降脂藥物對小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶3表達的影響

劉　莉　鄧遠飛　趙　雷

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院特診老年病科，廣東　深圳　518036)

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降脂藥物對小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶3表達的影響

劉莉鄧遠飛趙雷

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院特診老年病科，廣東深圳518036)

〔摘要〕目的研究降脂藥物對小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3表達的影響，分析降脂藥物對頸動脈粥樣硬化斑塊的作用。方法對照組：10只28周齡SPF級普通雄性小鼠，給予普通飲食，喂養(yǎng)12 w。實驗組：20只28周齡載脂蛋白E基因(ApoE)敲除雄性小鼠，給予高脂飲食，喂養(yǎng)12 w后，隨機分為非治療組(10只)，直接進入實驗程序；治療組(10只)給予阿托伐他汀鈣片灌胃+普通飲食，繼續(xù)喂養(yǎng)12 w，進入實驗程序：檢測各組小鼠血清MMP-3，并分離各組小鼠頸動脈，通過免疫組化分析斑塊內(nèi)MMP-3的表達。結(jié)果與對照組比較，非治療組血清MMP-3明顯升高(P<0.01)。非治療組斑塊內(nèi)MMP-3的表達明顯增加(P<0.01)。與非治療組比較，治療組血清MMP-3明顯下降(P<0.05)。治療組斑塊內(nèi)MMP-3的表達明顯下降(P<0.05)。結(jié)論動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，MMP-3起到重要作用，動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定與MMP-3的表達增高密切相關(guān)。降脂治療可使斑塊內(nèi)MMP-3降低，使斑塊縮小。

〔關(guān)鍵詞〕頸動脈粥樣硬化斑塊；基質(zhì)金屬蛋白酶3；血脂

急性心腦血管事件的主要病理生理機制是動脈粥樣硬化(AS)以及在此基礎(chǔ)上發(fā)生的斑塊破裂導(dǎo)致動脈阻塞、狹窄。本研究以ApoE基因敲除小鼠為動物模型，觀察基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3在頸AS斑塊中的表達，探討MMP-3在AS中的作用機制及降脂藥物對頸AS斑塊內(nèi)MMP-3表達的影響。

1材料與方法

1.1動物及分組對照組：10只28周齡SPF級普通雄性小鼠，給予普通飲食，喂養(yǎng)12 w。實驗組：20只28周齡載脂蛋白E基因(ApoE)敲除雄性小鼠，給予高脂飲食，喂養(yǎng)12 w后，隨機分為非治療組(10只)，直接進入實驗程序；治療組(10只)給予普通飲食及阿托伐他汀鈣(立普妥，輝瑞制藥有限公司)用0.9%生理鹽水稀釋后，以2.5 mg/kg濃度0.5 ml灌胃，每日1次，繼續(xù)喂養(yǎng)12 w。實驗動物均購自南京大學(xué)模式動物研究所。

1.2血清MMP-3濃度檢測將水合氯醛0.8 ml注入小鼠腹腔麻醉，自股動脈取血，自然凝固30 min后常溫3 000 r/min離心15 min，分離血清，由實驗中心專業(yè)檢驗員嚴格按說明書的步驟操作，采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清MMP-3濃度，在450 nm處測定OD值(MMP-3試劑盒購自美國Rapidbio公司)。

1.3免疫組化檢測在頸部分離皮膚、皮下組織，取下頸動脈。10%甲醛固定，石蠟包埋，均勻切片，切片厚度為4 μm，做HE染色，普通光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。采取二步法對病理標(biāo)本進行免疫組化檢測(鼠抗人MMP-3免疫組化單克隆抗體和免疫組化試劑盒均購自丹麥DAKO公司)。實驗操作嚴格按試劑盒說明書進行，普通光鏡下觀察，每例隨機觀察5個高倍鏡(400個細胞視野)，免疫組化陽性染色為細胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，根據(jù)染色強度分4級：-，無陽性細胞；+，陽性細胞<30%；，陽性細胞30%～60%，，陽性細胞>60%。-～+為低表達，～為高表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS10.0軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1血清MMP-3水平對照組血清MMP-3水平為(11.06±7.19)μg/L，非治療組血清MMP-3水平為(20.18±8.03)μg/L明顯升高(P<0.01)。治療組血清MMP-3水平(15.21±8.23)g/L較非治療組下降(P<0.05)。

2.2免疫組化與對照組相比，非治療組陽性細胞百分比明顯增加，斑塊內(nèi)MMP-3的表達顯著高于對照組(P<0.01)。治療組陽性細胞百分比較非治療組下降，斑塊內(nèi)MMP-3的表達低于非治療組(P<0.05)。見表1，圖1。

表1　小鼠頸動脈斑塊內(nèi)MMP-3表達(n=10,n)

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

圖1　各組大鼠頸動脈AS斑塊內(nèi)MMP-3表達(DAB，×40)

3討論

MMPs是降解細胞外基質(zhì)(ECM)最重要的酶類，MMPs含量增高使ECM過度降解，削弱纖維帽的結(jié)構(gòu)，促進血管平滑肌細胞的增殖、移行，影響損傷后血管重構(gòu)等途徑，使動脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定斑塊向不穩(wěn)定斑塊轉(zhuǎn)變，從而誘發(fā)斑塊破裂，導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生〔1〕。MMP-3又稱基質(zhì)溶解素-1，可激活MMP-1，MMP-8，MMP-9，使之由非活性的酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶而起生物作用，并共同參與ECM的降解及斑塊破裂的過程〔2，3〕，與AS形成以及斑塊的破裂有密切關(guān)系。

ApoE基因敲除小鼠由于ApoE基因敲除后造成血漿含膽固醇豐富的殘粒清除受阻，在短期內(nèi)可模擬人類的AS病變發(fā)病〔4〕。應(yīng)用ApoE基因敲除小鼠建立AS模型炎性反應(yīng)明顯，形成明確的不穩(wěn)定斑塊。其巨噬細胞、T細胞和平滑肌細胞的生理反應(yīng)和人類心血管疾病中的反應(yīng)極為相似〔5〕。

本研究顯示，實驗組血清MMP-3水平增高，在不穩(wěn)定斑塊中，脂質(zhì)含量豐富，巨噬細胞增多，MMP-3的表達過量，證明了AS斑塊的不穩(wěn)定與MMP-3的表達增高密切相關(guān)及血清MMP-3水平升高有關(guān)〔6，7〕。而起修復(fù)作用的平滑肌細胞因老化凋亡等原因數(shù)量下降，ECM的合成與降解不平衡導(dǎo)致斑塊易破裂。有研究顯示，MMP-3在AS斑塊的進程中起作用，而不是在心肌梗死急性期〔8〕，所以，MMP-3可作為急性心腦血管疾病的一個預(yù)測因子，對于MMP-3與AS斑塊的研究值得更深入地探討。

有研究認為，低密度脂蛋白升高可使斑塊局部的MMP-3分泌增加，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定〔1〕。所以降低低密度脂蛋白可以降低斑塊內(nèi)的MMP-3，起到穩(wěn)定斑塊的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物有不依賴降脂作用的抑制MMPs的作用，有助于穩(wěn)定斑塊〔9〕。阿托伐他汀鈣可顯著降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白，本研究證實調(diào)脂治療可使小鼠血清MMP-3水平下降，動脈斑塊內(nèi)MMP-3表達下降，陽性細胞百分比明顯減少，動脈斑塊縮小，從而起到抑制動脈硬化進展和穩(wěn)定斑塊的作用。

4參考文獻

1Jones CB，Sane DC，Herrington DM.Matrix metalloproteinase：a review of their structure and role in acute coronary syndrome〔J〕.Cardiovasc Res，2003；59(4)：812-23.

2Newby AC.Dual role of matrix metalloproteinase(matrixins)in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture〔J〕.Physiol Rev，2005；85(1)：1-31.

3Sood RR，Taheri S，Caodelario-Jali E，etal.Early beneficial effect of matrix metalloproteinase inhibition on blood-brain barrier permeability as measured by magnetic resonance imaging countered by impaired long-term recovery after stroke in rat brain〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2008；28(2)：431-8.

4田楓，康愛君，張闊，等.載脂蛋白E基因敲除小鼠血小板與血脂及白細胞總數(shù)的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2006;26(10)：1392-3.

5Crisby M，Nordin-Fredriksson G，Shahp K，etal.Pravastain treatment increases collagen conetent and decreases lipid content inflammation，metalloproteinases，and cell death in human carotid plaques：implications for plaque stabilization〔J〕.Circulation，2001;103(7)：926-33.

6Ragino Jul，Cherniavskii AM，Polonskaia IV，etal.Inflammatory-destructive biomarkers of atherosclerotic plaques instability.Study of arterial wall and blood〔J〕.Kardiologiia，2010;52(5)：37-41.

7Moller MJ，Qin Z，Toursarkissian B，etal.Tissue markers in human atherosclerotic carotid artery plaque〔J〕.Ann Vasc Surg，2012;26(8)：1160-5.

8Samnegard A，Silveira A，Tornvall P，etal.Lower serum concentration of matrix metalloproteinase-3 in the acute stage of myocardial infarction〔J〕.J Int Med，2006;259(5)：530-6.

9Wilson SH，Herrmann J，Lerman LO，etal.Simvastatin preserves the structure of coronary adventitial vasa vasorum in experimental hypercholesterolemia independent of lipid lowering〔J〕.Circulation，2002;105(10)：415-8.

〔2015-01-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R543

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2842-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.006

第一作者：劉莉(1972-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年病研究。