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    復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑的制備及質(zhì)量控制

    2016-07-28 11:10:08周愛(ài)媚方圓圓
    衛(wèi)生職業(yè)教育 2016年13期
    關(guān)鍵詞:卡波姆白鮮皮蒸餾水

    周愛(ài)媚,汪 妍,方圓圓,陳 菲

    (金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 金華 321007)

    復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑的制備及質(zhì)量控制

    周愛(ài)媚,汪 妍*,方圓圓,陳 菲

    (金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 金華 321007)

    目的 制備復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑,并用高效液相(HPLC)法測(cè)定復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑中白鮮堿的含量。方法 以白鮮堿為指標(biāo)成分控制含量,用閃式提取法提取白鮮皮和苦參混合物濃縮液,確定了以1.0%卡波姆-940、1.0%冰片、10%甘油、5%乙醇、0.2%聚山梨酯80、0.1%羥苯乙酯、1.35%三乙醇胺為處方組成,通過(guò)外觀和穩(wěn)定性觀察實(shí)驗(yàn)確定復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑制備工藝。結(jié)果 凝膠劑外觀性狀為淡黃色晶瑩透明狀膠體,氣微清香;pH值約為6.7;穩(wěn)定性試驗(yàn)表明本品各指標(biāo)均無(wú)明顯改變,皮膚刺激性試驗(yàn)表明本品對(duì)皮膚無(wú)明顯刺激,手足癬主要致病真菌的抑菌試驗(yàn)表明該制劑對(duì)皮膚表面自然菌的除菌率為71.8%。結(jié)論 本制備方法簡(jiǎn)便可行,分析方法可用于控制白鮮皮抗菌凝膠劑中有效成分的含量。

    復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑;制備;質(zhì)量控制

    白鮮皮為蕓香科白鮮屬植物白鮮Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮,是一種常用中藥,為歷代本草及《中國(guó)藥典》收載。白鮮皮屬于多年生草本,根皮外表面呈淡灰黃色、內(nèi)表面類白色,肉質(zhì)脆,味微苦,寒。具有清熱燥濕、祛風(fēng)止癢、解毒之功效,臨床上用于治療濕熱瘡毒、濕風(fēng)疹、疥癬瘡癩、風(fēng)濕熱痹、神經(jīng)性皮炎等慢性頑固性皮膚病[1]等,并對(duì)心血管及血液病有一定療效,特別是對(duì)皮膚類疾病有很好的治療作用,如對(duì)皮膚瘙癢,濕熱瘡瘍,陰部腫痛等病癥都有一定的功效?;瘜W(xué)研究表明,其中的白鮮堿和梣酮是主要有效成分,具有顯著活性[2]。目前西醫(yī)臨床上主要用抗真菌軟膏類藥物來(lái)治療手足癬,但由于合成的抗真菌藥物不良反應(yīng)多,易產(chǎn)生耐藥性,還有一定的毒副作用,真菌感染治療仍然面臨許多挑戰(zhàn)[2]。鑒于中藥副作用小,來(lái)源廣,價(jià)格低廉,較少出現(xiàn)耐藥性,因此從天然藥物中尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌抗細(xì)菌成分已成為重要的研究方向[3]。因而本實(shí)驗(yàn)篩選出具有清熱祛濕、涼血解毒、殺蟲(chóng)止癢等功效的中藥白鮮皮和苦參作為復(fù)方藥材,以白鮮堿為指標(biāo)成分提取其濃縮液,并將復(fù)方白鮮皮濃縮液制備為凝膠劑[4]。本文經(jīng)過(guò)對(duì)復(fù)方白鮮皮進(jìn)行高效液相(HPLC)法含量控制,驗(yàn)證其有效成分的含量,從而促進(jìn)復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑的臨床應(yīng)用。

    1儀器與試藥

    1.1儀器

    閃式提取器(河南金鼎科技發(fā)展有限公司)、F1004型電子天平(上海天平儀器廠)、高速藥材粉碎機(jī)(浙江金華華盛實(shí)業(yè)有限公司)、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州恒德儀器制造有限公司)、BC-R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海盛玻儀器有限公司產(chǎn)品)、Waters2487高效液相色譜儀、2487紫外分光檢測(cè)器、Breeze色譜工作站、DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海和呈儀器制造有限公司)、LDZX-75KBS高壓滅菌器(上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)、凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、酸堿測(cè)試儀、研缽等。

    1.2試劑

    白鮮皮、苦參(購(gòu)自金華三溪堂國(guó)藥館)、甘油、卡波姆-940(青島美生源生物科技有限公司)、乙醇(深圳市天時(shí)化工有限公司)、聚山梨酯80(上海山浦化工有限公司)、三乙醇胺(上?;瘜W(xué)試劑有限公司)、稀鹽酸(無(wú)錫陽(yáng)山生化有限責(zé)任公司)、羥苯乙酯(上海山浦化工有限公司)、冰片(天津市化學(xué)試劑公司)、色譜級(jí)甲醇(北京京科瑞達(dá)有限公司)、去離子純化水等。金黃色葡萄球菌(Staphy lococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)由金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

    1.3對(duì)照品

    白鮮堿標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所)。

    2方法與結(jié)果

    2.1復(fù)方白鮮皮濃縮液制備

    將白鮮皮和苦參(3∶1)打碎磨粉后稱取40 g于閃式提取器中,以1∶10的料液比加入80%的乙醇溶液,提取電壓為60 V,提取時(shí)間為2 min,過(guò)濾,收集濾液,濃縮和真空冷凍干燥,用80%乙醇溶解并定容至200 mg.ml-1備用。取復(fù)方白鮮皮提取液200 ml(白鮮皮∶苦參=3∶1),用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,遺留殘?jiān)?0%乙醇液20 ml溶解,過(guò)濾,濾液用80%乙醇定容至20 ml,制成每1 ml含2 g藥材的溶液。

    2.2凝膠劑的制備

    2.2.1凝膠基質(zhì)處方基質(zhì)處方組成:卡波姆-940[5,6]1.0 g,甘油10 g,乙醇5 g,聚山梨酯80 0.2 g,羥苯乙酯0.1 g,三乙醇胺1.35 g,蒸餾水加至100 ml。

    制備方法:將卡波姆-940播撒入甘油表面,用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后,再加10 ml蒸餾水研磨細(xì)膩,加50 ml水,使之充分溶脹。將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于5 ml水后加入上液研磨,再將羥苯乙酯溶于乙醇逐漸加入攪勻,加蒸餾水至全量,攪拌均勻即得。

    結(jié)果觀察:呈膠凍狀,透明清亮細(xì)膩,光澤度好,長(zhǎng)時(shí)間放置穩(wěn)定。

    2.2.2復(fù)方白鮮皮凝膠劑制備(1)處方設(shè)計(jì):冰片[7]1.0 g,復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml,卡波姆-940 1.0 g,甘油10 g,乙醇5 g,聚山梨酯80 0.2 g,羥苯乙酯0.1 g,三乙醇胺1.35 g,蒸餾水加至100 g。

    (2)制備工藝的優(yōu)化。制備方法一:將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面,用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后,加入復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液;再加50 ml蒸餾水研磨細(xì)膩,使之充分溶脹;將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨,再加蒸餾水至全量,攪拌均勻即得。

    制備方法二:將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面,用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后,加10 ml蒸餾水使之充分溶脹;加入復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液,再加40 ml蒸餾水研磨細(xì)膩;將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨,再加蒸餾水至全量,攪拌均勻即得。

    制備方法三:將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面,用研磨法使其充分浸潤(rùn)完全后,再加50 ml蒸餾水研磨細(xì)膩,使之充分溶脹;將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨;加入復(fù)方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液,再加蒸餾水至全量,攪拌均勻即得。

    2.2.3結(jié)果考察(見(jiàn)表1)通過(guò)對(duì)3個(gè)成品進(jìn)行外觀性狀觀察和長(zhǎng)時(shí)間放置穩(wěn)定性觀察兩個(gè)指標(biāo)確定制備方法的優(yōu)劣,經(jīng)過(guò)綜合評(píng)價(jià),制備方法二被篩選為實(shí)驗(yàn)最佳制備方法。

    表1 各制備方法考察結(jié)果

    2.3凝膠劑含量測(cè)定

    2.3.1色譜條件色譜條件:以Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱;以甲醇—水(V/V=70∶30)為流動(dòng)相;流速:0.5 ml/min;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm;靈敏度:0.5AUFS;進(jìn)樣量:20 μl。理論塔板數(shù)以白鮮堿計(jì)不低于5 000。

    2.3.2供試品溶液的制備 取凝膠劑樣品5 g,精密稱定,置于50 ml錐形瓶中,加流動(dòng)相(甲醇∶水=70∶30)約15 ml,超聲20 min,放置至室溫,轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度。搖勻,離心10 min,取其上清液過(guò)0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

    2.3.3對(duì)照品溶液的制備 稱取白鮮堿標(biāo)準(zhǔn)品適量,置于100 ml容量瓶中,加流動(dòng)相溶解并定容至刻度,搖勻,即得0.664 mg/ml的白鮮堿對(duì)照品溶液。

    2.3.4測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,即得。

    2.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取白鮮堿對(duì)照品用流動(dòng)相依次稀釋定容,配制成1.05、4.2、8.4、16.8、33.2、66.4 μg·ml-1系列濃度,分別進(jìn)樣,以白鮮堿對(duì)照品質(zhì)量濃度X對(duì)白鮮堿色譜峰面積Y做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程分別為:y=740 444.85x+ 2 265 470.91,r2=0.999 3(n=6)。即呈良好線性關(guān)系。

    2.3.6精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20 μl,注入高效液相色譜儀,連續(xù)測(cè)定5次,記錄峰面積積分值,并以峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果表明,該儀器精密度良好,可靠性強(qiáng)。

    2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑供試品溶液20 ul,按照上述色譜條件分別于0、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,并以峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果表明,供試品溶液在24 h基本穩(wěn)定,RSD值為2.54%。

    2.3.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μl,依法測(cè)定,重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果表明5批樣品的白鮮堿含量平均為8.8 μg/g,RSD為1.57%。

    2.3.9回收率試驗(yàn) 精密稱取復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑3批次樣品各1份,每份分別加入白鮮堿對(duì)照品溶液適量,制備成高、中、低3個(gè)濃度各3份,計(jì)算每個(gè)濃度的平均加樣回收率,平均回收率103.85%,RSD=2.24%(n=3),說(shuō)明方法回收率良好。

    2.3.10樣品含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液20 μl,進(jìn)樣測(cè)定,3批樣品中白鮮堿的平均含量為8.75 μg/g,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 各批號(hào)樣品含量測(cè)定結(jié)果(μg/g)

    2.4皮膚刺激性試驗(yàn)

    2.4.1方法 選用健康家兔4只,體重在4.0~5.0 kg之間,在給藥前24 h將兔背部脊柱兩側(cè)對(duì)稱脫毛(每側(cè)大約5 cm×5 cm)。以每只兔子左邊為試驗(yàn)組,右邊為對(duì)照組。每次在背脊右側(cè)涂空白凝膠劑0.3 g,背脊左側(cè)涂含藥凝膠劑0.3 g,每日重復(fù)給藥2次,連續(xù)給藥1周,觀察皮膚變化。

    2.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察比較對(duì)照組和試驗(yàn)組在給藥過(guò)程中及給藥1周內(nèi)的皮膚情況。結(jié)果表明基本無(wú)發(fā)生皮膚紅斑及水腫現(xiàn)象,說(shuō)明本制劑對(duì)皮膚基本無(wú)刺激。

    2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

    2.5.1離心試驗(yàn) 取凝膠劑樣品10 g,裝入離心試管中,以2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,結(jié)果凝膠劑未出現(xiàn)分層和沉淀現(xiàn)象。

    2.5.2耐熱試驗(yàn) 取凝膠劑樣品10 g,置于60℃恒溫水浴放置6 h,結(jié)果凝膠劑未出現(xiàn)分層和沉淀現(xiàn)象。

    2.5.3耐寒試驗(yàn) 取凝膠劑樣品10 g,置于-15℃冰箱放置24 h,結(jié)果凝膠劑未出現(xiàn)分層及凍結(jié)現(xiàn)象。

    2.6抑菌試驗(yàn)

    2.6.1懸液定量法 吸取樣品凝膠劑原液放入5.0 ml的滅菌試管中,20℃恒溫5 min。吸取試驗(yàn)菌液(濃度約為1×104~9×104cfU/ml)0.1 ml加入到凝膠劑樣品中,迅速混勻,并立即計(jì)時(shí),作用至30 min后,取試驗(yàn)菌與樣品混合液1 ml,加入到含5.0 ml經(jīng)滅菌的PBS試管中,充分混勻。置10 min后,吸取混勻后的樣液1 ml,置于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)樣液接種兩個(gè)滅菌平皿。用涼至40℃~45℃的培養(yǎng)基15 ml做傾注,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿,使其充分均勻,瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿,當(dāng)試驗(yàn)菌是金黃色葡萄球菌或綠膿桿菌時(shí),置37℃恒溫箱培養(yǎng)16~18 h;當(dāng)試驗(yàn)菌是紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌或犬小孢子菌時(shí),置26℃恒溫箱培養(yǎng)7天,做活菌菌落計(jì)數(shù);以PBS代替試驗(yàn)樣品,同時(shí)按以上步驟操作,作為對(duì)照樣品,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,求其平均值。

    抑菌率=(對(duì)照樣品平均菌落數(shù)—試驗(yàn)樣品平均菌落數(shù))÷對(duì)照樣品平均菌落數(shù)。

    懸液定量法結(jié)果表明:復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑對(duì)紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌率均在70%以上。

    根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),抑菌率大于50%的抑菌型制劑屬于B2級(jí)以上級(jí)。說(shuō)明復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑抑菌試驗(yàn)均達(dá)到了國(guó)家QBT2850-2005抑菌型制劑抑菌標(biāo)準(zhǔn)。

    2.6.2使用前后菌落數(shù)比較試驗(yàn)隨機(jī)選定40名足癬患者志愿受試者。采樣者用無(wú)菌棉拭子在含有10 ml無(wú)菌蒸餾水試管中浸濕,在左腳指屈面從指尖到指根往返涂擦2遍采樣,作為使用復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑前對(duì)照。用無(wú)菌棉拭子蘸取復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑對(duì)左腳指屈面從指尖到指根往返涂擦2遍進(jìn)行擦拭,作用5 min,用無(wú)菌棉拭子按上述方法進(jìn)行采樣,作為試驗(yàn)組樣本。對(duì)所有采樣標(biāo)本經(jīng)充分振蕩洗脫,取洗脫液進(jìn)行培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù),計(jì)算自然菌減少對(duì)數(shù)值。結(jié)果表明:使用前志愿受試者腳上平均菌落數(shù)為195 cfu/cm2,用復(fù)方白鮮皮抗菌凝膠劑后,腳上殘存的平均菌落數(shù)為55 cfu/cm2,說(shuō)明用該凝膠劑對(duì)皮膚表面自然菌的除菌率為71.8%。

    3小結(jié)

    (1)采用現(xiàn)代提取工藝80%乙醇閃式提取白鮮皮的抗菌成分,與傳統(tǒng)的水煎法相比,有提取完全、濃縮方便、藥液不易發(fā)霉等優(yōu)點(diǎn);與回流提取法相比,有提高提取效率、縮短提取時(shí)間、減少溶劑使用量等優(yōu)點(diǎn)。

    (2)本研究結(jié)合臨床和民間治療手足癬的經(jīng)驗(yàn),篩選出治療手足癬的中藥復(fù)方制劑。中藥白鮮皮多制成洗液或者乳劑進(jìn)行使用,而制成凝膠制劑的甚少。凝膠劑制備操作簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低。

    (3)目前市場(chǎng)上個(gè)人洗護(hù)產(chǎn)品很多,但據(jù)調(diào)查對(duì)手部和足部癬菌有一定治療作用的護(hù)理產(chǎn)品幾乎沒(méi)有。而本制劑能克服西藥產(chǎn)生耐藥性及有一定毒副作用的弊端,有較好的治療作用,且安全、方便,能滿足消費(fèi)者追求產(chǎn)品綠色化與安全的消費(fèi)心理,有產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益的前景。

    [1]郭靜,張毅.白鮮皮復(fù)方臨床集萃[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2005,23(3):513-514.

    [2]王紅萍.白鮮皮的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2006,23 (3):200-201.

    [3]張芳芳,張軍東,曹永兵,等.天然產(chǎn)物中抗真菌成分研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè)),2003,18(5):189.

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    [5]錢(qián)杰人.卡波姆凝膠劑及其應(yīng)用[J].中國(guó)藥業(yè),2003,12(6):77.

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    (*通訊作者:汪妍)

    R944.1+5

    B

    1671-1246(2016)13-0094-03

    注:本文系2015年浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2015R468001)

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