回回甘松飲含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制

馬麗杰　袁　玲　南　一

(寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏　銀川　750004)

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回回甘松飲含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制

馬麗杰袁玲1,2南一2

(寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川750004)

〔摘要〕目的研究回回甘松飲(HGY)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及Ⅰ型膠原(ColⅠ)和纖維連接蛋白(FN)表達(dá)的影響。方法采用中藥血清藥理學(xué)方法制備含藥血清。實(shí)驗(yàn)共分為6組：5%空白血清組(NG)、高糖+5%空白血清組(HG)、高糖+5%福辛普利鈉含藥血清組(3 mg/kg)、高糖+5%HGY含藥血清組(20，10，5 g/kg)。細(xì)胞以4×104個(gè)/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，分別于藥物處理后24，48，72 h時(shí)，采用CCK-8法檢測(cè)NRK-52E增殖情況；細(xì)胞以4×104個(gè)/ml接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于藥物干預(yù)48 h時(shí)收集細(xì)胞，分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化，免疫酶聯(lián)吸附法檢測(cè)ColⅠ和FN蛋白的表達(dá)。結(jié)果與NG組比較，高糖(30 mmol/L)能夠誘導(dǎo)NRK-52E增殖(P<0.01)，并能使G0/G1期細(xì)胞比例減少(P<0.01)，S期比例增加(P<0.01)，能夠使NRK-52E中ColⅠ和FN蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。在上述含藥血清干預(yù)的24，48，72 h，各含藥血清組NRK-52E均受到一定程度抑制，發(fā)生G1/S期阻滯，并可降低高糖條件下NRK-52E中ColⅠ及FN蛋白表達(dá)量，與HG組比較有顯著差異(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論HGY含藥血清可抑制NRK-52E細(xì)胞在高糖環(huán)境下的細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞周期，其機(jī)制可能與調(diào)控ColⅠ和FN蛋白表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕回回甘松飲；腎小管上皮細(xì)胞；FN；ColⅠ

前期研究發(fā)現(xiàn)，基于回族醫(yī)學(xué)“四性學(xué)說(shuō)”理論，根據(jù)益稟補(bǔ)腎、化痰通絡(luò)治則，增減回醫(yī)藥中的特色“香藥”〔1〕，在回族醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作《回回藥方》原方“甘松丸子”基礎(chǔ)上組成的“回回甘松飲”〔2〕(國(guó)家發(fā)明專利：ZL201310205739.1)，對(duì)大鼠血糖、血脂及尿微量白蛋白水平均有調(diào)節(jié)作用，并能有效改善早期糖尿病大鼠腎臟的病理改變〔3〕，其含藥血清可使大鼠腎小球系膜細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生G1/S期阻滯，抑制其增殖，其機(jī)制可能與調(diào)控纖維連接蛋白(FN)，Ⅰ型膠原(ColⅠ)α1及ColⅣα1 mRNA表達(dá)有關(guān)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討回回甘松飲(HGY)在延緩糖尿病腎病(DN)腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠110只，體重180～200 g，SPF級(jí)，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：35796100CC58MM4D。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食和飲水。

1.1.2細(xì)胞株大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E：購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，資源編號(hào)3131C0001000500008。

1.1.3藥物與試劑HGY由甘松、木香、茴香、丁香、松蕈、大黃等13味藥物按照原方配比組成，方中各藥品經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院鑒定并制成配方顆粒，大鼠等效劑量按照人和動(dòng)物之間體表面積折算的等效劑量比計(jì)算，按生藥量計(jì)質(zhì)量濃度為2.0、1.0、0.5 g/ml分別設(shè)高、中、低劑量。福辛普利鈉片(Fos,商品名：蒙諾)，10 mg/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19980197，臨用前使用蒸餾水將其配制成質(zhì)量濃度為0.3 mg/ml的混懸液。Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本，Dojindo公司)，胎牛血清(美國(guó)，Gibco公司)，DMEM-F12培養(yǎng)基(美國(guó)，Gibco公司)，大鼠FN酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國(guó)，AssayPro公司)，大鼠ColⅠ酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國(guó)，Cygnus公司)。

1.1.4儀器SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇潔凈化公司)，HealForce100型CO2培養(yǎng)箱(香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)，F(xiàn)lexStation 3型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)，5804R型超速低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，DHG-9070型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，XP205分析天平(瑞士Mettler Toledo)。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備健康雄性SD大鼠110只隨機(jī)分為Fos(3 mg/kg)含藥血清組、HGY(5，10，20 g/kg)含藥血清組各20只，空白血清組30只。每天按照相應(yīng)劑量分別對(duì)Fos和HGY含藥血清組大鼠進(jìn)行灌胃給藥，空白血清組大鼠等體積蒸餾水灌胃，2次/d，連續(xù)給藥3 d，于末次給藥1 h后，股動(dòng)脈取血，離心后提取血清，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，過(guò)濾除菌后，分裝凍存于-80℃冰箱。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM-F12培養(yǎng)基(含有5%胎牛血清)，將細(xì)胞在5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組選取大鼠腎小管第4～9代上皮細(xì)胞NRK-52E進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)共分為6組：①5%空白血清組(NG)：給予5%空白血清組大鼠血清；②高糖+5%空白血清組(HG)：給予30 mmol/L葡萄糖+5%空白血清組大鼠血清；③高糖+5%Fos(3 mg/kg)含藥血清組(HG+Fos 3 mg/kg)：給予30 mmol/L葡萄糖+5%Fos(3 mg/kg)組大鼠血清；④高糖+5%HGY(5 g/kg)含藥血清組(HG+HGY 5 g/kg)：給予30 mmol/L葡萄糖+5%HGY(5 g/kg)組大鼠血清；⑤高糖+5%HGY(10 g/kg)含藥血清組(HG+HGY 10 g/kg)：給予30 mmol/L葡萄糖+5%HGY(10 g/kg)組大鼠血清。⑥高糖+5%HGY(20 g/kg)含藥血清組(HG+HGY 20 g/kg)：給予30 mmol/L葡萄糖+5%HGY(20 g/kg)組大鼠血清。

1.2.4藥物處理待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)，制備細(xì)胞懸液，根據(jù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E生長(zhǎng)曲線結(jié)果接種細(xì)胞，在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，除去上清液，加入無(wú)胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液，在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于G0期；同步化處理后，采用只含有大鼠血清的DMEM-F12培養(yǎng)基干預(yù)上述6組細(xì)胞，在含藥血清干預(yù)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.5指標(biāo)檢測(cè)

1.2.5.1CCK-8法繪制腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E生長(zhǎng)曲線待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%的融合時(shí)，采用0.25%+EDTA胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml、2×104/ml、4×104/ml、8×104/ml、1×105/ml五個(gè)濃度，接種于96孔板，每孔100 μl，設(shè)10個(gè)復(fù)孔重復(fù)。培養(yǎng)6、12、36、60 h，在不同的觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度OD值。

1.2.5.2CCK-8法確定最適高糖濃度根據(jù)前面繪制的NRK-52E細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上以4×104/ml密度接種腎小管上皮細(xì)胞，每孔100 μl，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，設(shè)5個(gè)復(fù)孔重復(fù)。細(xì)胞進(jìn)行同步化后分為7組：不加葡萄糖組(control)及分別含5、10、15、20、25、30、35 mmol/L葡萄糖的高糖組，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，分別于24、48、72 h除去上清后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，并在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃反應(yīng)1～2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度OD值。

1.2.5.3含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上以4×104/ml密度接種腎小管上皮細(xì)胞，每孔100 μl，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，設(shè)5個(gè)復(fù)孔重復(fù)。細(xì)胞進(jìn)行同步化后，分別于24，48，72 h于含藥血清處理后結(jié)束培養(yǎng)。應(yīng)用酶標(biāo)儀(參考波長(zhǎng)630 nm，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm)進(jìn)行吸光度(A)檢測(cè)。根據(jù)測(cè)得的吸光度值計(jì)算增殖抑制率。

1.2.5.2含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞周期的影響在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中以4×104/ml密度接種腎小管上皮細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每組3瓶重復(fù)。細(xì)胞進(jìn)行同步化后，按照上述藥物分組方法進(jìn)行干預(yù)，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，以1 000 r/min離心5 min，去上清液后加入預(yù)冷的70%乙醇固定24 h后，1 000 r/min離心5 min，除去上清液，使用PBS清洗后，1 000 r/min離心5 min，并重復(fù)1次，再次除去上清液后，將100 μl RnaseA分別加入各組細(xì)胞中，37℃水浴30 min，將400 μl PI染液分別加入各組細(xì)胞中，避光染色30 min；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞在各細(xì)胞周期(G0/G1，S，G2/M)所占比例的變化。

1.2.5.3含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞中ColⅠ和FN含量的影響細(xì)胞以4×104/ml密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每組10瓶重復(fù)。細(xì)胞進(jìn)行同步化后，按照上述藥物分組方法進(jìn)行干預(yù)，48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附方法，應(yīng)用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行蛋白特異性檢測(cè)，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程分別計(jì)算各組細(xì)胞在含藥血清干預(yù)后的ColⅠ和FN的蛋白濃度。

2結(jié)果

2.1大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E生長(zhǎng)曲線如圖1所示，細(xì)胞濃度為4×104/ml時(shí)，NRK-52E細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)生長(zhǎng)曲線斜率最大，按此接種濃度生長(zhǎng)，基本符合細(xì)胞生長(zhǎng)的一般規(guī)律。因此，以4×104/ml作為本實(shí)驗(yàn)研究的最適接種濃度。

圖1　大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E生長(zhǎng)曲線

2.2最適高糖濃度30 mmol/L和35 mmol/L葡萄糖組在24、48、72 h的增殖情況最明顯，但由于35 mmol/L葡萄糖組在72 h增殖情況不及48 h，說(shuō)明72 h時(shí)出現(xiàn)了抑制細(xì)胞增殖情況，故該濃度過(guò)高。所以，30 mmol/L葡萄糖對(duì)于大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E的誘導(dǎo)增殖情況較為明顯且穩(wěn)定，故選取30 mmol/L作為本研究中最適高糖濃度。見(jiàn)圖2。

圖2　不同葡萄糖濃度對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖的影響

2.3含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響在高糖刺激24、48、72 h時(shí)，HG組細(xì)胞增殖情況與NG組相比具有顯著性差異(P<0.01)。與HG組比較，在高糖刺激24、48、72 h時(shí)，各藥物組大鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖均呈現(xiàn)抑制作用，其增殖情況與HG組比較均具有顯著差異(P<0.01)。HG+HGY 20 g/kg組在干預(yù)24 h時(shí)較HG+Fos 3 mg/kg組抑制效果顯著；在高糖刺激48 h時(shí)，含藥血清干預(yù)的各組無(wú)顯著性差異；在干預(yù)的72 h時(shí)HG+HCY 10 g/kg組及HG+HCY 5 g/kg組較HG+Fos 3 mg/kg組抑制效果顯著，見(jiàn)表1。綜合24、48、72 h的增殖抑制率，可知HG+HGY 20 g/kg平均抑制率最高，對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯。見(jiàn)表2。

2.4含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞周期的影響與NG組比較，HG組可以明顯減少的G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞比例，使S期的細(xì)胞比例增加(P<0.01)；與HG組比較，HG+HGY 20 g/kg組可以明顯增加G0/G1期的細(xì)胞比例，使S期的細(xì)胞比例減少(P<0.05或P<0.01)，HG+HGY 10 g/kg組在G2/M期比例減少顯著(P<0.01)，HG+HGY 5 g/kg組在S期和G2/M期比例減少顯著(P<0.01)。見(jiàn)表3。

2.5含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞ColⅠ和FN蛋白的影響與NG組比較，HG組FN及ColⅠ水平均明顯升高(P<0.01)；與HG組比較，各給藥組FN及ColⅠ水平均有不同程度降低(P<0.01)，且HG+HGY 20 g/kg在降低FN、ColⅠ蛋白表達(dá)方面優(yōu)于HG+Fos 3 mg/kg(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表1　含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響值)

與NC組比較：1)P<0.01；與HG組比較：2)P<0.01；與HG+Fos 3 mg/kg：3)P<0.05

表2　含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的增殖抑制率

表3　含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞周期的影響

與NG組比較：1)P<0.01；與HG組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

表4　含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞Col1、FN蛋白表達(dá)的影響

與NG組比較：1)P<0.01;與HG組比較：2)P<0.01；與HG+Fos 3 mg/kg組比較：3)P<0.01

3討論

包括DN在內(nèi)的各種慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期腎病(ESRD)的共同病理特點(diǎn)是腎間質(zhì)纖維化〔5〕。所以，研究腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，可以為臨床延緩慢性腎功能損害、減輕腎臟病理學(xué)改變、防治DN提供新思路和新方法。

腎小管上皮細(xì)胞是在生理狀況下就可以發(fā)生增殖、再生的腎臟固有細(xì)胞，其受損后，腎小管重吸收與調(diào)節(jié)功能、濃縮功能都會(huì)受到影響，在腎間質(zhì)的纖維化的進(jìn)程中，發(fā)揮了舉足輕重的作用〔6〕。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)達(dá)到共識(shí)：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類藥物能夠減少尿蛋白，并且延緩腎病進(jìn)展，表現(xiàn)出明顯的腎保護(hù)作用，因而ACEI類藥物福辛普利作為腎保護(hù)藥物在臨床治療中廣泛應(yīng)用〔7〕。本課題組在早期研究中也發(fā)現(xiàn)：HGY能夠減少尿蛋白，延緩DN的病理變化，其與ACEI類藥物在治療DN的藥理作用方面相似，因而選用福辛普利作為本研究中的陽(yáng)性對(duì)照藥。

本研究表明：高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E的增殖，在給予HGY含藥血清干預(yù)后，高糖環(huán)境下的NRK-52E細(xì)胞增殖活力降低。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)：HGY含藥血清主要是可以使高濃度葡萄糖誘導(dǎo)條件下的NRK-52E發(fā)生G1/S期阻滯，從而調(diào)控細(xì)胞周期。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積是DN進(jìn)程中出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化的主要原因〔8〕，而ColⅠ和FN正是ECM的主要組成成分〔9〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究含藥血清對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中ColⅠ及FN蛋白的調(diào)控情況，分析HGY含藥血清對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)堆積的影響，進(jìn)而幫助判斷是否能夠延緩DN腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。

HGY含藥血清能夠明顯降低高糖誘導(dǎo)條件下NRK-52E中FN和ColⅠ蛋白量，且調(diào)節(jié)作用較福辛普利鈉含藥血清顯著，這可能因?yàn)槠湓诟咛黔h(huán)境下抑制NRK-52E細(xì)胞增殖〔10〕，使細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯，ECM堆積狀況減輕，從而使DN腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程得到延緩的主要原因之一。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-11-19修回〕

(編輯李相軍)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81360566，81573695)

通訊作者：南一(1978-)，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2834-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.003

Effects of HuihuiGansong Yin on proliferation of rat tubular epithelial cells and relevant mechanism

MA Li-Jie,YUAN Ling,NAN Yi.

Traditional Chinese Medicine School,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,Ningxia,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of HuihuiGansong Yin(HGY)on the proliferation of rat tubular epithelial cells and its mechanisms．MethodsNRK-52E cell lines were divided into 5% blank serum,5%high-glucose+blank serum,5% high-glucose+Fosinopril sodium drug-containing serum group(3 mg/kg),high-glucose+5%HGY drug-containing serum groups(20,10,5 g/kg).After drug treatment for 24,48,72 h,CCK-8 method was used to detect NRK-52E proliferation;flow cytometry was used to detect the cell cycle changes,ELISA was used to test the expressions of FN and ColⅠ proteins.ResultsCompared with 5% blank serum group,high-glucose(30 mmol/L)induced NRK-52E proliferation(P<0.01),and reduced the G0/G1 phase cell proportion(P<0.01),increased S phase proportion(P<0.01),made the FN and ColⅠ expressions increasing significantly(P<0.01).At the drug-containing serum intervention 24,48,72 h,the G1/S phase retardation,and FN and ColⅠ protein expressions were reduced under the condition of high-glucose(P<0.01 or P<0.05).ConclusionsHGY drug-containing serum under the high-glucose could make NRK-52E cells in G1/S phase retardation,inhibit the proliferation and its mechanism might be related to regulating FN,ColⅠ protein expressions.

【Key words】HuihuiGansong Yin;Tubular epithelial cells;FN;ColⅠ

1寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

2寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：馬麗杰(1989-)，女，在讀碩士，主要從事回族醫(yī)學(xué)專業(yè)研究。