心肌細胞傳感器優(yōu)化設(shè)計及其藥物分析

王　琴, 方佳如, 曹端喜, 周　潔, 蘇凱麒, 黎洪波, 王　平

(浙江大學(xué) 生物傳感器國家專業(yè)實驗室 生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027)

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心肌細胞傳感器優(yōu)化設(shè)計及其藥物分析

王琴, 方佳如, 曹端喜, 周潔, 蘇凱麒, 黎洪波, 王平

(浙江大學(xué) 生物傳感器國家專業(yè)實驗室 生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027)

摘要:為了構(gòu)建高度穩(wěn)定性和一致性的心肌細胞電位傳感器,從微電極陣列表面親水性和細胞培養(yǎng)密度兩方面對心肌細胞和微電極陣列(MEA)的耦合性進行研究.通過對MEA表面進行高分子蛋白明膠的修飾來提高MEA表面的親水性,并重點分析不同細胞密度下構(gòu)建的心肌細胞電位傳感器的胞外場電位信號(EFP)信號特征.研究結(jié)果表明：心肌細胞按優(yōu)化密度12 萬/cm2培養(yǎng)在經(jīng)明膠修飾的MEA表面上,可促使心肌細胞和MEA形成高度緊密的耦合.在此條件下構(gòu)建的心肌細胞傳感器,能穩(wěn)定輸出一致性良好的EFP信號,電位幅值可達到約1.2 mV,發(fā)放頻率可達到約180 次/min,信號穩(wěn)定期可維持3～4 d.通過選擇2種典型的工具藥物異丙腎上腺素和利多卡因?qū)?yōu)化后的心肌細胞電位傳感器進行分析性能的測試,實驗結(jié)果表明：20 μM的異丙腎上腺素和利多卡因分別大幅度增強和抑制了電位幅值和發(fā)放頻率,結(jié)果與文獻報導(dǎo)的結(jié)果相一致.該心肌細胞傳感器對2種測試藥物作出了快速而靈敏的響應(yīng),有望成為藥物檢測和分析的有效平臺.

關(guān)鍵詞：微電極陣列(MEA)；心肌細胞；親水性；細胞密度；細胞傳感器；胞外場電位信號

近年來,許多藥物因?qū)е滦穆墒СＶ率剐呐K驟然性停搏而從市場上撤回[1-4].這不僅給人類健康造成巨大的威脅,也給制藥工業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失.在生物技術(shù)和制藥工業(yè)領(lǐng)域中急需有效的藥物早期篩選測試方法,用以評價藥物引起的心臟毒性,以減少藥物誘發(fā)的心律失常和后期的藥物損耗[5-7].大多數(shù)藥物引起的心律失常表現(xiàn)為尖端扭轉(zhuǎn)室性心動過速(Tdp),其誘發(fā)機制為QT間期(即心電圖ECG中心室動作電位的時程)的延長[8-9].目前,用于QT間期分析的方法主要有在體檢測法和離體檢測法,其中離體檢測法因其成本低、檢測時間較短、藥物損耗少而越發(fā)受到研究者的關(guān)注[10-13].

在細胞水平上,傳統(tǒng)的QT間期檢測法為膜片鉗記錄法,雖然膜片鉗為金標(biāo)準(zhǔn)的檢測手段,但該方法存在操作繁瑣、通量低、無法檢測動作電位傳播等缺點[14].近年來,隨著微電子技術(shù)的發(fā)展,微電極陣列(microelectrodearray,MEA)記錄法已成為細胞電生理信號檢測的常用手段.該方法操作簡單,通量高,可以同時檢測幾十甚至上百個通道的電生理信號[15-17].更重要的是，MEA記錄法能長時無損地檢測細胞的放電活動,目前在心臟研究、突觸可塑性研究、高通量藥物篩選等研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[18-20].MEA不僅能分析心肌細胞的放電活動,更能實現(xiàn)不同藥物的心臟安全性評價[16].MEA制作簡單,易于檢測心肌細胞網(wǎng)絡(luò)的多種參數(shù),可以探測心肌細胞層的動作電位傳播[21-22].雖然MEA記錄法具有以上的諸多優(yōu)點,但相較于傳統(tǒng)的膜片鉗記錄法,MEA所檢測到的胞外場電位(extracellularfieldpotential,EFP)信號幅度偏低、信噪比不高,這和微電極與待測興奮性細胞耦合不夠緊密有關(guān).因此,提高細胞和MEA的耦合性是構(gòu)建高性能心肌細胞電位傳感器的關(guān)鍵.

本文旨在研究MEA表面親水性和細胞培養(yǎng)密度對細胞和MEA耦合的影響,同時分析不同細胞密度下構(gòu)建的心肌細胞電位傳感器的EFP信號特征,并對改善后的心肌細胞電位傳感器進行性能測試.

1材料與方法

1.1MEA芯片的設(shè)計與心肌細胞電位傳感器的構(gòu)建

鑒于以往實驗室自行設(shè)計的MEA芯片表面積

過小,培養(yǎng)在上面的細胞難以生長均勻,導(dǎo)致各個通道記錄到的信號幅度小且一致性差.本研究設(shè)計的MEA芯片表面積為2×2cm2,比以往增大了4倍.如圖1所示為MEA芯片設(shè)計圖,MEA呈6×6陣列排布,32個電極作為記錄電極,單個電極大小為30μm,電極間距為300μm.MEA的基本結(jié)構(gòu)包括絕緣基底、金屬層電極陣列以及鈍化層.MEA的制作采用標(biāo)準(zhǔn)的微電子加工技術(shù).首先,將一層30nm鈦層和一層300nm金層分別沉積到玻璃基底上,作為黏附層和電極層；接著,采用光刻技術(shù)刻蝕出電極位點和引線布局,除去光刻膠后沉積一層1μm的Si3N4作為鈍化層,并用KOH濕法刻蝕技術(shù)暴露出電極和焊盤；最后,用金線將芯片上的焊盤和PCB上的焊盤點焊連接.實驗前將電極表面電鍍鉑黑,減小電極阻抗而提高信噪比.如圖2所示為心肌細胞電位傳感器的工作原理圖.圖中,Uref代表參考電勢,Za代表前置放大器的輸入阻抗,Uout代表輸出電壓,SAM(self-assembledmonolayers)代表自組裝分子修飾層.心肌細胞培養(yǎng)在MEA芯片上,通過一層薄的電解液同芯片的電極相耦合.心肌細胞和MEA耦合在一起后,具有電生理特性的心肌細胞會產(chǎn)生動作電位,細胞膜上離子通道的選擇性開啟和閉合導(dǎo)致細胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化,因此,通過檢測細胞外和離子濃度相關(guān)的場電位變化,可有效地記錄細胞的電生理信號.

圖1　32 通道 MEA 芯片設(shè)計圖Fig.1　Design drawing of MEA pattern with 32 channels

圖2　心肌細胞電位傳感器工作原理圖Fig.2　Working principle of cardiomyocyte-based potential biosensor

1.2MEA芯片的封腔與清洗

剛加工完的MEA芯片,經(jīng)劃片、貼片、點焊后,及時置于真空泵中保存.封裝細胞培養(yǎng)腔之前,用硅膠(Dowcorning184)將兩排焊盤之間裸露的金線絕緣封閉,待硅膠固化后,緊接著用同種硅膠封裝培養(yǎng)腔.如圖2所示為封裝好的MEA芯片.本研究用的細胞培養(yǎng)腔是一次性塑料針管經(jīng)等距離電切割后的圓形腔體(孔的內(nèi)徑為1.8cm,高度為2.0cm).此種腔體對細胞無毒害作用,可高壓滅菌,且便于封裝.封腔后的MEA芯片先用普通的去污劑浸泡數(shù)分鐘,接著用醫(yī)用棉簽輕輕擦拭其表面,之后用大量清水沖洗,最后用雙蒸水涮洗數(shù)遍.將MEA芯片進行50 ℃烘干后即可置于超凈臺進行紫外滅菌.MEA芯片可重復(fù)使用,培養(yǎng)過細胞的芯片須先用含酶去污劑(1%Terg-A-Zyme)浸泡30～60min,剩余步驟同上.

1.3MEA芯片的表面修飾與保存

MEA芯片經(jīng)紫外滅菌30min后,為了增強其表面的親水性,用高分子蛋白對其進行表面修飾.實驗組用0.1%明膠(粉劑購自Sigma公司,貨號：G9391,用PBS緩沖液配制而成)包被MEA表面,置于溫度為4 ℃的冰箱過夜(修飾時間約16h).第二天棄去明膠,并用無菌水清洗2遍.對照組不做任何表面修飾.明膠修飾后的MEA芯片即可用于心肌細胞的培養(yǎng),暫時不用的芯片加滿無菌水,用封口膜封閉培養(yǎng)腔口,置于溫度為4 ℃的冰箱保存,以維持表面的親水性.

1.4原代心肌細胞的培養(yǎng)

選取清潔級健康新生SD大鼠(出生24h內(nèi)), 使用75%(體積分?jǐn)?shù))的酒精消毒,打開胸腔,取心臟心尖部,置于預(yù)冷的高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’smodifiedeaglemedium,DMEM)中,漂洗3次,去除心房和血管等組織.轉(zhuǎn)移心肌組織于平衡鹽溶液(Hanksbalancedsaltsolution,HBSS)中,剪成約1mm3的小塊,棄上清,加入消化液(含0.07% 胰蛋白酶和 0.05%II型膠原酶),置于培養(yǎng)箱8min,隔4min后輕輕晃動玻璃瓶.8min后棄上清,重復(fù)消化12次,直至心肌組織呈現(xiàn)疏松狀態(tài).向心肌組織加入5mL含10%的胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)的DMEM培養(yǎng)基,輕輕吹打組織,收集單細胞懸浮液.以800r/min的速度離心細胞懸浮液5min,重懸細胞,用70μm的細胞篩過濾,收集細胞懸液到培養(yǎng)瓶中進行差速貼壁2次,每次45min,以去除纖維細胞和其他細胞.差速貼壁后,進行活細胞計數(shù),并將細胞按不同細胞密度接種在MEA芯片上.之后,每隔1d用含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)的高糖培養(yǎng)基全量換液,培養(yǎng)2d后,開始檢測記錄心肌細胞的胞外場電位(Extracellularfieldpotential,EFP)信號.

1.5心肌細胞EFP信號的檢測

EFP信號的檢測與記錄采用MEA-1060(MultichannelSystems,Germany)檢測系統(tǒng).該系統(tǒng)能實時長時程記錄EFP信號,采樣率為10kHz.檢測時,系統(tǒng)置于屏蔽箱以防止外界電磁的干擾,噪聲水平維持在20μV左右.MEA上的心肌細胞培養(yǎng)2d后,開始進行EFP信號檢測,每隔12h檢測一次,每次檢測5min.待信號穩(wěn)定后,開始對心肌細胞進行藥物干預(yù).藥物干預(yù)前,首先記錄10min的自發(fā)放EFP信號,然后棄去培養(yǎng)液,分別加入不同物質(zhì)的量濃度的異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)和利多卡因(lidocaine,LID)工作液(用細胞培養(yǎng)液稀釋),實時檢測心肌細胞電位傳感器對這2種藥物的響應(yīng).

1.6數(shù)據(jù)處理

用MC_Rack軟件顯示和分析記錄到的EFP信號,觀察心肌細胞EFP信號的發(fā)放情況.采用Matlab對EFP信號進行特征參數(shù)峰電位幅值(spikeamplitude,SA)和發(fā)放頻率(firingrate,FR)的提取和分析.

2實驗結(jié)果

2.1MEA親水性對細胞和MEA耦合的影響

為了提高MEA表面的親水性,加強其表面和細胞的耦合程度,用高分子蛋白明膠對MEA表面進行修飾.明膠是一種常用的材料表面修飾蛋白,具有豐富的親水基團,能大幅度提高材料表面的親水性.實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)明膠修飾的MEA表面親水性很強,向其表面滴加一滴水,可見水滴迅速鋪展,形成一層水膜；而未經(jīng)明膠修飾的MEA表面親水性較差,向其表面滴加一滴水,水滴則難以鋪展開來.

心肌細胞按高細胞密度(18 萬/cm2)分別培養(yǎng)在未經(jīng)明膠修飾和經(jīng)明膠修飾的MEA上.如圖3為對照組和處理組的MEA上培養(yǎng)四天后的原代心肌細胞.很顯然,對照組MEA芯片表面對細胞的貼附性遠不如處理組的MEA.處理組MEA上的心肌細胞生長狀態(tài)良好,培養(yǎng)至第四天時已形成一片分布致密、狀態(tài)成熟、呈島嶼狀同步搏動的細胞層.對照組MEA上的心肌細胞分布稀疏,形態(tài)畸形,每一次換液后,都會有大量細胞從MEA表面脫落.以上實驗結(jié)果表明：經(jīng)高分子蛋白明膠修飾的MEA,其表面的親水性大幅度提高,從而促使細胞和MEA形成緊密的耦合.

圖3　明膠修飾對MEA和心肌細胞耦合的影響Fig.3　Effect on coupling of MEA and cardiomyocytes by gelatin modification

2.2細胞密度對細胞和MEA耦合的影響

合適的細胞密度是MEA和細胞耦合緊密的一個重要前提.為此,研究不同細胞密度下構(gòu)建的心肌細胞電位傳感器的EFP信號特征.

圖4　第5天不同細胞密度下心肌細胞電位傳感器記錄到的典型的單通道EFP信號(時程為10 s)Fig. 4　10 s of representative EFP signals on single channel recorded by cardiomyocyte-based potential biosensor under diffirent cell densities on 5th day

心肌細胞按不同細胞密度ρC(8～18 萬/cm2)接種在預(yù)先用明膠進行表面修飾的MEA芯片上,培養(yǎng)二天后開始檢測EFP信號,每隔12h檢測一次,每次檢測5min,持續(xù)檢測1周.如圖4所示為第五天不同細胞密度下記錄到的EFP信號.當(dāng)細胞密度為12 萬/cm2時,心肌細胞傳感器輸出的EFP信號一致性最好,峰電位幅值最大(>1mV)；而當(dāng)細胞密度過低,只有8 萬/cm2時,心肌細胞傳感器輸出的EFP信號峰電位幅值大幅度下降,不到200μV；當(dāng)細胞密度過大,達到18 萬/cm2時,心肌細胞傳感器輸出的EFP信號峰電位幅值也大幅度下降,不到300μV.

圖5　第五天不同細胞密度下心肌細胞電位傳感器記錄到的EFP信號 (Mean±SD, n=6)Fig.5　EFP signals recorded by the cardiomyocyte-based potential biosensor under diffirent cell densities on 5th day. (Mean±SD, n=6)

從原始EFP信號中提取2個典型的特征參數(shù)峰電位幅值和發(fā)放頻率進行統(tǒng)計分析(6個平行組，即n=6).如圖5(a)和(b)所示分別為不同細胞密度下EFP信號的SA和FR的統(tǒng)計結(jié)果,其中,SA(spikeamplitude)表示胞外場電位的峰電位幅值,FR(firingrate)表示胞外場電位發(fā)放頻率.結(jié)果表明：當(dāng)ρC為12萬/cm2時,心肌細胞傳感器輸出的EFP信號的SA最大,FR最高,且信號的重復(fù)性(SDSA<40μV, SDFR<10次/min)最好,其中,SD代表標(biāo)準(zhǔn)差.按細胞密度12 萬/cm2構(gòu)建的心肌細胞傳感器從第三天開始能檢測到微弱的EFP信號,之后信號幅度快速增強,直至第五天信號幅度達到最大,且維持3～4d的信號平臺期(SA: 1～1.2mV;FR: 160～180 次/min),該平臺期是進行藥物檢測的最佳時期.按細胞密度8 萬/cm2和10 萬/cm2構(gòu)建的心肌細胞傳感器到第五天才能檢測到微弱的EFP信號,之后信號幅度緩慢增強但始終小于400μV.按細胞密度為14、16和18萬/cm2構(gòu)建的心肌細胞傳感器從第三天開始能檢測到微弱的EFP信號,之后信號幅度快速增強,其中按細胞密度18 萬/cm2構(gòu)建的心肌細胞傳感器到第四天信號幅度達到最大,但僅維持不到1d的信號平臺期,隨后信號幅度便快速下降.按細胞密度為14萬/cm2和16萬/cm2構(gòu)建的心肌細胞傳感器均在第五天信號幅度達到最大,并維持1～2d的信號平臺期.

以上結(jié)果均表明：合適的細胞密度可促使MEA和心肌細胞形成高度緊密的耦合,從而使MEA所檢測到的EFP信號大幅度增強.按合適的細胞密度12 萬/cm2構(gòu)建的心肌細胞電位傳感器能長時間穩(wěn)定輸出高幅度的EFP信號.

2.3心肌細胞電位傳感器的性能測試

圖6　藥物作用5 min后心肌細胞電位傳感器記錄到的EFP信號 Fig.6　EFP signals recorded by cardiomyocyte-based potential biosensor under drugs treatment after 5 min.

為了測試我們構(gòu)建的心肌細胞電位傳感器是否適用于藥物的檢測和分析,選取2種典型的工具藥物異丙腎上腺素(ISO)和利多卡因(LID)對其進行了性能測試,分析該傳感器對不同濃度下ISO和LID的響應(yīng)特征.ISO是一種β受體激動劑,許多文獻報導(dǎo)ISO會加快心肌細胞的搏動頻率和增強心肌細胞的搏動幅度[24-25].如圖6(a)所示為不同濃度LID作用前后心肌細胞電位傳感器記錄到的EFP信號.20μM的異丙腎上腺素(ISO)大幅度增強了心肌細胞的放電活動.如圖7(a)和(b)所示分別為ISO作用5min后EFP信號參數(shù)SA和FR的變化特征圖.10μMISO組的EFP信號的峰電位幅值與對照組相比有提高(p<0.05),20μMISO組的EFP信號的峰電位幅值與10μMISO組相比有顯著性提高(p<0.01).如圖7(b)所示,10μMISO組的EFP信號的發(fā)放頻率與對照組相比沒有差異(p>0.05),而20μMISO組的EFP信號的發(fā)放頻率與對照組相比有顯著性提高(p<0.01).以上結(jié)果表明：ISO會增強心肌細胞的放電活動,而且這種增強作用呈現(xiàn)濃度依賴性,該結(jié)果與文獻[24]的研究結(jié)果相一致.

LID是一種典型的心臟鈉離子通道抑制劑,常被用來研究心肌細胞的電生理活動.如圖6(b)所示為不同物質(zhì)的量濃度LID作用前后心肌細胞電位傳感器記錄到的EFP信號.20μM的利多卡因(LID)大幅度抑制了心肌細胞的放電活動.如圖7(c)和(d)所示分別為ISO作用5min后EFP信號參數(shù)電位幅值和發(fā)放頻率的變化特征圖.如圖7(c)所示,10μMLID組的EFP信號的電位幅值與對照組相比有顯著性下降(p<0.01),20μMLID組的EFP信號的電位幅值與10μMLID組相比有顯著性下降(p>0.01).如圖7(d)所示,10μMLID組的EFP信號的發(fā)放頻率與對照組相比沒有差異(p<0.05),而20μMLID組的EFP信號的發(fā)放頻率與對照組相比有顯著性下降(p>0.01).以上結(jié)果表明：LID會抑制心肌細胞的放電活動,而且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性,該結(jié)果與文獻[8]的研究結(jié)果相一致.

圖7　藥物作用5 min后,心肌細胞電位傳感器的響應(yīng)特征圖(Mean±SD, n=6)Fig. 7　Response of cardiomyocyte-based potential biosensor to drugs under 5 min treatment (Mean±SD, n=6)

3討論

到目前為止,細胞和硅器件表面的耦合問題仍然是細胞傳感器研究中的一個重大難點.細胞和硅表面的耦合情況直接影響了細胞傳感器輸出信號的大小.經(jīng)驗證明,細胞和硅表面耦合不緊密會直接導(dǎo)致檢測到的信號幅度偏低,而難以進行有用信號的提取和分析,有時信號甚至?xí)谎蜎]在噪聲中.基于前人的研究,本文認(rèn)為影響細胞和硅表面耦合的因素,從根本上講分為2個方面：一方面為硅表面的親水性、電荷密度和粗糙程度；另一方面為細胞的培養(yǎng)密度.

本文研究了心肌細胞和MEA芯片表面的耦合情況.經(jīng)長期的實驗摸索,發(fā)現(xiàn)MEA表面的親水性和細胞培養(yǎng)密度是影響兩者耦合的關(guān)鍵因素.一方面,研究結(jié)果表明：在強親水性的MEA芯片表面,心肌細胞生長良好,細胞和芯片表面耦合緊密；而在親水性差的MEA表面,就算以高密度接種的心肌細胞也難以在芯片上附著生長.這一現(xiàn)象和細胞膜的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān).動物細胞表面有一層薄膜結(jié)構(gòu),稱為細胞(質(zhì))膜,其疏水端朝向細胞質(zhì),親水端朝向細胞外液,因此,原代貼壁細胞只有在強親水性的基底上才能生長良好.基于細胞膜的這一特性,提高硅表面的親水性是改善細胞和硅表面耦合的一種有效而簡便的方法.另一方面,研究結(jié)果表明：在保證MEA表面強親水性的情況下,合適的細胞密度可使心肌細胞在MEA上快速生長分化,形成一片均勻分布、高度融合、同步搏動的單細胞層.此時的細胞層與MEA形成高度緊密的耦合,在顯微鏡下觀察可見每一個微電極表面均有數(shù)量相近的心肌細胞附著.在此情況下,MEA所檢測到的EFP信號幅度高且一致性良好,幾乎每一個通道都能記錄到信號,而且各個通道記錄到的信號之間的差異均小于40μV.由于細胞密度過低,心肌細胞在MEA上生長緩慢,細胞與細胞之間難以形成良好的細胞鏈接,使得相鄰細胞之間的電興奮傳播受到抑制,只有少數(shù)的通道能記錄到EFP信號,而且信號之間的差異較大.同樣地,細胞密度過高,在細胞培養(yǎng)的成熟期,部分心肌細胞會因營養(yǎng)耗竭和細胞接觸性抑制而提前死亡,細胞死亡過程中會分泌大量的有毒物質(zhì)而影響其他細胞的放電活動,從而導(dǎo)致EFP信號幅度快速下降,而且部分電極會因死細胞的附著而無法記錄到信號.因此,優(yōu)化細胞密度是加強細胞和硅表面耦合的重要手段.

4結(jié)語

本文通過提高MEA表面親水性和優(yōu)化細胞密度,促使心肌細胞和MEA形成高度緊密的耦合,并成功構(gòu)建了一種高度穩(wěn)定性和重復(fù)性的心肌細胞電位傳感器.該傳感器可以長時程實時記錄心肌細胞的放電活動,穩(wěn)定輸出一致性良好的高幅度EFP信號.性能測試結(jié)果表明：該心肌細胞電位傳感器對測試藥物做出了快速而靈敏的響應(yīng),有望成為藥物檢測和分析的有效平臺.

參考文獻(References)：

[1]REDFERNW,CARLSSONL,DAVISA.etal.Relationshipsbetweenpreclinicalcardiacelectrophysiology,clinicalQTintervalprolongationandtorsadedepointesforabroadrangeofdrugs:evidenceforaprovisionalsafetymarginindrugdevelopment[J].CardiovascularResearch, 2003, 58(1): 32-45.

[2]LAVERTYH,BENSONC,CARTWRIGHTE,etal.Howcanweimproveourunderstandingofcardiovascularsafetyliabilitiestodevelopsafermedicines[J].BritishJournalofPharmacology, 2011, 163(4): 675-693.

[3]BOWESJ,BROWNAJ,HAMONJ,etal.Reducingsafety-relateddrugattrition:theuseofinvitropharmacologicalprofiling[J].NatureReviewsDrugDiscovery, 2012, 11(12): 909-922.

[4]LEXCHINJ.DrugwithdrawalsfromtheCanadianmarketforsafetyreasons, 1963-2004 [J].CanadianMedicalAssociationJournal, 2005, 172(6): 765-767.

[5]MOSSAJ,KASSRS.LongQTsyndrome:fromchannelstocardiacarrhythmias[J].JournalofClinicalInvestigation, 2005, 115(8): 2018-2024.

[6]BRAAMS.R,TERTOOLENL,VANDESTOLPEA,etal.Predictionofdrug-inducedcardiotoxicityusinghumanembryonicstemcell-derivedcardiomyocytes[J].StemCellResearch, 2010, 4(2): 107-116.

[7]GIORGIMA,BOLANOSR,GONZALEZCD,etal.QTintervalprolongation:preclinicalandclinicaltestingarrhythmogenesisindrugsandregulatoryimplications[J].CurrentDrugSafety, 2010, 5(1): 54-57.

[8]NATARAJANA,STANCESCUM,DHIRV,etal.Patternedcardiomyocytesonmicroelectrodearraysasafunctional,highinformationcontentdrugscreeningplatform[J].Biomaterials, 2011, 32(18): 4267-4274.

[9]HANCOXJC,MCPATEMJ,ELHARCHIA.ThehERGpotassiumchannelandhERGscreeningfordrug-inducedtorsadesdepointes[J].PharmacologyandTherapeutics, 2008, 119(2): 118-132.

[10]HANSENA,EDERA,B?NSTRUPM,etal.Developmentofadrugscreeningplatformbasedonengineeredhearttissue[J].CirculationResearch, 2010, 107(1): 35-44.

[11]CHIKR.Revolutiondawningincardiotoxicitytesting[J].NatureReviewsDrugDiscovery, 2013, 12(8):565-567.

[12]ABASSIYA,XIB,LIN,etal.Dynamicmonitoringofbeatingperiodicityofstemcell‐derivedcardiomyocytesasapredictivetoolforpreclinicalsafetyassessment[J].BritishJournalofPharmacology, 2012,165(5): 1424-1441.

[13]MANDENIUSCF,STEELD,NOORF,etal.Cardiotoxicitytestingusingpluripotentstemcell-derivedhumancardiomyocytesandstate-of-the-artbioanalytics:areview[J].JournalofAppliedToxicology, 2011, 31(3): 191-205.

[14]FERMINIB,FOSSAAA.Theimpactofdrug-inducedQTintervalprolongationondrugdiscoveryanddevelopment[J].NatureReviewsDrugDiscovery, 2003, 2(6): 439-447.

[15]XIAOL,HUZ,ZHANGW,etal.Evaluationofdoxorubicintoxicityoncardiomyocytesusingadualfunctionalextracellularbiochip[J].BiosensorsandBioelectronics, 2010, 26(4): 1493-1499.

[16]MEYERT,KRAUSHAARU,GUENTHERE.MicroelectrodeArray(MEA)highresolutionelectrophysiologicalmappingofcardiaccell,tissueandorganpreparations[C] ∥ 2009WorldCongressonMedicalPhysicsandBiomedicalEngineering.Munich:IFMBE, 2009: 112-115.

[17]XUB,JACQUIRS,LAURENTG,etal.Phasespacereconstructionofanexperimentalmodelofcardiacfieldpotentialinnormalandarrhythmicconditions[C]∥2013AnnualInternationalConferenceoftheIEEE.Osaka:IEEE, 2013: 3274-3277.

[18]KORNBLUMA,PILLEKAMPF,MATZKIESM,etal.Anewmodeltoperformelectrophysiologicalstudiesintheearlyembryonicmouseheart[J].CellularPhysiologyandBiochemistry, 2013, 32(1): 1-10.

[19]JOHNSTONEAF,GROSSGW,WEISSDG,etal.Microelectrodearrays:aphysiologicallybasedneurotoxicitytestingplatformforthe21stcentury[J].Neurotoxicology, 2010, 31(4): 331-350.

[20]CASPIO,ITZHAKII,KEHATI,etal.Invitroelectrophysiologicaldrugtestingusinghumanembryonicstemcellderivedcardiomyocytes[J].StemCellsandDevelopment, 2009, 18(1): 161-172.

[21] 徐瑩,余輝,張威,等.基于MEMS技術(shù)的微電極陣列細胞傳感器 [J].自然科學(xué)進展, 2007, 17(9): 1265-1272.XUYin,YUHui,ZHANGWei,etal.MicroelectrodearraycellsensorbasedonMEMStechnology[J].ProcessinNaturalScience, 2007, 17(9): 1265-1272.

[22]KANEKOT,NOMURAF,HATTORIA,etal.Improvementofelectricalstimulationprotocolforsimultaneousmeasurementofextracellularpotentialwithon-chipmulti-electrodearraysystem[J].JapaneseJournalofAppliedPhysics, 2012, 51(6S): 06FK02.

[23]GUOL,ABRAMSRM,BABIARZJE,etal.Estimatingtheriskofdrug-inducedproarrhythmiausinghumaninducedpluripotentstemcell-derivedcardiomyocytes[J].ToxicologicalSciences, 2011, 123(1): 281-289.

[24]ZOUY,YAOA,ZHUW,etal.Isoproterenolactivatesextracellularsignal-regulatedproteinkinasesincardiomyocytesthroughcalcineurin[J].Circulation, 2001, 104(1): 102-108.

收稿日期：2014-11-20.

基金項目：國家海洋公益資助項目(201305010).

作者簡介：王琴(1988—),女,博士生,從事細胞傳感器研究. ORCID: 0000-0002-9944-5493. E-mail: cnqwang@zju.edu.cn 通信聯(lián)系人：王平,男,教授.ORCID: 0000-0001-6474-2722.E-mail: cnpwang@zju.edu.cn

DOI:10.3785/j.issn.1008-973X.2016.06.028

中圖分類號：R 318

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-973X(2016)06-1214-07

Optimizationdesignanddruganalysisofcardiomyocyte-basedbiosensor

WANGQin,FANGJia-ru,CAODuan-xi,ZHOUJie,SUKai-qi,LIHong-bo,WANGPing

(Biosensor National Special Laboratory, Key Laboratory of Biomedical Engineering of Ministry of Education,College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

Abstract:The coupling property between cardiomyocytes and microelectrode array (MEA) was studied from two aspects, including MEA surface hydrophilicity and cell culture density, in order to build a cardiomyocyte-based potential biosensor of high stability and high consistency. MEA surface hydrophilicity was improved by high molecular protein (gelatin) modification, and the characteristics of extracellular field potential (EFP) signals of cardiomyocyte-based potential biosensor under different cell densities were emphatically analyzed. Results show that the high-closely coupling between cardiomyocytes and MEA is formed after cardiomyocytes seeded on the MEA with gelatin modification at the proper cell density of 1.2×105 cells/cm2. Under the optimal conditions, the cardiomyocyte-based potential biosensor presents high-stable and high-consistent EFP signals, the spike amplitude (SA) reaches about 1.2 mV, and the firing rate (FR) reaches about 180 beats/min, which continues for 3-4 days. Two typical tool drugs, isoprotenol (ISO) and lidocaine (LID) were applied to test the analytical performance of the optimized cardiomyocyte-based potential biosensor. Results show that SA and FR markedly increase after the treatment of 20 μM ISO for 5 min and significantly decrease after the treatment of 20 μM LID for 5 min. This biosensor performed rapid and sensitive response to these two drugs and will provide a promising platform for drug detection and analysis.

Key words:microelectrodes array; cardiomyocytes; cell-based biosensor; extracellular field potential (EFP) signal