利拉魯肽對2型糖尿病大鼠降血壓、利水鹽的作用機制探討

王少清，毛楠，周萍，汪力△，高芳，衛(wèi)怡勛，樊均明，付平

利拉魯肽對2型糖尿病大鼠降血壓、利水鹽的作用機制探討

王少清1，毛楠1，周萍1，汪力1△，高芳1，衛(wèi)怡勛1，樊均明2，付平3

摘要：目的通過觀察胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物利拉魯肽對2型糖尿病大鼠腎臟內髓一氧化氮合酶（NOS）、環(huán)加氧酶2（COX2）表達的影響，探討利拉魯肽降血壓和利水鹽的作用機制。方法30只雄性SD大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由攝水，8周后空腹注射鏈脲佐菌素（STZ），成功建立2型糖尿病大鼠模型18只，選取12只隨機分為利拉魯肽處理2型糖尿病模型（DMT）組和2型糖尿病模型（DM）組，另取12只正常大鼠隨機分為利拉魯肽處理野生型大鼠（WTT）組和野生型大鼠對照（WT）組，每組6只。DMT和WTT組每天予以利拉魯肽（200 μg/kg體質量）皮下注射，DM和WT組每天予以等量生理鹽水皮下注射，各組分別在給藥后0、2、4、6周檢測血糖和血壓，給藥后6周收集尿液檢測K、Na、Cl離子濃度，然后處死大鼠，收集血液檢測血K、Na、Cl離子濃度，取腎組織通過Real-time PCR和Western blot檢測腎臟內髓NOS和COX2的mRNA和蛋白表達水平。結果利拉魯肽干預后，DMT組大鼠血糖（F=5.933，P<0.05）及血壓（F=22.070，P<0.05）隨時間變化逐漸降低。在干預6周后，DMT組大鼠血糖（mmol/ L：12.78±3.82 vs.18.75±1.68）和血壓（mmHg：119.98±4.43 vs.136.42±4.48）較DM組均明顯降低（P<0.05），血液中K、Na、Cl離子濃度與DM組相比無明顯差異，但尿液中K（mmol/L：46.55±6.43 vs.33.13±9.71）、Na（mmol/L：56.33±8.83 vs.41.20±7.25）、Cl（mmol/L：159.81±25.06 vs.71.44±12.99）離子濃度高于DM組大鼠（P<0.05），且腎臟內髓NOS、COX2的mRNA和蛋白表達均高于DM組大鼠（P<0.05）。結論利拉魯肽可能通過NOS誘導COX2的表達增強，發(fā)揮利水鹽、降血壓的作用。

關鍵詞：胰高血糖素樣肽-1；利拉魯肽；腎臟內髓；糖尿病，2型；一氧化氮合酶；環(huán)加氧酶2

基金項目：四川省教育廳2013年科研資助重點項目（13ZA0213）；四川省衛(wèi)生廳2013年科研資助項目（130386）；成都醫(yī)學院駝鳥計劃2012年專項基金資助項目（CYX12-024）；2014校級大學生創(chuàng)新實驗計劃項目（CXXS201422）

作者單位：1成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎病科（郵編610500）；2西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院腎臟內科；3四川大學華西醫(yī)院腎臟內科

作者簡介：王少清（1976），男，副主任醫(yī)師，副教授，博士，主要從事慢性病腎損害機制及干預研究

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通訊作者E-mail：93331524@qq.com

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）由胃腸道內的L細胞分泌，是一種重要的腸促胰島素，其類似物是目前臨床上治療2型糖尿病的一類新藥。研究證實，GLP-1除了具有降血糖、降體質量的作用外，還具有降脂、降血壓和調節(jié)水鹽代謝等心腎保護功能［1-3］，但具體作用機制尚不明確。多項研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1擴張血管的作用與一氧化氮（NO）有關［4-6］。腎臟內髓作為腎臟重要的功能區(qū)域，其間質壓力可調節(jié)腎小管水、鈉重吸收，是腎臟產生壓力性利尿的基礎，也是參與系統(tǒng)血壓調節(jié)的重要機制［7］。腎臟內髓的環(huán)加氧酶2（COX2）與水鹽代謝和血壓調節(jié)有關，NO參與了其調節(jié)過程［8-10］。因此，筆者推測GLP-1可能通過一氧化氮合酶（NOS）而誘導COX2表達，發(fā)揮調節(jié)水鹽和降血壓的作用。本實驗通過檢測GLP-1類似物利拉魯肽對2型糖尿病大鼠腎臟內髓NOS和COX2表達的影響，探討利拉魯肽調節(jié)2型糖尿病大鼠腎臟水鹽和降血壓的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料及儀器清潔級雄性SD大鼠50只，體質量（230±20）g，購于成都達碩生物科技有限公司，自由攝食攝水，除實驗應激外無其他不良刺激。高糖高脂飼料（10%豬油，20%糖，10%蛋白粉，1%膽固醇，59%基礎飼料）由重慶騰鑫生物科技有限公司生產。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma；利拉魯肽，丹麥諾和諾德公司；NOS和COX2抗體，Bioworld公司。無創(chuàng)尾動脈血壓測量系統(tǒng)購于安徽正華生物儀器設備有限公司。

1.2方法

1.2.12型糖尿病大鼠模型的建立30只大鼠適應性飼養(yǎng)1周，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由攝水。8周后，空腹注射STZ（溶于0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液，pH 4.4，注射劑量：35 mg/kg），5 d后檢測空腹血糖，共18只大鼠血糖值≥16.7 mmol/L，確定2型糖尿病大鼠造模成功。

1.2.2動物分組及藥物處理取12只2型糖尿病大鼠，隨機分為2組：利拉魯肽處理2型糖尿病模型（DMT）組和2型糖尿病模型（DM）組，另取正常大鼠12只，隨機分為利拉魯肽處理野生型大鼠（WTT）組和野生型對照（WT）組，每組6只。DMT組和WTT組每天皮下注射利拉魯肽（200 μg/kg），DM組和WT組每天皮下注射等量生理鹽水。

1.2.3數(shù)據與標本采集藥物處理的0、2、4、6周，分別測量各組大鼠的血糖和血壓。第6周時采集24 h尿液樣本后處死大鼠，并取血液及腎臟組織標本，血液和尿液樣本用日立7170A全自動生化分析儀檢測K、Na、Cl離子濃度，腎組織標本凍存于液氮中以備后續(xù)試驗。

1.2.4大鼠血糖及血壓檢測血糖檢測：采用強生全自動血糖儀檢測。血壓檢測：將大鼠置于固定器內5 min，同時加熱大鼠尾部，待其安靜后將感應器放入加壓氣囊內并套在大鼠尾巴接近尾根的1/3處，并調整感應器位置直至獲得穩(wěn)定清晰的脈搏圖像，向加壓氣囊內施加壓力，觀察并記錄加壓后出現(xiàn)的第1個波峰所處的血壓值。

1.2.5Real-time PCR檢測NOS和COX2的mRNA水平引物由上海生物工程有限公司合成。NOS引物序列：上游5′-GACCGATTACACGACATTGAG-3′，下游5′-TCTTAGGGCT?GCCAGGAT-3′，產物大小178 bp；COX2引物序列：上游5′-ACGGACTTGCTCACTTTG-3′，下游 5′-AGCGTTTGCGG?TACTCAT-3′，產物大小159 bp；內參GAPDH引物序列：上游5′-TCCCTCAAGATrGTCAGCAA-3′，下游5′-AGATCCA?CAACCGGATACATF-3′，產物大小308 bp。按照標準方法提取總mRNA，實施逆轉錄，并進行Real-time PCR反應和熔解曲線分析，計算NOS和COX2的mRNA水平。

1.2.6Western blot檢測NOS和COX2的蛋白表達水平取大鼠腎臟髓質加入RIPA裂解液，4℃下勻漿提取總蛋白，BCA法測濃度，每孔蛋白上樣總量為20 μg，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后濕轉印至PVDF膜上，Gel-Pro analyzer 4.0軟件對得到的圖像進行條帶灰度分析，計算目的蛋白NOS、COX2與內參GAPDH的灰度比值。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0進行數(shù)據的統(tǒng)計分析，計量數(shù)據以±s表示，行方差齊性檢驗及重復測量資料F檢驗，進一步兩兩比較用SNK-q法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1利拉魯肽處理對血糖及血壓的影響DMT組在給予利拉魯肽處理0～6周時，血糖逐漸下降（F= 5.933，P<0.05），處理6周后的血糖明顯低于0周（P<0.05）；而DM、WTT和WT組的血糖沒有隨時間變化而發(fā)生明顯變化（F分別為2.969、0.880、1.963，P>0.05）。相同時間點不同組間的血糖比較，6周時，4組的血糖差異明顯（F=28.143，P< 0.05），其中DM組高于其他3組（P<0.05），見圖1。血壓的變化趨勢與血糖基本一致，即利拉魯肽處理DMT組0～6周時，血壓出現(xiàn)逐漸下降（F=22.070，P<0.05），處理4周和6周后的血壓明顯低于0周（P<0.05）；而DM、WTT和WT組則在處理0～6周時，各時間點間的差異不明顯（F分別為2.934、0.358、0.370，P>0.05）。相同時間點不同組間的血壓比較，6周時，4組的血壓差異明顯（F=39.252，P< 0.05），其中DM組高于其他3組（P<0.05），見圖2。

a與DMT組0周時比較，b與DM組6周時比較，P<0.05Fig.1　Changes of blood glucose levels after treating with liraglutide for 0-6 weeks圖1　利拉魯肽處理不同時間后對血糖的影響

a與DMT組0周時比較，b與 DM組 6周時比較，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPaFig.2　Changes of blood pressure levels after treating with liraglutide for 0-6 weeks圖2　利拉魯肽處理不同時間后對血壓的影響

2.2利拉魯肽處理后對血液和尿液離子濃度的影響各組血液中的K、Na、Cl離子濃度并差異無統(tǒng)計學意義（F分別為1.786、3.609、2.113，P>0.05），見圖3；而尿液中的K、Na、Cl離子濃度差異有統(tǒng)計學意義（F分別為 19.323、31.561、158.174，P< 0.05），DMT組高于DM組（P<0.05），其他3組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖4。

2.3利拉魯肽處理后對NOS和COX2 mRNA表達變化利拉魯肽處理6周后，各組大鼠腎臟內髓NOS和COX2的mRNA水平差異均有統(tǒng)計學意義（F分別為128.659、255.644，P<0.05），其中DMT組高于DM組（P<0.05），其他3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

Fig.3　Changes of the blood concentrations of ion after treating with liraglutide for 6 weeks圖3　利拉魯肽處理6周后對血液離子濃度的影響

a與DM組比較，P<0.05Fig.4　Changes of the urine concentrations of ion after treating with liraglutide for 6 weeks圖4　利拉魯肽處理6周后對尿液離子濃度的影響

a與DM組比較，P<0.05Fig.5　Changes of the mRNA expressions of NOS and COS2 after treating with liraglutide for 6 weeks圖5 利拉魯肽處理6周后NOS和COX2的mRNA表達情況

2.4利拉魯肽處理后NOS和COX2的蛋白表達變化利拉魯肽處理6周后，各組NOS和COX2蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F分別為71.587、153.176，P<0.05），DM組NOS表達量明顯低于其他3組（P<0.05），DM組COX2表達量明顯低于DMT和WTT組（P<0.05），但與WT組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖6。

3　討論

GLP-1降血壓和調節(jié)水鹽代謝的機制目前仍不明確。有報道表明，GLP-1通過G蛋白偶聯(lián)受體GLP-1受體（GLP-1R）發(fā)揮功效，如在2型糖尿病和冠狀動脈疾病的患者中，激活GLP-1R會使冠狀動脈舒張，同時GLP-1R拮抗劑能完全拮抗GLP-1的作用［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)嚙齒類動物中GLP-1呈時間依賴性和劑量依賴性擴張肺動脈，是因為內皮系統(tǒng)合成NO的緣故［5］，且GLP-1通過NO/cGMP通路發(fā)揮擴血管作用，并不依賴于相應的GLP-1R［6］。值得注意的是，鹽負荷時腎臟內髓NOS的表達增高［8］，且誘導腎臟內髓COX2的表達，NOS阻滯劑則抑制COX2的表達［9］。給予高鹽飲食后，其腎臟內髓COX2表達顯著升高［10］，而在腎臟內髓注射COX2抑制劑后，接受高鹽飲食的大鼠血壓升高［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可能通過調節(jié)NOS，誘導COX2表達來發(fā)揮調節(jié)水鹽和降血壓的作用。本研究使用利拉魯肽對2型糖尿病大鼠進行干預，結果顯示利拉魯肽具有明顯的降血糖和降血壓作用，尤其是尿液中的K、Na、Cl離子濃度均顯著高于DM組，而血液中的K、Na、Cl離子濃度并無明顯差異，提示利拉魯肽可能促進了2型糖尿病大鼠腎臟的水鹽代謝，調節(jié)了由于高血糖導致的滲透壓升高，起到對腎臟的保護作用。筆者先前的研究還發(fā)現(xiàn)GLP-1可降低糖尿病伴高血壓患者的血壓和血壓變異性，尤其是白晝收縮壓、24 h收縮壓變異性、白晝收縮壓變異性等指標［3］。GLP-1通過增加大鼠尿鈉等離子排泄，減輕體內鈉潴留以降低血壓，這一機制或許也是GLP-1降低血壓變異性的生理基礎。

正常腎臟中COX2主要表達在腎臟髓質間質細胞（renal medullary interstitial cells，RMICs）中，少部分表達于皮質致密斑［12］。RMICs沿著髓質血管和腎小管構成特殊的梯度結構，并與直小血管和腎小管的基底膜相毗鄰，通過旁分泌作用產生某些介質直接影響髓質血流量和腎小管轉運功能，進而調節(jié)腎小管水、鈉重吸收［7］。因此，位于RMICs中的COX2極有可能催化產生某些前列腺素，通過旁分泌作用影響髓質血流量和腎小管轉運，進而參與水鹽代謝和血壓的調節(jié)。如前所述，COX2在腎臟內髓的表達與NOS誘導調控有關。NO是一種重要的血管擴張因子，由3種類型的NO合成酶合成：內皮型NOS （eNOS），神經型NOS（nNOS）和誘導NOS（iNOS）。有研究報道，GLP-1通過NO發(fā)揮血管擴張功能［5］。因此，筆者推測NOS通過誘導髓內COX2表達，促進水鈉排泄而降低腎臟內髓滲透壓，以發(fā)揮保護腎臟的作用。本實驗中利DMT組中NOS和COX2的表達均明顯高于DM組，提示糖尿病患者長期血糖濃度升高，腎臟內髓滲透壓隨之升高，腎臟NOS和COX2表達降低，使用GLP-1類似物利拉魯肽可有效提高內髓NOS和COX2的表達，加強腎臟利水鈉作用。

綜上所述，GLP-1類似物利拉魯肽可能通過促進2型糖尿病大鼠腎臟內髓NOS和COX2的表達來調節(jié)滲透壓，進而產生降壓和利水鹽作用，今后的研究有必要對其進一步的分子機制深入探討，為GLP-1類似物的臨床應用提供理論依據。

A：Western blot結果；B：蛋白相對定量；a與DM組比較，P<0.05Fig.6　Changes of the protein expressions of NOS and COS2 after treating with liraglutide for 6 weeks圖6　利拉魯肽處理6周后NOS和COX2的蛋白表達情況

參考文獻

［1］Ussher JR，Drucker DJ.Cardiovascular biology of the incretin system ［J］.Endocr Rev，2012，33（2）：187-215.doi：10.1210/er.2011-1052.

［2］Phillips LK，Prins JB.Update on incretin hormones［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1243：E55-74.doi：10.1111/j.1749-6632.2012.06491.x.

［3］Wang SQ，Zang L，Wang L，et al.Effects of glucagon peptide-1 on blood pressure variability in diabetic hypertensive patients［J］.Tianjin Med J，2014，42（8）：790-792.［王少清，臧麗，汪力，等.胰高血糖素肽1對糖尿病伴高血壓患者血壓變異性的影響［J］.天津醫(yī)藥，2014，42 （8）：790-792］.doi：10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.015.

［4］Nystrom T，Gonon AT，Sjoholm A，et al.Glucagon-like peptide-1 relaxes rat conduit arteries via an endothelium-independent mechanism［J］.Regul Pept，2005，125（1/3）：173-177.

［5］Golpon H.Effect of GLP-1 and amylin on lung circulation，the bronchial system and systemic circulation in isolated ex vivo organ cultures of the rat［J］.Pneumologie，1998，52（8）：439.

［6］Ban K，Noyan-Ashraf MH，Hoefer J，et al.Cardioprotective and vasodilatory actions of glucagon-like peptide 1 receptor are mediated through both glucagon-like peptide 1 receptor-dependent and-independent pathways［J］.Circulation，2008，117（18）：2340-2350.doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.107.739938.

［7］Pallone TL，Silldorff EP.Pericyte regulation of renal medullary blood flow［J］.Exp Nephrol，2001，9（3）：165-170.

［8］Ni Z，Vaziri ND.Effect of salt loading on nitric oxide synthase expression in normotensive rats［J］.AmJ Hypertens，2001，14（2）：155-163.

［9］Cheng HF，Wang JL，Zhang MZ，et al.Nitric oxide regulates renal cortical cyclooxygenase-2 expression［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2000，279（1）：F122-129.

［10］Yang T，Singh I，Pham H，et al.Regulation of cyclooxygenase expression in the kidney by dietary salt intake［J］.Am J Physiol，1998，274（3 Pt 2）：F481-489.

［11］Zewde T，Mattson DL.Inhibition of cyclooxygenase-2 in the rat renalmedullaleadstosodium-sensitivehypertension［J］. Hypertension，2004，44（4）：424-428.

［12］ Guan Y，Chang M，Cho W，et al.Cloning，expression，and regulation of rabbit cyclooxygenase-2 in renal medullary interstitial cells［J］.Am J Physiol，1997，273（1 Pt 2）：F18-26.

（2015-10-22收稿2016-02-05修回）

（本文編輯閆娟）

中圖分類號：R587.1

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150245

Liraglutide promotes the reduction of blood pressure and drives the water and salt through in renal medulla of type 2 diabetes rats

WANG Shaoqing1,MAO Nan1,ZHOU Ping1,WANG Li1△,GAO Fang1,WEI Yixun1,FAN Junming2,FU Ping3
1 Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China；
2 Department of Nephrology,the Affiliated Traditional Medicine Hospital of Southwest Medical University；
3 Department of Nephrology,West China Hospital,Sichuan University
△Corresponding AuthorE-mail:93331524@qq.com

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of glucagon like peptide-1(GLP-1)analogues liraglutide on expressions of nitric oxide synthase(NOS)and cyclo-oxygen-ase(COX)2 in renal medulla of type 2 diabetes rats,and the mechanism of its lowering blood pressure and promoting excretion of water and salt in kidney.MethodsType 2 diabetes model rats were generated by high-fat and high-sugar feeding for 8 weeks followed by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ).Subse?quently,eighteen type 2 diabetes rats were divided into two groups:liraglutide treatment group(DMT)and diabetes group (DM).Twelve normal rats were divided into two groups:liraglutide treatment wild type group(WTT)and wild type group (WT).DMT and WTT groups were given liraglutide(200 μg/kg)by subcutaneous injection,DM and WT groups were given equivalent normal saline by the same way.The levels of blood glucose and blood pressure were detected at 0,2,4 and 6 weeks after treatment in groups of rats.Samples of urine were collected for detecting ion concentrations(K+,Na+and Cl-)af?ter treatment for six weeks.Rats were sacrificed and blood samples were collected for detecting ion concentrations(K+,Na+and Cl-).The expression levels of NOS and COX2 mRNA and protein in renal medulla were detected by real-time PCR and Western blot assay.ResultsAfter treating with liraglutide,the values of blood glucose(F=5.933,P<0.05)and blood pres?sure(F=22.070,P<0.05)were gradually decreased in DMT group.After treatment with liraglutide for 6 weeks,the values of blood glucose(mmol/L:12.78±3.82 vs.18.75±1.68)and blood pressure(mmHg:119.98±4.43 vs.136.42±4.48)were signifi?cantly decreased(P<0.05)in DMT group than those of DM group(P<0.05).There were no significant differences in the concentrations of K+,Na+and Cl-between the two groups.There were higher levels of K+(mmol/L:46.55±6.43 vs.33.13± 9.71),Na+(mmol/L:56.33±8.83 vs.41.20±7.25)and Cl-(mmol/L:159.81±25.06 vs.71.44±12.99)in urine in DMT group than those of DM group(P<0.05).The mRNA levels and protein expressions of NOS and COX2 in renal medulla were significant?ly increased in DMT group than those of DM group(P<0.05).ConclusionGLP-1 analogues liraglutide may enhance the expression of COX2 by increasing the expression of NOS to excrete water and salt,and decrease blood pressure.

Key words：glucagon-like peptide-1;liraglutide;renal medulla;diabetes mellitus，type 2;nitric oxide synthase;cyclo?oxygenase 2