黃連上清丸、護(hù)肝片及牛黃解毒丸對(duì)藥物代謝酶CYP3A4活性的影響

周國堅(jiān)　葉董婷　鄧旭杏

1.珠海市第二人民醫(yī)院，廣東　珠?！?19020；2.佛山市仁匯醫(yī)藥科技有限公司，廣東　佛山　528000

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黃連上清丸、護(hù)肝片及牛黃解毒丸對(duì)藥物代謝酶CYP3A4活性的影響

周國堅(jiān)1葉董婷2鄧旭杏2

1.珠海市第二人民醫(yī)院，廣東珠海519020；2.佛山市仁匯醫(yī)藥科技有限公司，廣東佛山528000

【摘要】目的：觀察黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸對(duì)CYP3A4活性的影響。方法：利用體外肝微粒體培育體系，以咪達(dá)唑侖作為探針底物，研究黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸對(duì)人肝微粒體細(xì)胞色素 P4503A4(CYP3A4)活性的影響。結(jié)果：與空白組對(duì)比，黃連上清丸、牛黃解毒丸對(duì)CYP3A4活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，護(hù)肝片對(duì)CYP3A4活性表現(xiàn)為抑制作用。結(jié)論：在與臨床上經(jīng) CYP3A4代謝的藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，應(yīng)警惕黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸潛在藥物之間的相互作用。

【關(guān)鍵詞】黃連上清丸；護(hù)肝片；牛黃解毒丸；細(xì)胞色素 P4503A4

細(xì)胞色素P450酶是人體內(nèi)的肝藥酶，廣泛分布于肝臟等器官。研究發(fā)現(xiàn)，有20多種同工酶與藥物代謝相關(guān)性高，共同參與人體內(nèi)300余種藥物的代謝[1]。多種藥物同時(shí)使用時(shí)，若其中藥物是CYP3A4的誘導(dǎo)劑或抑制劑，則會(huì)顯著影響合用中其他藥物的代謝，也會(huì)對(duì)其他藥物的療效產(chǎn)生影響。研究表明，多種中藥提取物對(duì)P450活性有一定影響，如銀杏、五味子、白芷、羌活等甲醇提取物對(duì)CYP3A4有抑制作用[2-3]。利用體外實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)是否發(fā)生藥物代謝性相互作用，是藥物代謝研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。研究黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸對(duì)重組人肝微粒體細(xì)胞色素酶rCYP3A4的影響，結(jié)果如下。

1儀器與材料

1.1儀器MINI-10K微型離心機(jī)(常州朗越儀器制造有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；XH-C旋渦混合器(常州朗越儀器制造有限公司)；DW-86L386立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；LC3000高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)。

1.2材料人重組肝細(xì)胞微粒體CYP3A4(批號(hào)：M41013，SPIBIO產(chǎn))；咪達(dá)唑侖注射液(批號(hào)：20140607，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；1-羥基咪達(dá)唑侖(批號(hào)：FN08081402，Cerilliant)；卡馬西平(批號(hào)：100142-201105，中國食品藥品檢定研究院)；酮康唑(批號(hào)：SM0325YF13，上海源葉生物科技有限公司)；NADPH(批號(hào)：WO1028EA14，上海源葉生物科技有限公司)。黃連上清丸(批號(hào):14060026，太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司)；牛黃解毒丸(批號(hào)：13012307，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)；護(hù)肝片(批號(hào)：201405102，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)。乙腈(批號(hào)：20141021，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；甲醇(批號(hào)：20140723，廣東光華科技股份有限公司)；磷酸氫二鉀(批號(hào)：20140701-2，廣州化學(xué)試劑廠)；三羥甲基氨基甲烷(批號(hào)：TA0429CA14，上海源葉生物科技有限公司)；無水氯化鎂(批號(hào)：20140412，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；碳酸氫鈉(批號(hào)：20140701-1，廣州化學(xué)試劑廠)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液的配制

2.1.1咪達(dá)唑侖的配制精密吸取咪達(dá)唑侖注射液360μl(相當(dāng)于咪達(dá)唑侖1.8mg)，置于5ml容量瓶中，用純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度均為1.0mmol/l的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱備用。精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加入純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度為100μmol/l的咪達(dá)唑侖溶液。

2.1.21-羥基咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密吸取100μl 1-羥基咪達(dá)唑侖于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1μg/ml的儲(chǔ)備液，精密吸取1ml 100μl 1-羥基咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液于10ml容量瓶中，甲醇定容制刻度，得到100ng/ml的儲(chǔ)備液，置于冰箱4℃下保存待用。 2.1.3卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取10.0mg卡馬西平于10ml容量瓶中，用乙腈定容得到1mg/ml的卡馬西平儲(chǔ)備液，從儲(chǔ)備液中精密吸取20.0μl到10ml容量瓶中，用乙腈定容得到濃度為2.00μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的配制 取磷酸二氫鉀1.36g，加 0.1mol/l氫氧化鈉溶液79ml，用水稀釋至200ml，即得PBS溶液。2.1.5陽性抑制劑酮康唑的配制精密稱取酮康唑26.5mg于5ml容量瓶中，用PBS溶液(pH 7.4)溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為10.0mmol/l的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱備用。

2.1.6氯化鎂溶液的配制精密稱量47.5mg氯化鎂于10ml容量瓶中，用PBS溶液(pH 7.4)充分溶解，定容搖勻，得到50.00mmol/l的氯化鎂溶液。

2.1.7NADPH溶液的配制精密稱量8.3mg的NADPH用PBS溶液(pH 7.4)稀釋得到濃度為10.0mmol/l的NADPH，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃冰箱避光保存。

2.1.8人重組肝細(xì)胞微粒體CYP3A4的配制精密吸取100μl人重組肝細(xì)胞微粒體 CYP3A4，置于1ml容量瓶，用PBS溶液(pH 7.4)配制成濃度為100pmol/l的溶液，置于-20℃冰箱中保存。

2.2孵育體系與樣品處理[4-5]

2.2.1孵育體系肝微粒體體外孵育體系的總體積為200μl：20μlCYP3A4(終濃度為10pmol·l-1)，20μl氯化鎂(終濃度為5.00mmol·l-1)，10μl咪達(dá)唑侖(終濃度為5μmol·l-1)，剩余體積用PBS緩沖溶液(pH7.4)補(bǔ)充，37℃水浴中孵育5min后，加入20μl NADPH(終濃度為1.0mmol/l)啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)5min。2.2.2樣品處理孵育結(jié)束后，馬上向孵育體系中加入100μl冰乙腈(含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)-卡馬西平2μg/ml)終止反應(yīng)，渦旋混合1min，-20℃下放置10min，10000r/min高速離心10min，取上清液過濾，吸取20μl注入到HPLC儀中測(cè)定。

2.3色譜條件[6]色譜柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.00ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長：230nm；流動(dòng)相：10.0mmol/L醋酸銨緩沖液-甲醇(42∶58)；進(jìn)樣量：20μl。

2.4分組與給藥[7]體外孵化反應(yīng)分為陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和試藥組。陰性對(duì)照組中加入磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，陽性對(duì)照組中加入酮康唑溶液(0.0125、0.025、0.05、0.1、0.5、1、10、50μmol/l)；試藥組給予以磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋的不同濃度的中成藥溶液。孵育體系總體積均為200μl，根據(jù)“2.2孵育體系與樣品處理”項(xiàng)下進(jìn)行反應(yīng)并處理。將所有樣品按“2.3色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的生成率可確定 CYP3A4酶的相對(duì)活性(即試藥組占陰性對(duì)照組生成率的百分比)，計(jì)算半數(shù)抑制率(IC50)。

表1　反應(yīng)體系　(200μl)

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取6只EP管，加入1-羥基咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液，使1-羥基咪達(dá)唑侖的終濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000ng/ml，按照體外孵育和樣品處理方法“2.2孵育體系與樣品處理”項(xiàng)操作，取上清液20μl進(jìn)樣，以1-羥基咪達(dá)唑侖和卡馬西平的峰面積比值(Y)和含量(X)進(jìn)行加權(quán)回歸。

2.6酮康唑IC50的測(cè)定及抑制活性的評(píng)價(jià)在肝微粒體孵育體系中陽性抑制劑酮康唑?qū)YP3A4介導(dǎo)的咪達(dá)唑侖1-羥基化反應(yīng)有強(qiáng)抑制作用。陽性對(duì)照組中加入酮康唑溶液，使其終濃度為：0.025、0.1、0.5、1、10、50μmol/l，根據(jù)“2.2孵育體系與樣品處理”項(xiàng)下進(jìn)行反應(yīng)并處理，根據(jù)1-羥基咪達(dá)唑侖的生成率來確定 CYP3A4酶的相對(duì)活性(即實(shí)驗(yàn)組占陰性對(duì)照組生成率的百分比)，計(jì)算半數(shù)抑制率IC50。

2.7對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選

2.7.1樣品配制[7]根據(jù)說明書，分別取治療量的黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸，經(jīng)處理后，分別置于100ml容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，超聲30min，濾過，濾液作為儲(chǔ)備液。將中成藥分為低、中、高劑量組，低、高劑量組則分別為中劑量組的1/2 和2 倍。并同時(shí)設(shè)置空白組。每個(gè)樣品平行做3份。

2.7.2酶孵化的條件反應(yīng)體系中先分別加入PBS(pH7.4)、咪達(dá)唑侖、氯化鎂、rCYP3A4和待測(cè)藥物的儲(chǔ)備液，置于37℃水浴中預(yù)孵化振蕩5 min后，加入NADPH生成系統(tǒng)啟動(dòng)孵化反應(yīng)。37℃水浴振蕩反應(yīng)5min后，加入冰乙腈(含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)-卡馬西平2μg/ml)終止反應(yīng)。渦旋混合1 min，-20℃下放置10min ，10000rpm離心5 min，取上清液過濾，吸取濾液20μl注入HPLC儀中，按“2.3色譜條件”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定咪達(dá)唑侖代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的濃度。

2.7.3代謝產(chǎn)物的測(cè)定使用HPLC儀按“2.3色譜條件”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定1-羥基咪達(dá)唑侖與卡馬西平的含量，考察對(duì)CYP3A4活性影響較大的中成藥。代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的生成率越低，表示抑制作用越強(qiáng)。

表2　對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選

2.8對(duì)rCYP3A4活性抑制作用的強(qiáng)弱(IC50值)的計(jì)算

2.8.1酶孵化的條件參見“2.7對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選”項(xiàng)下“2.7.2酶孵化的條件”項(xiàng)操作。

2.8.2代謝產(chǎn)物的測(cè)定參見“2.7對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選”項(xiàng)下“2.7.3酶孵化的條件”項(xiàng)操作。

2.8.3IC50的測(cè)定 通過體外初步篩選后，在固定CYP3A4濃度、探針底物咪達(dá)唑侖濃度和NADPH濃度的同時(shí)，改變待測(cè)中成藥的濃度，測(cè)定不同濃度下中成藥對(duì)1-羥基咪達(dá)唑侖生成率的影響，判斷對(duì)CYP3A4的抑制程度，估計(jì)中成藥對(duì)rCYP3A4活性的影響強(qiáng)弱。以中成藥濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，CYP3A4酶的相對(duì)活性(%)表示為縱坐標(biāo)(Y)，計(jì)算IC50值和95%的可信范圍[8]，計(jì)算公式為：Y=min×(max-min)/ [1+10^(X-LogIC50)]。

3結(jié)果

3.1專屬性考察按“2.3色譜條件”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，1-羥基咪達(dá)唑侖，卡馬西平的分離度好(>1.5)，1-羥基咪達(dá)唑侖與卡馬西平出峰時(shí)間分別在15.4min，8.6min。見圖1-3。

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線以1-羥基咪達(dá)唑侖和卡馬西平的峰面積比(Y)和含量(X)進(jìn)行加權(quán)回歸，得到Y(jié)=0.0013X+0.0024 (R2=0.9937，n=6)，表明1-羥基咪達(dá)唑侖在10-1000ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖4。

3.3陽性對(duì)照組酮康唑?qū)CYP3A4酶相對(duì)活性計(jì)算 IC50為0.06538μmol/l，95%區(qū)間為0.04542～0.0941，符合文獻(xiàn)[8]范圍(0.06～0.16μmol/l)，表明所用的孵育體系可以滿足CYP3A4酶抑制活性的評(píng)價(jià)及測(cè)定其他抑制劑IC50的要求。

3.4對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選由表3可看出：黃連上清丸、牛黃解毒丸對(duì)CYP3A4酶表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，護(hù)肝片對(duì)CYP3A4酶表現(xiàn)出抑制作用。

表3　對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選　

組別1-羥基咪達(dá)唑侖含量/ng/ml空白組小劑量組中劑量組大劑量組牛黃上清丸101.5±21.67162.3±12.57315.1±26.38523.9±41.69牛黃解毒丸69.96±15.7691.28±25.96233.9±41.68576.6±51.31護(hù)肝片69.38±3.85153.01±2.88113.98±3.3655.610±4.520

3.5對(duì)rCYP3A4活性抑制作用護(hù)肝片的IC50值與95%區(qū)間見表4。

表4　對(duì)rCYP3A4活性抑制大小

4討論

CYP3A4肝臟和腸道重要代謝酶，含量可達(dá)到肝臟CYP450總量的60%，腸道CYP450總量的70%[9]，是藥物代謝的主角。中成藥說明書中【藥物相互作用】欄均未見報(bào)道，只是簡(jiǎn)單書寫“如與其他藥物同時(shí)使用可能會(huì)發(fā)生藥物相互作用，詳情請(qǐng)咨詢醫(yī)師或藥師”。基于此，本研究對(duì)完善中成藥的說明書有一定幫助作用，對(duì)臨床合理用藥提供參考性依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連上清丸、牛黃上清丸對(duì)CYP3A4有誘導(dǎo)作用，護(hù)肝片對(duì)CYP3A4有抑制作用，護(hù)肝片的IC50為4.055g，因此在使用時(shí)，要考慮其潛在的藥物相互作用。

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基金項(xiàng)目：珠海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育局醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)資助項(xiàng)目(編號(hào)：2013061)。

作者簡(jiǎn)介：周國堅(jiān)(1980-)，男，本科，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)研究。

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)10-0018-03

(收稿日期：2016.03.28)