乳制品生產(chǎn)過程中耐熱菌分離鑒定與抑菌效果評價

王林林，何光華，儲小軍，李海龍，郝東海，林學(xué)海，劉福生

（1.貝因美嬰童食品股份有限公司，杭州310007；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州310023）

乳制品生產(chǎn)過程中耐熱菌分離鑒定與抑菌效果評價

王林林1，何光華1，儲小軍1，李海龍1，郝東海1，林學(xué)海2，劉福生1

（1.貝因美嬰童食品股份有限公司，杭州310007；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州310023）

通過對乳制品生產(chǎn)過程中微生物易污染點進(jìn)行耐熱菌菌株分離鑒定；同時利用低聚果糖、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌作為抑菌物質(zhì)對耐熱菌進(jìn)行抑菌作用效果觀察。結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌等耐熱芽孢菌為奶制品生產(chǎn)中優(yōu)勢污染菌；原料為耐熱菌重要污染來源之一。抑菌物質(zhì)對耐熱菌生長有一定的抑制效果，組合添加抑菌物質(zhì)抑菌效果更佳；對于不同的耐熱菌，有針對性選擇抑菌物質(zhì)能起到較好的抑菌效果。

乳制品；耐熱菌；抑菌作用；芽孢菌

0 引言

乳制品生產(chǎn)過程中有些細(xì)菌能耐受傳統(tǒng)的巴氏殺菌（72℃/15 s），甚至超高溫殺菌（UHT，140～145℃/2～5 s）而存活下來，這些對熱處理有耐受性質(zhì)的細(xì)菌統(tǒng)稱為耐熱菌（thermoduric bacteria，TB）。耐熱菌是指經(jīng)常規(guī)工藝殺菌不能被殺死的一類微生物［1］，主要包括芽孢菌（Spore-forming bacillus），因其能形成耐熱性芽孢，故殺菌處理后仍能殘存在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中或產(chǎn)品中。造成乳制品污染［2］。

已有研究表明利用益生菌、益生元對食品致病菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉等生長具有抑制效果［3-4］，但尚未有關(guān)于益生菌、益生元對耐熱菌抑制作用相關(guān)報道。本文以乳制品生產(chǎn)過程中分離得到的耐熱菌為抑制指示菌，選取低聚果糖、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌對其進(jìn)行抑菌效果評價，為耐熱菌控制提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 菌種分離與鑒定

根據(jù)奶制品生產(chǎn)流程，對可能存在的微生物污染點進(jìn)行樣品或涂抹取樣，將得到的取樣樣品使用平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基參照GB4789.2的培養(yǎng)菌落總數(shù)方法進(jìn)行培養(yǎng)［5］，再從PCA平板中分離得到芽孢形成菌。菌落通過染色鏡檢初步確定，隨后被分離活化。分離的菌株經(jīng)過16S rDNA全序列檢測以鑒定其所屬及種，再進(jìn)行相關(guān)實驗。

1.2 抑菌實驗

1.2.1 材料

選取上述分離鑒定出的耐熱菌作為指示菌，增殖并篩選菌液濃度均為105mL-1；益生元：低聚果糖（fructo oligosaccharide，F(xiàn)OS，添加濃度為10%），量子高科（中國）生物股份有限公司；益生菌：嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，添加濃度107mL-1）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，添加濃度108mL-1）均為實驗室分離保藏菌株。

1.2.2 實驗設(shè)計

配置培養(yǎng)基，溶解均勻，121℃滅菌15 min，取15 mL培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內(nèi)，冷卻凝固；吸取調(diào)整濃度為105mL-1指示菌菌懸液1～5 mL與100 mL冷卻至45℃的培養(yǎng)基混勻，然后每一平皿分別加入5 mL混合液，均勻攤布在底層具有培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，此時平板立刻進(jìn)行抑菌試驗。在水平放置的平皿中用鑷子均勻地放置3只無菌牛津杯。吸取一定濃度的抑菌物質(zhì)溶液或混合液200 μL于牛津杯中，42℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑［6］。實驗組分為：（a）.以保加利亞乳桿菌為抑菌物質(zhì)單獨添加；（b）.以嗜酸乳桿菌為抑菌物質(zhì)單獨添加；（c）.以FOS為抑菌物質(zhì)單獨添加；（d）.以保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌為抑菌物質(zhì)混合添加；（e）.以保加利亞乳桿菌、FOS為抑菌物質(zhì)混合添加；（f）.以嗜酸乳桿菌、FOS為抑菌物質(zhì)混合添加；（g）.以保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、FOS為抑菌物質(zhì)混合添加。

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件的ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SE）表示。

表1 不同樣品來源菌株的分離鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離鑒定

表1為不同樣品來源菌株的分離鑒定結(jié)果。由表1可以看出，在奶制品生產(chǎn)過程中分離得到較多的耐熱菌菌株包括地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌等一些乳制品生產(chǎn)中常見的芽孢菌［7］。

從來源上看，在生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)中均有芽孢菌的出現(xiàn)，可見在生產(chǎn)中芽孢菌能經(jīng)受傳統(tǒng)殺菌熱處理而存活下來。其中從DSI設(shè)備中可分離得到地衣芽孢桿菌與張勇等［8］研究結(jié)果類似，該研究對5種不同品牌的UHT殺菌牛乳中殘留的細(xì)菌進(jìn)行了分離，得到18株細(xì)菌，并對它們進(jìn)行了耐熱性和細(xì)菌學(xué)鑒定試驗，結(jié)果表明18株細(xì)菌全部耐熱。

此外，從微生物分布情況來看，原料中分離出來的菌株種類較多，且隨著生產(chǎn)過程進(jìn)行，在奶制品生產(chǎn)的其他階段，如混料、均質(zhì)等，也出現(xiàn)相同菌種。以地衣芽孢桿菌為例，在原料中分離得到后，隨著生產(chǎn)進(jìn)行，在混料階段、均質(zhì)階段、濃奶、DSI設(shè)備、成品中均可分離得到，這個現(xiàn)象表明這些芽孢菌可能存在一定關(guān)聯(lián)性，可能是某一來源的污染菌隨著生產(chǎn)進(jìn)行最終污染產(chǎn)品。原因可能是乳制品生產(chǎn)中，有些耐熱菌并沒有經(jīng)過熱處理被殺死，而是隨著生產(chǎn)流程進(jìn)入管道。由于管道中乳制品營養(yǎng)較豐富，這些耐熱菌會在生產(chǎn)管道中形成生物膜［9］，生物膜上附聚的耐熱菌會隨著生產(chǎn)流程進(jìn)入下一階段生產(chǎn)工段或半成品中。生物膜是微生物附著于生物或非生物表面，分泌黏性胞外基質(zhì)（Extracellular Polymeric Substances，EPS）將其自身包裹其中，為適應(yīng)環(huán)境而形成的高度組織化、自由化微菌落膜性聚集物。一般而言，微生物附著于物體表面后，逐漸形成菌群，隨后依附環(huán)境條件形成生物膜，到一定階段后將會有微生物從成熟的生物膜中釋放出，對乳制品生產(chǎn)有不利影響［10］。

乳制品加工過程中耐熱菌來源復(fù)雜，原料、周圍環(huán)境、操作員工都有可能帶入微生物造成污染，上述實驗結(jié)果表明原料是耐熱菌污染的重要源頭之一，生產(chǎn)過程中其他來源的耐熱菌同樣存在隨著生產(chǎn)流程最終流入成品的可能，因此找出污染源頭對控制耐熱菌污染有重要的參考意義?？梢岳妹}沖場凝膠電泳進(jìn)行溯源分析［11］，明確污染源存在哪些地方進(jìn)而采取控制措施，降低成品被耐熱菌污染的程度。

2.2 抑菌結(jié)果與分析

2.2.1 抑菌實驗結(jié)果

圖1為實驗結(jié)果。由圖1可以看出，添加低聚果糖、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌作為抑菌物質(zhì)對耐熱菌均有抑制效果，其中抑菌物質(zhì)組合添加比抑菌物質(zhì)單獨添加抑菌效果更好。

圖1 抑菌物質(zhì)對耐熱菌抑制效果

2.2.2 以添加抑菌物質(zhì)對每種耐熱菌抑菌效果評價

（a）保加利亞乳桿菌抑菌效果如表2所示。

表2 添加保加利亞乳桿菌對5種耐熱菌抑菌效果

從表2可以看出，保加利亞乳桿菌對5種耐熱菌抑制效果從強(qiáng)到弱分別為蠟樣芽胞桿菌＞枯草芽孢桿菌＞短小芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞A.flavithermus。

（b）嗜酸乳桿菌抑菌效果如表3所示。

表3 添加嗜酸乳桿菌對5種耐熱菌抑菌效果

由表3可以看出，嗜酸乳桿菌對5種耐熱菌抑制效果從強(qiáng)到弱分別為蠟樣芽胞桿菌＞枯草芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞短小芽孢桿菌＞A.flavithermus。

（c）FOS抑菌效果如表4所示。

表4 添加FOS對5種耐熱菌抑菌效果

由表4可以看出，F(xiàn)OS對5種耐熱菌抑制效果從強(qiáng)到弱分別為短小芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞A.flavithermus＞枯草芽孢桿菌＞蠟樣芽胞桿菌。

（d）保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌抑菌效果如表5所示。

表5 添加保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌對5種耐熱菌抑菌效果

由表5可以看出，保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌混合添加對5種耐熱菌抑制效果從強(qiáng)到弱分別為蠟樣芽胞桿菌＞枯草芽孢桿菌＞A.flavithermus＞短小芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌。

（e）FOS+保加利亞乳桿菌抑菌效果如表6所示。

表6 添加FOS+保加利亞乳桿菌對5種耐熱菌抑菌效果

由表6中可以看出，F(xiàn)OS+保加利亞乳桿菌混合添加對5種耐熱菌抑制效果從強(qiáng)到弱分別為短小芽孢桿菌＞蠟樣芽胞桿菌＞地衣芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞A.flavithermus。

（f）FOS+嗜酸乳桿菌抑菌效果如表7所示。

表7 添加FOS+嗜酸乳桿菌對5種耐熱菌抑菌效果

由表7中可以看出，F(xiàn)OS+嗜酸乳桿菌混合添加對5種耐熱菌抑制效果從強(qiáng)到弱分別為短小芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞A.flavithermus＞地衣芽孢桿菌＞蠟樣芽胞桿菌。

（g）FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌抑菌效果如表8所示。

表8 添加FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌對5種耐熱菌抑菌效果

由表8中可以看出，F(xiàn)OS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌混合添加對5種菌抑制效果從強(qiáng)到弱分別為短小芽孢桿菌＞蠟樣芽胞桿菌＞地衣芽孢桿菌＞A.flavithermus＞枯草芽孢桿菌。

添加的抑菌物質(zhì)對5種耐熱菌具有一定的抑菌效果，且添加方式不同對5種耐熱菌抑制效果各有不同。

2.2.3 以抑菌物質(zhì)對單獨菌株抑菌效果評價

（a）抑制短小芽孢桿菌生長效果如表9所示。

表9 添加不同抑菌物質(zhì)對短小芽孢桿菌抑菌效果

由表9中可以看出，對短小芽孢桿菌抑菌效果而言，單獨添加保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及FOS效果相比差異顯著（P＜0.05），且添加FOS在3種單獨添加物質(zhì)相比效果最好；單獨添加FOS與添加FOS+保加利亞乳桿菌效果相比差異顯著（P＜0.05），但與添加FOS+嗜酸乳桿菌相比差異不顯著（P＞0.05），因此在添加FOS基礎(chǔ)上再添加保加利亞乳桿菌作為抑菌物質(zhì)具有明顯的促進(jìn)抑制短小芽孢桿菌生長效果。

（b）抑制枯草芽孢桿菌生長效果如表10所示。

表10 添加不同抑菌物質(zhì)對枯草芽孢桿菌抑菌效果

由表10可以看出，對枯草芽孢桿菌抑菌效果而言，單獨添加保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及FOS抑菌效果差異顯著（P＜0.05）。FOS、FOS+嗜酸乳桿菌及FOS+保加利亞乳桿菌添加方式抑菌效果差異極顯著（P＜0.01），但是FOS+保加利亞乳桿菌與FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌添加方式差異極不顯著（P＞0.01），因此在FOS+保加利亞乳桿菌基礎(chǔ)上添加嗜酸乳桿菌抑菌效果不明顯。保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌、FOS+保加利亞乳桿菌以及FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌添加方式抑菌效果差異不顯著（P＞0.05），因此保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌、FOS+保加利亞乳桿菌兩種添加方法能較好的滿足抑制枯草芽孢桿菌生長。

（c）抑制地衣芽孢桿菌生長效果如表11所示。

由表11可以看出，對枯草芽孢桿菌抑菌效果而言，單獨添加保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、FOS以及保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌混合添加的抑菌效果差異不顯著（P＞0.05）；且添加FOS+保加利亞乳桿菌與添加FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌效果相比差異不顯著（P＞0.05），但是添加FOS抑菌效果與該兩組相比都差異顯著（P＜0.05），可以看出在添加FOS基礎(chǔ)上再添加保加利亞乳桿菌作為抑菌物質(zhì)具有明顯的促進(jìn)抑制地衣芽孢桿菌生長效果。該實驗結(jié)果與短小芽孢桿菌抑菌效果類似。

（d）抑制蠟樣芽孢桿菌生長效果如表12所示。

表11 添加不同抑菌物質(zhì)對地衣芽孢桿菌抑菌效果

表12 添加不同抑菌物質(zhì)對蠟樣芽孢桿菌抑菌效果

由表12可以看出，對蠟樣芽孢桿菌抑菌效果而言，F(xiàn)OS在三種單獨添加物質(zhì)里面抑菌效果相比差異顯著（P＜0.05），且較差。對于FOS、FOS+保加利亞乳桿菌與FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌抑菌效果差異顯著（P＜0.05），因此對于蠟樣芽胞桿菌而言，三種物質(zhì)同時添加抑菌效果最佳。

（e）抑制A.flavithermus生長效果如表13所示。

表13 添加不同抑菌物質(zhì)對A.flavithermus抑菌效果

由表13可以看出，對A.flavithermus抑菌效果而言，F(xiàn)OS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌與其他組抑菌效果相比差異極限著（P＜0.01），因此對于A.flavithermus而言，同時添加三種抑菌物質(zhì)效果較佳。這與抑制蠟樣芽胞桿菌生長添加抑菌物質(zhì)方式類似。

3 討論

3.1 菌種分離鑒定

耐熱菌的危害很早就受到人們的重視，在乳制品生產(chǎn)中不同的溫濕度條件、乳制品不同的生產(chǎn)工藝和乳制品生產(chǎn)中不同來源的原料都會影響到產(chǎn)品中耐熱菌的種類和數(shù)量。從分離的菌株種類來看，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌等一些耐熱芽孢菌為生產(chǎn)中占比例較大的污染菌［12］。因此可針對這類芽孢菌在生產(chǎn)中進(jìn)行專門的工藝控制處理，如二次加熱方法［13］等降低該類芽孢菌的數(shù)量，最終減少產(chǎn)品污染，提高產(chǎn)品品質(zhì)；同時研究對乳制品生產(chǎn)過程中影響較大的生物膜來減少耐熱菌對整個生產(chǎn)流程污染。從菌株分離來源上看，原料中耐熱菌微生物種類較多，是重要的耐熱菌污染源頭之一，建議在實際生產(chǎn)中嚴(yán)格執(zhí)行原料驗收標(biāo)準(zhǔn)，降低生產(chǎn)中由原料造成的微生物污染［14］。

3.2 抑菌實驗

添加的FOS、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌對分離鑒定出來的5種耐熱菌具有抑菌效果，抑菌物質(zhì)組合添加抑菌效果較好。根據(jù)每種耐熱菌對抑菌物質(zhì)添加方式敏感程度不同，較優(yōu)的抑菌物質(zhì)添加方式如下：（1）對抑制短小芽孢桿菌生長而言，添加FOS基礎(chǔ)上再添加保加利亞乳桿菌作為抑菌物質(zhì)具有明顯的促進(jìn)抑制短小芽孢桿菌生長效果；（2）保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌、FOS+保加利亞乳桿菌兩種添加方法都能較好的滿足抑制枯草芽孢桿菌生長效果；（3）在添加FOS基礎(chǔ)上再添加保加利亞乳桿菌具有明顯的促進(jìn)抑制地衣芽孢桿菌生長效果；（4）FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌組合添加對抑制蠟樣芽孢桿菌生長效果較佳；（5）FOS+保加利亞乳桿菌+嗜酸乳桿菌組合添加對抑制蠟樣芽孢桿菌生長效果較佳。

4 結(jié)論

（1）分離的菌株種類來看，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌等一些耐熱芽孢菌為奶制品生產(chǎn)中優(yōu)勢菌；原料為耐熱菌重要污染來源之一。

（2）抑菌物質(zhì)對耐熱菌有一定的抑制效果，抑菌物質(zhì)組合添加抑菌效果更佳；對于不同的耐熱菌，有針對性選擇抑菌物質(zhì)能起到較好的抑菌效果。

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Isolation and identification of thermoduric bacteria in the production of dairy products and evaluate antimicrobial effect

WANG Lin-lin1，HE Guang-hua1，CHU Xiao-jun1，LI Hai-long1，HAO Dong-hai1，LIN Xue-hai2，LIU Fu-sheng1
（1.Beingmate Baby&Child Food Co.，Ltd，Hangzhou，311106，China 2.School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm produces，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China；）

Thermoduric bacteria from pollution sites which convenient contaminated by microorganism are isolated and identified during dairy production；as antibacterial substances，oligofructose、Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus bulgaricus are applied to evaluated bacteriostatic effect on thermoduric bacteria.Results show that thermoduric bacillus such as Bacillus licheniformis，Bacillus subtilis，Bacillus cereus are dominant bacteria on dairy production；raw material is one of the main pollution of thermoduric bacteria.The antibacterial material has certain inhibitory effect on the growth of thermoduric bacteria，and the bacteriostatic effect with combination of antibacterial is much better；desirable antibacterial effect on different thermoduric bacteria can be achieved via the addition of antibacterial substances in different ways.

dairy products；thermoduric bacteria；bacteriostatic effect；bacillus

Q93-331

A

1001-2230（2016）08-0012-05

2016-04-25

杭州市科技項目（20140533B74）。

王林林（1988-），男，助理研發(fā)工程師，從事乳品微生物控制方面研究。

何光華