省自然科學(xué)基金（C2014208064）；河北省畜牧獸醫(yī)局科技項目（2014-1-03）