嬰兒配方乳粉原輔料中細(xì)菌的分離鑒定

婁彬彬，郭 鸰，周彥宏，馮 婧，孫露宏，李明雨，牛婕婷，費 鵬，滿朝新，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室；b.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150030）

嬰兒配方乳粉原輔料中細(xì)菌的分離鑒定

婁彬彬a，郭 鸰a，周彥宏a，馮 婧a，孫露宏a，李明雨a，牛婕婷a，費 鵬a，滿朝新b，姜毓君ab

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室；b.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150030）

利用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法對采集自嬰兒配方乳粉加工廠的14類、42份原輔料樣品進(jìn)行細(xì)菌的分離，并采用16S rDNA基因測序技術(shù)對分離的細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明：乳糖、氯化鉀、維生素、低聚果糖、棕櫚油和乳鐵蛋白共6類原輔料中沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，其他8類原輔料中共分離出36株細(xì)菌，包含了6個屬10個種。原料乳和乳清粉是主要的細(xì)菌分離來源，共分離到11株和8株細(xì)菌，分別占總分離菌株的30.6%和22.2%。肺炎克雷伯菌和格氏乳球菌是優(yōu)勢菌株，共占總分離菌株的52.7%。

嬰兒配方乳粉；原輔料；細(xì)菌；分離鑒定；16S rDNA分析

0 引言

作為母乳的有效替代物，嬰兒配方乳粉為嬰兒提供了生長發(fā)育所必需的幾乎全部的營養(yǎng)［1，2］。我國的奶粉市場中，嬰幼兒配方乳粉占有重要的比例且具有逐年上升的趨勢，對嬰幼兒配方乳粉的需求量也在逐漸增加［3］。然而，嬰兒配方乳粉并不是一個無菌的產(chǎn)品，存在于嬰兒配方乳粉中的細(xì)菌可能導(dǎo)致嬰兒致?。?-6］。為此國家制定了嬰幼兒配方奶粉以及相關(guān)原輔料的國家標(biāo)準(zhǔn)［7，8］。研究人員針對嬰兒配方乳粉中的微生物檢測及遺傳多樣性研究甚多，但對于原輔料中細(xì)菌的研究相對較少［9，10］。因此本文對嬰兒配方乳粉生產(chǎn)所需的原輔料中細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，為原輔料的驗收及管理提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

樣品采集：研究中所用的14類、42份嬰兒配方乳粉原輔料樣品，由本實驗室人員于某嬰兒配方乳粉加工廠中采集。樣品采集后立即4℃保存，進(jìn)行后續(xù)實驗。

培養(yǎng)基及主要試劑：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基，緩沖蛋白胨水（BPW），2×Taq PCR MasterMix，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

主要儀器與設(shè)備：低溫采樣箱，Bcn1360型生物超凈工作臺，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫水浴鍋，高壓蒸汽滅菌鍋，TGC-16G型離心機，9700 PCR擴增儀，DYY-10C型電泳儀，UVP凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

本實驗連續(xù)三天采集同一批次嬰兒配方乳粉的原輔料14類，共42份，包括：原料乳、α-乳白蛋白、乳清粉、酪蛋白磷酸肽、碳酸鈣、營養(yǎng)素、乳糖、氯化鉀、維生素、核苷酸、礦物質(zhì)、低聚果糖、乳鐵蛋白以及棕櫚油。針對粉狀樣品，每類原輔料無菌采集約200 g；針對液體樣品，每類原輔料無菌采集約200 mL。收集到的原輔料立即放在低溫采樣箱中保存，并送回實驗室進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 樣品中細(xì)菌的分離

分別稱取25 g樣品于滅菌后的225 mL BPW三角瓶中，充分混合溶解，進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尯螅?.1 mL涂布于TSA固體培養(yǎng)基，每個樣品3個平行，后放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，選取形態(tài)不同的單一菌落于LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h。針對非單一菌落需在TSA固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落，置于液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，連續(xù)傳代2次后進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取與PCR擴增

1.3.1.細(xì)菌基因組DNA的提取

取2 mL菌液，按照TIANamp細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒要求的具體方法對分離菌株進(jìn)行DNA的提取。

1.3.2.16S rDNA序列的PCR擴增

利用16S rDNA通用引物27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，進(jìn)行序列的擴增［11］。PCR擴增體系為：16 μL 2×Taq PCR MasterMix，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，30 μL ddH2O。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72℃末端延伸7 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳條帶情況。

1.4 細(xì)菌16S rDNA序列的測序分析

將片段大小在1 500 bp左右的PCR擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司進(jìn)行純化和雙向測序。利用DNAMAN 5.29軟件對雙向測序的結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接后的序列與NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對，進(jìn)而完成對分離菌株的鑒定工作。并利用MEGA6.0對收集到的最優(yōu)勢菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 原輔料中菌落數(shù)量

收集的14類，共42份嬰兒配方乳粉原輔料，經(jīng)前期適當(dāng)稀釋、培養(yǎng)，挑取固體培養(yǎng)基TSA上菌落形態(tài)不同的單一菌落后，進(jìn)一步分離、純化處理，共分離出36株，其中原料乳中11株、乳清粉中8株、礦物質(zhì)中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白磷酸肽2株、碳酸鈣中3株、營養(yǎng)素中3株和核苷酸中2株。

2.2 原輔料中細(xì)菌的分子鑒定

2.2.1 細(xì)菌DNA提取

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對分離的36株細(xì)菌進(jìn)行DNA提取，并在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，結(jié)果如圖1所示。提取的分離菌株DNA只有一條清晰的條帶，沒有其他雜帶干擾，說明DNA的提取結(jié)果符合要求，可以用于后續(xù)的擴增實驗。

圖1 部分分離菌株的DNA提取電泳結(jié)果

2.2.2 PCR擴增

利用通用引物對分離菌株進(jìn)行PCR擴增，圖2為部分分離菌株的PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上的檢測結(jié)果。通過與標(biāo)準(zhǔn)條帶比較，可以看到分離菌株的PCR產(chǎn)物條帶大約為1 500 bp左右，且均為單一清晰條帶，沒有引物二聚體存在，說明分離菌株的16S rRNA基因擴增比較成功，可以用于后續(xù)基因測序。

圖2 部分分離菌株的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2.3 16S rDNA序列的鑒定

分離得到的36株細(xì)菌的16S rDNA序列經(jīng)DNAMAN 5.29軟件剪切和拼接后，與BLAST數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對。關(guān)于分離菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果及分離來源等信息如表1所示。結(jié)果表明14類，42份嬰兒配方乳粉原輔料樣品中共分離出36株細(xì)菌，包含了克雷伯氏菌屬（Klebsiella）14株、乳球菌屬（Lactococcus）11株、腸球菌屬（Enterococcus）7株、芽孢桿菌屬（Bacillus）2株、耶爾森氏菌屬（Yersinia）1株、不動桿菌屬（Acinetobacter）1株，共6個菌屬。包含了9個種，分別是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、變棲克雷伯菌（Klebsiella variicola）、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）和申氏不動桿菌（Acinetobacter schindleri）。

2.3 原輔料中細(xì)菌的分布及組成

作為嬰兒配方乳粉生產(chǎn)的主要原料，原料乳和乳清粉中發(fā)現(xiàn)較多的細(xì)菌。原料乳中共分離出了11株6種細(xì)菌，分別是肺炎克雷伯菌（3株）、格氏乳球菌（3株）、變棲克雷伯氏菌（2株）、乳酸乳球菌（1株）、糞腸球菌（1株）和枯草芽孢桿菌（1株）；乳清粉中發(fā)現(xiàn)了8株細(xì)菌，包括肺炎克雷伯氏菌（3株）、變棲克雷伯氏菌（1株）、格氏乳球菌（2株）、糞腸球菌（1株）和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（1株）。部分輔料（礦物質(zhì)、酪蛋白磷酸肽、碳酸鈣和營養(yǎng)素）中發(fā)現(xiàn)相對較少的細(xì)菌。其他輔料（乳糖、氯化鉀、維生素、低聚果糖、棕櫚油和乳鐵蛋白）中沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。一方面說明生產(chǎn)嬰幼兒配方乳粉所使用的某些原輔料存在一定數(shù)量的細(xì)菌。另一方面表明嬰兒配方乳粉中分離到的細(xì)菌也可能來自于輔料。此外，由于原料乳以及乳清粉中含有較多的細(xì)菌，因此在原料乳、乳清粉的驗收、存貯等過程中要更加重視微生物數(shù)量的控制，防止微生物的繁殖，同時對嬰兒配方乳粉生產(chǎn)所用的原輔料應(yīng)該實施更加嚴(yán)格的監(jiān)管措施，從進(jìn)廠到添加要有詳細(xì)的記錄信息。

魏琳琳，胡萍［12］等人指出，肺炎克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌，可能引起多種感染。在嬰兒配方乳粉中分離出的肺炎克雷伯菌等腸桿菌可能引起嬰幼兒感染，嚴(yán)重者可造成后遺癥和死亡［13-15］。本實驗中并未對半成品、成品干粉進(jìn)行研究，僅在原輔料中發(fā)現(xiàn)了肺炎克雷伯菌，后續(xù)可能對干粉進(jìn)行分析，來探究嬰兒配方乳粉中是否存在肺炎克雷伯菌以及該菌是否來源于原輔料。

2.4 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

肺炎克雷伯菌作為主要的分離菌株，在多種原輔料中均被發(fā)現(xiàn)，為探究菌株的基因差異是否與樣品有關(guān)，將獲得的11株肺炎克雷伯菌以及3株參考菌株的16S rRNA基因序列利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，表明所有分離菌株分為了4個類群，A26、A25、A22、A1、A5、A4和A6，共7株菌形成一個系統(tǒng)發(fā)育分支；A28與參考菌株KJ741255聚為一個類群，A16與A17兩株菌形成一個系統(tǒng)發(fā)育分支；而A18獨自一類群，且與其他菌株相距較遠(yuǎn)。

通過對分離菌株的來源進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的7株菌（A26、A25、A22、A1、A5、A4和A6）大多數(shù)分離自原料乳和乳清粉，其中A26、A25和A22均分離自原料乳且形成一個系統(tǒng)發(fā)育分支；A1與A5分離自乳清粉中；A4也分離自乳清粉，盡管與A1和A5在一個大分支下，卻與分離自礦物質(zhì)中的肺炎克雷伯菌A6在同一小分支上。分離自營養(yǎng)素的菌株A17與A16聚集在一起，而與其他分離來源的菌株存在距離。此外，分別分離自酪蛋白磷酸肽以及碳酸鈣的A28和A18形成獨立分支。圖3為原輔料中分離株的肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 分離的36株細(xì)菌菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果

圖3 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株的分離來源：A26-原料乳，A25-原料乳乳，A22-原料乳，A5-乳清粉，A1-乳清粉，A4-乳清粉，A6-礦物質(zhì)，A16-營養(yǎng)素，A17-營養(yǎng)素，A28-酪蛋白磷酸肽，A18-碳酸鈣。

3 結(jié)論

本研究對14類，共42份嬰兒配方乳粉原輔料進(jìn)行的細(xì)菌分離與鑒定，結(jié)果表明，6類原輔料中沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，分別是乳糖、氯化鉀、維生素、低聚果糖、棕櫚油和乳鐵蛋白。其他8類原輔料中共分離出36株細(xì)菌，包含了6個屬10個種。其中原料乳和乳清粉是主要的細(xì)菌分離來源，分離了11株和8株細(xì)菌，分別占總分離菌株的30.6%和22.2%。肺炎克雷伯菌和格氏乳球菌是優(yōu)勢菌株，共占總分離菌株的52.7%。本研究對加強嬰兒配方乳粉生產(chǎn)所需的原輔料的驗收及監(jiān)管提供依據(jù)。

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Isolation and identification of bacteria from raw materials of powdered infant formula

LOU Bin-bina，GUO Linga，ZHOU Yan-honga，F(xiàn)ENG Jinga，SUN Lu-honga，LI Ming-yua，NIU Jie-tinga，F(xiàn)EI Penga，MAN Chao-xinb，JIANG Yu-juna，b（Northeast Agricultural University a.Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，College of Food Science；B.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150030，China）

In this study，bacteria were isolated by traditional cultivation-based method from 14 categories，42 samples of raw materials collected from powdered infant formula factory，and then identified the bacterial isolates by 16S rDNA sequence analysis.The results showed that bacteria were not found from the 6 kinds of raw materials，including lactose，potassium chloride，vitamin，fructo oligosaccharide，palm oil and lactoferrin.A total of 36 isolates were isolated from the other 13 different raw materials，and all the isolates were classified into 6 genera and 10 species.Raw milk and whey powder were the main sources of isolated bacteria，and 11 and 8 bacteria were collected，accounting for 30.6%and 22.2%of the total isolates，respectively.Klebsiella pneumonia and Lactococcus garvieae were considered as the most prominent genera with a relative proportion of 52.7%of the total isolates.

powdered infant formula；raw materials；bacteria；jsolation and identification；16S rDNA analysis

TS252.51

A

1001-2230（2016）08-0009-03

2015-12-30

國家科技支撐計劃課題（2013BAD18B11）；黑龍江省杰出青年科學(xué)基金（JC201415）、黑龍江省科研機構(gòu)創(chuàng)新能力提升專項計劃項（YC13D005）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金（yjscx14060）。

婁彬彬（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。

姜毓君